Методические указания
к практическим занятиям для студентов стоматологического факультета.
ЗАНЯТИЕ № 12 (практическое - 6 час.)
Темы:
1. Биохимические функции печени. Метаболизм порфирина: обмен желчных пигментов, биохимия желтух. Биотрансформация ксенобиотиков.
2. Мочеобразовательная функция почек. Физико-химические свойства и химический состав нормальной мочи. Патобиохимия почек. Патологические компоненты мочи.
Цель: Уметь определять содержание билирубина в сыворотке крови и применять знание об обмене хромопротеинов для объяснения механизма возникновения желтух Уметь выполнять тимолову пробу и качественную реакцию на индикан и использовать полученные результаты для оценки функционального состояния печени.
Уметь исследовать физико-химические свойства и химический состав мочи здорового человека, объяснить механизм образования мочи, определять патологические компоненты мочи и использовать полученные данные для диагностики болезней почек и нарушения обмена веществ в организме.
Профессиональная ориентация студентов: Печень является главным органом обезвреживания токсических веществ, в частности продуктов гниения белков (индола, скатола и др.), потому определение содержания индикана в моче является важным признаком детоксикационной функции печени и усиления гнилостных процессов в кишечнике. Билирубин относится к желчным пигментам, является токсичным веществом, обезвреживается в клетках печени. Нагромождение билирубина в крови выше 35 мкмоль/л приводит к откладыванию его в тканях, появлению желтухи. Потому определение содержания билирубина в сыворотке крови имеет важное значение для дифференциальной диагностики желтух.
Данные анализа мочи, соединенные с клиническими наблюдениями, помогают установить характер хода патологического процесса и имеют диагностическое значение. Клинический анализ мочи является обязательной составной частью общего обследования больного. При патологических состояниях, которые связаны с расстройством обмена веществ и нарушениям деятельности тех или других органов (почек, печени, сердца, пищеварительных органов), происходит изменение состава крови, что неминуемо влияет на состав мочи.
Методика выполнения практической работы: - 9.00-12.00 час.
Выполнение практической работы происходит согласно с “Методическими указаниями для студентов” с обязательным выводом в конце каждой работы.
I Биохимические функции печени. Метаболизм порфирина: обмен желчных пигментов, биохимия желтух. Биотрансформация ксенобиотиков.
Работа 1. Провести определение общего билирубина в сыворотке крови.
Принцип метода. Билирубин образует с диазореактивом соединение (азобилирубин) розового цвета. Интенсивность цвета пропорциональна концентрации билирубина и определяется колориметрически. Свободный (непрямой) билирубин нерастворимый, поэтому его предварительно переводят в растворимое состояние добавлением к сыворотке крови кофеинового реактива.
Ход работы
К 0,5 мл сыворотки крови добавляют 0, 25 мл смеси
диазореактива ( 10 мл диазореактива № 1 смешивают с 0,
3 мл диазореактива № 2) и 1, 75 мл кофеинового реактива. Перемешивают и
оставляют пробирку на 10 мин., после чего колориметрируют на ФЭКе при зелёном
светофильтре в кювете
Расчёт по формуле:
Сст´Эоп
Х= -------------, где:
Эоп
Х – концентрация билирубина в сыворотке крови (мкмоль/л);
Эоп и Эст – экстинкции опытной и стандартной проб.
Оценить полученный результат, исходя из того, что в норме концентрация общего билирубина в крови составляет 1, 7 – 20, 5 мкмоль/л. Увеличение в крови билирубина выше 35 мкмоль/л приводит к отложению его в тканях, появление желтухи. Однако для диагностики и дифференциации желтух необходимо определение соотношения свободного (непрямого) и связанного (прямого) билирубина. В норме их содержание соответственно составляет 1, 7 – 17, 1 мкмоль/л и 0, 86 – 4, 3 мкмоль/л.
Работа 2. Качественная реакция на индикан в моче (реакция Обермейера).
Принцип метода. При действии концентрированной НСl индикан гидролизует с образованием индола, который окисляется с помощью FeCl3 в индоксил и синее индиго.
Ход работы
К 4 мл мочи добавляют 0, 4 мл раствора ацетата свинца (CH3COOPb) для осаждения жёлчных пигментов, солей и др. веществ. Фильтруют, затем 1 -2 мл фильтрата смешивают с равным объёмом реактива Обермейера (раствор FeCl3 в концентрированной НСl), добавляют 0, 5 – 1 мл хлороформа и осторожно перемешивают. Наблюдают несколько минут. Если нижний хлороформный слой окрашивается в синий или красноватый цвет, реакция считается положительной. В норме реакция отрицательная.
Положительная реакция свидетельствует об усилении процессов гниения белков в организме, но обезвреживающая функция печени не нарушена.
Работа 3. Провести тимоловую пробу.
Принцип метода. Проба основана на определении степени помутнения смеси сыворотки крови с насыщенным раствором тимола в вероналовом буфере, что обусловлено его взаимодействием с крупнодисперсными белками сыворотки – гамма-глобулинами и липопротеинами низкой плотности. Проба становится положительной при уменьшении содержания альбумина и увеличением бета- и гамма-глобулинов.
Ход работы
В пробирку вносят 4, 8 мл тимолового реактива, добавляют 0,08 мл сыворотки крови, перемешивают, выдерживают 30 минут при комнатной температуре. Фотометрируют против тимолового реактива при длине волны 630-690 нм. Степень помутнения находят по калибровочному графику. Калибровочный график приготовлен в лаборатории кафедры. В норме тимоловая проба соответствует 0 – 5 ед. помутнения.
Повышение показателей (положительная проба, больше 5 ед.) отмечается при гепатитах, эндокардите. При механической желтухе, ревматизме проба отрицательная.
ІІ Мочеобразовательная функция почек. Физико-химические свойства и химический состав нормальной мочи. Патобиохимия почек. Патологические компоненты мочи.
Работа 4. Определить физико-химические свойства мочи.
а) Определение рН мочи.
Реакцию мочи определяют с помощью индикаторов – синей и красной лакмусовой бумаги. Наносят каплю мочи на лакмусовые бумажки. При нейтральной реакции индикаторы не меняют цвет, при кислой реакции синяя лакмусовая бумажка краснеет, при щелочной – красная бумажка синеет.
б) Определение удельного веса мочи.
Для определения удельного веса мочи используются урометры. Они бывают двух видов – для мочи с низким и нормальным удельным весом с делениями от 1,000 до 1,030, и для мочи с высоким удельным весом с делениями от 1,020 до 1,060.
Ход работы
Мочу наливают в стеклянный цилиндр (по стенке, медленно, чтобы не образовывалась пена). Определение начинают с урометра первого типа. Его опкускают в мочу медленно. Когда урометр перестает опускаться, его нужно слегка толкнуть сверху, после чего он, сделав несколько движений вверх-вниз, остановится. По нижнему мениску шкалы урометра определяют удельную плотность мочи. Если урометр первого вида выталкивается мочой и он не опускается до шкалы, значит, удельная плотность мочи высокая и для определения используют урометр второго вида. Исследования надо проводить при температуре 15 0С. Если температура выше, то на каждые +3º добавляют 0,001 к показателям шкалы и если ниже на 3º – отнимают .
В норме удельная плотность мочи при температуре 15 0С составляет 1.015-1.025, но в отдельных порциях в течение суток эти колебания значительно шире.
в) Определение цвета, запаха, прозрачности мочи проводят органолептическим способом.
Работа 5. Определить общий азот мочи.
Принцип метода. От азотсодержащих веществ мочи при нагревании в присутствии концентрированной H2SO4 (минерализация) отщепляется аммиак, который превращается в сульфат аммония (NH4)2SO4. Последний определяется с помощью реактива Несслера (образуется соединение оранжевого цвета). Интенсивность цвета прямо зависит от концентрации аммиака и определяется колориметрически.
Ход работы
Минерализат
мочи получают в лабораиории. Для определения общего азота в одну пробирку
вносят 0,5 мл минерализата, во вторую – 0,5 мл стандартного раствора (NH4)2SO4.
В обе пробирки добавляют по 6,5 мл воды и по 0,5 мл реактива
Несслера. Растворы хорошо перемешивают и определяют оптическую плотность на
ФЭКе при зеленом светофильтре в кювете
Расчет проводят по формуле :
Эоп × Сст
Соп = --------------- × 1,5, где:
Эст
Эоп и Эст – экстинкции опыта и стандарта;
Сст – концентрация стандарта (г/л) указана на флаконе с реактивом;
1,5 – пересчёт на суточное количество мочи;
Соп – концентрация общего азота мочи (г/сутки).
Оценить полученный результат, исходя из того, что в норме содержание общего азота мочи составляет 10-18 г/сутки (или 428,4-1213 ммоль/сутки).
Работа 6. Работа 3. Качественные реакции на белок в моче и определение его количества.
Принцип метода. Для определения белка используют реакции осаждения при помощи азотной или сульфосалициловой кислоты (последняя более чувствительна, осаждает и пептиды).
Ход работы
Реакция Геллера.
В пробирку вносят 10 капель концентрированной азотной кислоты. Слегка наклонив пробирку, по стенке вливают 10 капель мочи. В присутствии белка на границе жидкостей образуется осадок в виде кольца помутнения. Такую же реакцию можно проделать с сульфосалициловой кислотой. Для сравнения реакции проводят с мочой здорового человека.
Количественное определение белка в моче по методу Робертса-Стольникова.
Принцип метода. Используя реакцию Геллера и тот экспериментально установленный факт, что образование кольца помутнения между 2 и 3 мин соответствуют концентрации белка 0,033 г/л, определяют содержание белка в моче путем её разведения.
Ход работы
В 5 пробирок вносят по 1 мл дистиллированной воды. В первую добавляют 1 мл мочи, в которой обнаружен белок. Содержимое пробирки перемешивают и 1 мл раствора переносят во вторую пробирку, после перемешивания 1 мл переносят в третью и так до последней, из последней пробирки 1 мл смеси выливают. Следовательно, в каждой из 5 пробирок остается по 1 мл мочи, разведенной последовательно в 2, 4, 8, 16, 32 раза. В 5 других пробирок вносят по 1 мл концентрированной HNO3. Разведенную мочу наслаивают, начиная из последней пробирки, на азотную кислоту. По истечении 3-х минут отмечают пробирку с наибольшим разведением мочи, где еще заметно кольцо помутнения.
Расчет:
Если кольцо еще заметно в пробирке с разведением 8, то содержание белка составляет:
0,033 г/л × 8 = 0,246 г/л (или ‰).
Оценить результат и указать возможные причины протеинурии.
Работа 7. Качественная реакция на кровь (бензидиновая проба).
Принцип метода. При наличии крови в моче пероксидаза, используя как акцептор електронов Н2О2, окисляет бензидин с образованием окрашенных продуктов реакции.
Ход работы
К 5 каплям 1 % бензидина добавляют 5 капель 3 % Н2О2 и 5 капель исследуемой мочи.При наличии крови наблюдается появление синего цвета (окисленный бензидин).
Отметить возможные причины гематурии.
Работа 8. Качественное и количественное определение глюкозы в моче.
а) Реакция Фелинга.
Принцип метода основан на восстанавливающих свойствах глюкозы за счёт окисления альдегидной группы (восстанавливается гидроксид меди до оксида меди).
Ход работы
К 1 мл мочи добавляют 1 мл реактива Фелинга и смесь слегка нагревают в пламени горелки до закипания. При наличии глюкозы наблюдается изменение цвета раствора на кирпично-красный. Для сравнения проводят реакцию с мочой здорового человека.
б) Унифицированный метод с помощью индикаторных полосок «Глюкотест».
Принцип метода: Метод основан на специфическом окислении глюкозы ферментом глюкозоксидазой до глюконовой кислоты и перекиси водорода в присутствии кислорода. Наличие в индикаторной зоне полоски пероксидазы способствует окислению аурамина, который при этом изменяет свой цвет от желтого до синего в зависимости от содержания глюкозы. Этот метод позволяет определить концентрацию глюкозы в моче от 0,03% и выше.
Техника работы.
Полоску «глюкотеста» опускают в свежесобранную мочу индикаторным концом, вынимают и на 2 минуты оставляют на воздухе. Затем сравнивают цвет индикаторной зоны со стандартной цветной шкалой «Глюкотеста» и определяют количество глюкозы. При отсутствии глюкозы цвет не изменится.
в) Количественное определение глюкозы в моче методом Альтгаузена.
Принцип метода: Метод основан на том, что моча, содержащая глюкозу, при кипячении со щелочью приобретает различные оттенки цветов – от желтого до тёмно-бурого – в зависимости от содержания глюкозы. Продуктами реакции являются молочная кислота и гуминовые вещества.
Техника работы.
3-4 мл мочи смешивают в пробирке с 1 мл 10% NaOH, кипятят в течение 1 минуты и оставляют на 10 минут в штативе. Сравнивают визуально полученный цвет в пробирке со стандартной шкалой Альтгаузена. Можно провести колориметрию исследуемого раствора с одним из растворов стандартной шкалы. Результат будет более точным.
Обосновать полученные результаты, исходя из того, что у здоровых людей глюкоза в моче этими методами на определяется.
Работа 9. Качественное и количественное определение кетоновых тел в моче.
а) Качественные реакции на кетоновые тела.
Реакция Легаля.
Принцип метода: Ацетон и ацетоуксусная кислота образуют в щелочной среде с нитропруссидом натрия продукты, окрашенные в красный цвет. При добавлении концентрированной уксусной кислоты образуется комплексная соль вишнёвого цвета.
Техника работы.
Берут 2 пробирки, в одну вносят 0,5 мл мочи здорового человека, во вторую – 0,5 мл патологической мочи (больного сахарным диабетом). В обе пробирки добавляют по 0,5 мл 10% NaOH и по 5 капель нитропруссида натрия. Наблюдают окрашивание в пробирках. Добавляют в обе пробирки по 5-6 капель концентрированной уксусной кислоты. Отмечают изменение цвета в пробирках. При сравнении их делают вывод о наличии или отсутствии в моче ацетона.
Реакция Герхарда.
Принцип метода: При добавлении к моче раствора FeCl3 выпадает в осадок фосфат железа (FeРО4). При наличии ацетоуксусной кислоты после добавления избытка FeCl3 появляется вишнёво-красное окрашивание (при лёгком нагревании реакция проходит активнее).
Техника работы.
Берут 2 пробирки. В первую вносят 2 мл мочи здорового человека, во вторую – 2 мл мочи больного сахарным диабетом. В каждую пробирку добавляют по каплям 10% FeCl3. Образовавшийся осадок фосфатов отфильтровывают с помощью бумажного фильтра. К фильтрату добавляют еще несколько капель FeCl3, наблюдают появление окрашивания. При сравнении цвета в обеих пробирках делают вывод о наличии или отсутствии ацетоуксусной кислоты в моче.
б) Количественное определение кетоновых тел в моче.
Принцип метода: Ацетон в присутствии нитропруссида натрия и уксусной кислоты при наслаивании аммиака образует фиолетовое кольцо, скорость появления которого зависит от концентрации ацетона. Установлено, что появления кольца между 3-4 мин соответствует содержанию ацетона 8,5 мг /1 л мочи.
Техника работы.
Берут 5 пробирок, в каждую вливают по 1 мл Н2О. В первую добавляют мочу, содержащую ацетон (!), перемешивают, получают разведение мочи в 2 раза. Отбирают 1 мл этой мочи из первой пробирки и переносят во вторую, перемешивают, получая разведение в 4 раза. Из этой пробирки 1 мл мочи переносят в третью (разведение в 8 раз) и так до последней. Из последней пробирки 1 мл смеси выливают (во всех пробирках остаётся по 1 мл смеси). Затем во все пробирки добавляют по 8 капель 50% (NH4)2SO4, по 8 капель нитропруссида натрия и по 8 капель концентрированной уксусной кислоты. Содержимое пробирок перемешивают и в каждую по стенкам наcлаивают по 0,5 мл концентрированного аммиака, начиная из последней пробирки. К концу 4 мин отмечают последнюю пробирку, где еще заметно фиолетовое кольцо.
Расчёт ведут по формуле:
Х = 8,5 ×а × 1,5
Х – концентрация ацетона в моче (мг/сутки);
8,5 – эмпирическое число;
а – разведение мочи;
1,5 – пересчёт на суточное количество мочи (
По результатам делают вывод о количестве ацетона в исследуемой моче, исходя из того, что у здоровых людей оно не превышает 40 мг в сутки.
Программа самоподготовки студентов к занятию
I Биохимические функции печени. Метаболизм порфирина: обмен желчных пигментов, биохимия желтух. Биотрансформация ксенобиотиков.
1. Функции печени.
2. Роль печени в обмене углеводов, липидов и белков.
3. Участие печени в регуляции витаминного и водно-минерального обмена.
4. Желчеобразующая и экскреторная роль печени.
5. Катаболизм Нв, образование жёлчных пигментов.
6. Понятие о “прямом” и “непрямом” билирубине, истинном уробилине.
7. Механизм возникновения желтух, их биохимическая характеристика.
8. Клиническое значение анализа билирубина в сыворотке крови и метод его определения.
9. Обезвреживание токсических веществ в печени; биотрансформация ксенобиотиков и эндогенных токсинов.
10. Типы реакций биотрансформации инородных и эндогенных химических соединений в печени.
11. Реакции микросомального окисления; индукторы и ингибиторы микросомальных монооксигеназ.
12. Реакции конъюгации в гепатоците: биохимические механизмы, функциональное значение.
13. Клиническое значение исследования функционального состояния печени с помощью тимоловой пробы и качественной реакции на индикан.
II Мочеобразовательная функция почек. Физико-химические свойства и химический состав нормальной мочи. Патобиохимия почек. Патологические компоненты мочи.
1. Функции почек в организме:
а) выделение конечных продуктов обмена;
б) регуляция кислотно-щелочного равновесия;
в) регуляция водно-солевого обмена, кровяного давления;
г) эндокринная функция.
2. Особенности биохимических процессов в почках.
3. Механизм образования мочи (фильтрация, реабсорбция, секреция).
4. Представление о клиренсе.
5. Регуляция образования мочи.
6. Физико-химические свойства и составные части мочи:
а) суточный объем и физико-химические свойства мочи;
б) минеральные компоненты мочи;
в) органические компоненты мочи.
7. Методы исследования физико-химических свойств, определение общего азота мочи, диагностическое значение.
8. Патологические компоненты мочи, которые вызваны определенными нарушениями обмена веществ в организме:
а) глюкозурия;
б) кетонурия;
в) билирубинурия;
г) уробилинурия;
д) креатинурия;
ж) индиканурия;
з)фенилкетонурия.
9. Причины изменения содержания в моче нормальных компонентов:
а) мочевины
б) креатинина;
в) аминокислот;
г) мочевой кислоты;
д) ферментов;
ж) неорганических веществ;
з) общего азота.
3. Показатели, которые свидетельствуют о нарушении функции почек:
а) протеинурия;
б) гематурия;
в) глюкозурия;
г) пиурия;
д) креатинурия.
10. Методы определения в моче белка, глюкозы, кетоновых тел, крови. Диагностическое значение.
Семинарское обсуждение теоретических вопросов: 12.30-14.00 час.
Образцы тестовых заданий и ситуационных задач (привести 5-6 примеров).
1. Показатель тимоловой пробы исследуемой сыворотки крови составляет 20 ЕД. Дайте оценку полученному результату.
2. Реакция на индикан в моче положительная. Какую оценку функции печени можно дать в данном случае?
3. В моче человека обнаружен билирубинглюкурониды и мезобилирубиноген (уробилиноген). В сыворотке крови содержание общего билирубина составляет 40 мкмоль/л, прямого билирубина 25 мкмоль/л, непрямого-15 мкмоль/л, кал гипохолический. О чем свидетельствуют данные показатели?
4. У больного желтухой общий билирубин составляет 54 мкмоль/л, прямой билирубин-29 мкмоль/л, непрямой-25 мкмоль/л. Кал ахолический. В моче положительная реакция на билирубин. Какое заболевание можно предположить?
5. У
пациента за сутки выделяется более
6. У больного выделяется моча с удельным весом 1,035. Отвечает ли это норме? Какие причины такого состояния?
7. За
сутки больной выделяет
8. При исследовании порций мочи, собранных в отдельные посудины на протяжении суток, оказалось, что удельный вес мочи колеблется в пределах 1,008-1,012. Как трактовать такое состояние? Когда это может наблюдаться?
9. У больного суточный диурез составляет 3,5 литра. В моче обнаружены глюкоза и кетоновые тела. Какие причины и возможные последствия такого состояния?
10. У больного обнаружено увеличение содержания мочевины и креатинина в крови и уменьшение их в моче. Какие возможные причины и следствия такого состояния?
Cамостоятельная работа студентов: 14.15 – 15.00 час.
Студент должен знать:
1. Распад гемоглобина в тканях.
2. Механизм детоксикации билирубина.
3. Понятие о "прямом" и "непрямом" билирубине, их содержании в крови.
4. Виды желтух, их биохимическая характеристика.
5. Значение анализа билирубина для клинической практики.
6. Обезвреживание токсических веществ в печени; биотрансформация ксенобиотиков и эндогенных токсинов.
7. Функции почек, механизм и регуляция образования мочи.
8. Роль почек в регуляции гомеостаза.
9. Физико-химические свойства и химический состав мочи здорового человека и их изменения при заболеваниях почек и нарушениях процесса обмена в организме.
Студент должен уметь:
1. Определять содержание общего билирубина в сыворотке крови, объяснять значение данного анализа в диагностике желтух.
2. Определить наличие индикана в моче, по результатам анализа оценить обезвреживающую функцию печени.
3. Провести тимоловую пробу с сывороткой крови, обьяснить её значение в диагностике белоксинтезирующей функции печени.
4. Исследовать физико-химические свойства мочи.
5. Определить содержание общего азота мочи.
6. Определить наличие и количество глюкозы, белка, ацетона, наличие крови в моче.
7. Обосновать значение этих анализов в клинической практике.
Эталоны ответов на тесты и ситуационные задачи:
1. Имеет место повышение показателя, что наблюдается при вирусном гепатите, паренхимаозной желтухе.
2. Обезвреживающая функция печени не нарушена.
3. У больного паренхиматозная желтуха.
4. Механическая желтуха.
5. Наблюдается полиурия. Возможные причины: употребление мочегонных средств, сахарный диабет, несахарный диабет, некоторые нервные заболевания, болезни почек, употребление большого количества жидкости.
6. Удельный вес мочи повышен (гиперстенурия). Это возможно при потере воды организмом (длительное пребывание в горячем климате, рвота, диарея, высокая температура тела), при некоторых заболеваниях почек, сахарном диабете.
7. Увеличение содержания общего азота в моче может свидетельствовать о повышенном употреблении белковых продуктов или усиленном распаде белков в организме (лихорадочные состояния, злокачественные опухоли, туберкулезный процесс, рассасывание эксудатов и транссудатов).
8. Имеет место изостенурия, что может быть при тяжелой почечной недостаточности, когда почки теряют концентрационную способность и выделяют мочу с плотностью, которая не отличается от плотности первичной мочи.
9. Сочетание полиурии, глюкозурии и кетонурии возможно при недостаточности инсулина (сахарном диабете), при этом нарушается углеводный, белковый, липидный и водно-минеральный обмены, может возникнуть кетоз.
10. Заболевание, которое приводит к почечной недостаточности. Следствие - интоксикация организма (уремия).
Источники информации:
Основные:
- Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - Г.: Медицина, 1990. - 543 с.
- Савицкий И.В. Биологическая химия - К.: Высшая школа, 1982. -470 с.
- Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина. 1983 с. 97–100.
- Конспекты лекций.
- Веб-страница университета > Интранет > На помощь студентам > Материали для подготовки к практическим занятиям > Кафедра медицинской биохимии > Биологическая химия > Стоматологический факультет > Биохимические функции печени.
- Веб-страница университета > Интранет > На помощь студентам > Презентации лекций > Кафедра медицинской биохимии > Биологическая химия > Стоматологический факультет > Гормоны, общая характеристика, классификация. Гормоны гипофиза. Гормоны щитовидной, паращитовидной, поджелудочной, половых желез, гормоны надпочечных желез. Витамины как компоненты питания человека. Биохимия крови. Биохимические функции печени. Биохимия желтух.
Дополнительные:
1. Николаев А.Я. Биологическая химия. - М: Высшая школа, 1989. - 496 с.
2. Ленинджер А. Основы биохимии: Перевод с англ. - М.: Мир, 1985. - 1024 с.
Методическое указание составила доц. Яворская С.И
Обсуждено и утверждено на заседании кафедры
«11» июня 2013 г. протокол № 13
Пересмотрено и утверждено на заседании кафедры
«29» августа 2013 г. протокол № 2
. Метаболизм порфирина: обмен желчных пигментов, биохимия желтух. Биотрансформация ксенобиотиков. - 3 час.
2. Мочеобразовательная функция почек. Физико-химические свойства и химический состав нормальной мочи. Патобиохимия почек. Патологические компоненты мочи. -3 час.
Цель: Уметь определять содержание билирубина в сыворотке крови и применять знание об обмене хромопротеинов для объяснения механизма возникновения желтух Уметь выполнять тимолову пробу и качественную реакцию на индикан и использовать полученные результаты для оценки функционального состояния печени.
Уметь исследовать физико-химические свойства и химический состав мочи здорового человека, объяснить механизм образования мочи, определять патологические компоненты мочи и использовать полученные данные для диагностики болезней почек и нарушения обмена веществ в организме.
Профессиональная ориентация студентов: Печень является главным органом обезвреживания токсических веществ, в частности продуктов гниения белков (индола, скатола и др.), потому определение содержания индикана в моче является важным признаком детоксикационной функции печени и усиления гнилостных процессов в кишечнике. Билирубин относится к желчным пигментам, является токсичным веществом, обезвреживается в клетках печени. Нагромождение билирубина в крови выше 35 мкмоль/л приводит к откладыванию его в тканях, появлению желтухи. Потому определение содержания билирубина в сыворотке крови имеет важное значение для дифференциальной диагностики желтух.
Данные анализа мочи, соединенные с клиническими наблюдениями, помогают установить характер хода патологического процесса и имеют диагностическое значение. Клинический анализ мочи является обязательной составной частью общего обследования больного. При патологических состояниях, которые связаны с расстройством обмена веществ и нарушениям деятельности тех или других органов (почек, печени, сердца, пищеварительных органов), происходит изменение состава крови, что неминуемо влияет на состав мочи.
Методика выполнения практической работы: - 9.00-12.00 час. при 6-часовом занятии
Выполнение практической работы происходит согласно с “Методическими указаниями для студентов” с обязательным выводом в конце каждой работы.
I Биохимические функции печени. Метаболизм порфирина: обмен желчных пигментов, биохимия желтух. Биотрансформация ксенобиотиков.
Работа 1. Провести определение общего билирубина в сыворотке крови.
Принцип метода. Билирубин образует с диазореактивом соединение (азобилирубин) розового цвета. Интенсивность цвета пропорциональна концентрации билирубина и определяется колориметрически. Свободный (непрямой) билирубин нерастворимый, поэтому его предварительно переводят в растворимое состояние добавлением к сыворотке крови кофеинового реактива.
Ход работы
К 0,5 мл сыворотки крови добавляют 0, 25 мл смеси
диазореактива ( 10 мл диазореактива № 1 смешивают с 0, 3 мл диазореактива № 2)
и 1, 75 мл кофеинового реактива. Перемешивают и оставляют пробирку на 10 мин.,
после чего колориметрируют на ФЭКе при зелёном светофильтре в кювете
Расчёт по формуле:
Сст´Эоп
Х= -------------, где:
Эоп
Х – концентрация билирубина в сыворотке крови (мкмоль/л);
Эоп и Эст – экстинкции опытной и стандартной проб.
Оценить полученный результат, исходя из того, что в норме концентрация общего билирубина в крови составляет 1, 7 – 20, 5 мкмоль/л. Увеличение в крови билирубина выше 35 мкмоль/л приводит к отложению его в тканях, появление желтухи. Однако для диагностики и дифференциации желтух необходимо определение соотношения свободного (непрямого) и связанного (прямого) билирубина. В норме их содержание соответственно составляет 1, 7 – 17, 1 мкмоль/л и 0, 86 – 4, 3 мкмоль/л.
Работа 2. Качественная реакция на индикан в моче (реакция Обермейера).
Принцип метода. При действии концентрированной НСl индикан гидролизует с образованием индола, который окисляется с помощью FeCl3 в индоксил и синее индиго.
Ход работы
К 4 мл мочи добавляют 0, 4 мл раствора ацетата свинца (CH3COOPb) для осаждения жёлчных пигментов, солей и др. веществ. Фильтруют, затем 1 -2 мл фильтрата смешивают с равным объёмом реактива Обермейера (раствор FeCl3 в концентрированной НСl), добавляют 0, 5 – 1 мл хлороформа и осторожно перемешивают. Наблюдают несколько минут. Если нижний хлороформный слой окрашивается в синий или красноватый цвет, реакция считается положительной. В норме реакция отрицательная.
Положительная реакция свидетельствует об усилении процессов гниения белков в организме, но обезвреживающая функция печени не нарушена.
Работа 3. Провести тимоловую пробу.
Принцип метода. Проба основана на определении степени помутнения смеси сыворотки крови с насыщенным раствором тимола в вероналовом буфере, что обусловлено его взаимодействием с крупнодисперсными белками сыворотки – гамма-глобулинами и липопротеинами низкой плотности. Проба становится положительной при уменьшении содержания альбумина и увеличением бета- и гамма-глобулинов.
Ход работы
В пробирку вносят 4, 8 мл тимолового реактива, добавляют 0,08 мл сыворотки крови, перемешивают, выдерживают 30 минут при комнатной температуре. Фотометрируют против тимолового реактива при длине волны 630-690 нм. Степень помутнения находят по калибровочному графику. Калибровочный график приготовлен в лаборатории кафедры. В норме тимоловая проба соответствует 0 – 5 ед. помутнения.
Повышение показателей (положительная проба, больше 5 ед.) отмечается при гепатитах, эндокардите. При механической желтухе, ревматизме проба отрицательная.
ІІ Мочеобразовательная функция почек. Физико-химические свойства и химический состав нормальной мочи. Патобиохимия почек. Патологические компоненты мочи.
Работа 4. Определить физико-химические свойства мочи.
а) Определение рН мочи.
Реакцию мочи определяют с помощью индикаторов – синей и красной лакмусовой бумаги. Наносят каплю мочи на лакмусовые бумажки. При нейтральной реакции индикаторы не меняют цвет, при кислой реакции синяя лакмусовая бумажка краснеет, при щелочной – красная бумажка синеет.
б) Определение удельного веса мочи.
Для определения удельного веса мочи используются урометры . Они бывают двух видов – для мочи с низким и нормальным удельным весом с делениями от 1,000 до 1,030, и для мочи с высоким удельным весом с делениями от 1,020 до 1,060.
Ход работы
Мочу наливают в стеклянный цилиндр (по стенке, медленно, чтобы не образовывалась пена). Определение начинают с урометра первого типа. Его опкускают в мочу медленно. Когда урометр перестает опускаться, его нужно слегка толкнуть сверху, после чего он, сделав несколько движений вверх-вниз, остановится. По нижнему мениску шкалы урометра определяют удельную плотность мочи. Если урометр первого вида выталкивается мочой и он не опускается до шкалы, значит, удельная плотность мочи высокая и для определения используют урометр второго вида. Исследования надо проводить при температуре 15 0С. Если температура выше, то на каждые +3º добавляют 0,001 к показателям шкалы и если ниже на 3º – отнимают .
В норме удельная плотность мочи при температуре 15 0С составляет 1.015-1.025, но в отдельных порциях в течение суток эти колебания значительно шире.
в) Определение цвета, запаха, прозрачности мочи проводят органолептическим способом.
Работа 5. Определить общий азот мочи.
Принцип метода. От азотсодержащих веществ мочи при нагревании в присутствии концентрированной H2SO4 (минерализация) отщепляется аммиак, который превращается в сульфат аммония (NH4)2SO4. Последний определяется с помощью реактива Несслера (образуется соединение оранжевого цвета). Интенсивность цвета прямо зависит от концентрации аммиака и определяется колориметрически.
Ход работы
Минерализат
мочи получают в лабораиории. Для определения общего азота в одну пробирку
вносят 0,5 мл минерализата, во вторую – 0,5 мл стандартного раствора (NH4)2SO4.
В обе пробирки добавляют по 6,5 мл воды и по 0,5 мл реактива
Несслера. Растворы хорошо перемешивают и определяют оптическую плотность на
ФЭКе при зеленом светофильтре в кювете
Расчет проводят по формуле :
Эоп × Сст
Соп = --------------- × 1,5, где:
Эст
Эоп и Эст – экстинкции опыта и стандарта;
Сст – концентрация стандарта (г/л) указана на флаконе с реактивом;
1,5 – пересчёт на суточное количество мочи;
Соп – концентрация общего азота мочи (г/сутки).
Оценить полученный результат, исходя из того, что в норме содержание общего азота мочи составляет 10-18 г/сутки (или 428,4-1213 ммоль/сутки).
Работа 6. Работа 3. Качественные реакции на белок в моче и определение его количества.
Принцип метода. Для определения белка используют реакции осаждения при помощи азотной или сульфосалициловой кислоты (последняя более чувствительна, осаждает и пептиды).
Ход работы
Реакция Геллера.
В пробирку вносят 10 капель концентрированной азотной кислоты. Слегка наклонив пробирку, по стенке вливают 10 капель мочи. В присутствии белка на границе жидкостей образуется осадок в виде кольца помутнения. Такую же реакцию можно проделать с сульфосалициловой кислотой. Для сравнения реакции проводят с мочой здорового человека.
Количественное определение белка в моче по методу Робертса-Стольникова.
Принцип метода. Используя реакцию Геллера и тот экспериментально установленный факт, что образование кольца помутнения между 2 и 3 мин соответствуют концентрации белка 0,033 г/л, определяют содержание белка в моче путем её разведения.
Ход работы
В 5 пробирок вносят по 1 мл дистиллированной воды. В первую добавляют 1 мл мочи, в которой обнаружен белок. Содержимое пробирки перемешивают и 1 мл раствора переносят во вторую пробирку, после перемешивания 1 мл переносят в третью и так до последней, из последней пробирки 1 мл смеси выливают. Следовательно, в каждой из 5 пробирок остается по 1 мл мочи, разведенной последовательно в 2, 4, 8, 16, 32 раза. В 5 других пробирок вносят по 1 мл концентрированной HNO3. Разведенную мочу наслаивают, начиная из последней пробирки, на азотную кислоту. По истечении 3-х минут отмечают пробирку с наибольшим разведением мочи, где еще заметно кольцо помутнения.
Расчет:
Если кольцо еще заметно в пробирке с разведением 8, то содержание белка составляет:
0,033 г/л × 8 = 0,246 г/л (или ‰).
Оценить результат и указать возможные причины протеинурии.
Работа 7. Качественная реакция на кровь (бензидиновая проба).
Принцип метода. При наличии крови в моче пероксидаза, используя как акцептор електронов Н2О2, окисляет бензидин с образованием окрашенных продуктов реакции.
Ход работы
К 5 каплям 1 % бензидина добавляют 5 капель 3 % Н2О2 и 5 капель исследуемой мочи.При наличии крови наблюдается появление синего цвета (окисленный бензидин).
Отметить возможные причины гематурии.
Работа 8. Качественное и количественное определение глюкозы в моче.
а) Реакция Фелинга.
Принцип метода основан на восстанавливающих свойствах глюкозы за счёт окисления альдегидной группы (восстанавливается гидроксид меди до оксида меди).
Ход работы
К 1 мл мочи добавляют 1 мл реактива Фелинга и смесь слегка нагревают в пламени горелки до закипания. При наличии глюкозы наблюдается изменение цвета раствора на кирпично-красный. Для сравнения проводят реакцию с мочой здорового человека.
б) Унифицированный метод с помощью индикаторных полосок «Глюкотест».
Принцип метода: Метод основан на специфическом окислении глюкозы ферментом глюкозоксидазой до глюконовой кислоты и перекиси водорода в присутствии кислорода. Наличие в индикаторной зоне полоски пероксидазы способствует окислению аурамина, который при этом изменяет свой цвет от желтого до синего в зависимости от содержания глюкозы. Этот метод позволяет определить концентрацию глюкозы в моче от 0,03% и выше.
Техника работы.
Полоску «глюкотеста» опускают в свежесобранную мочу индикаторным концом, вынимают и на 2 минуты оставляют на воздухе. Затем сравнивают цвет индикаторной зоны со стандартной цветной шкалой «Глюкотеста» и определяют количество глюкозы. При отсутствии глюкозы цвет не изменится.
в) Количественное определение глюкозы в моче методом Альтгаузена.
Принцип метода: Метод основан на том, что моча, содержащая глюкозу, при кипячении со щелочью приобретает различные оттенки цветов – от желтого до тёмно-бурого – в зависимости от содержания глюкозы. Продуктами реакции являются молочная кислота и гуминовые вещества.
Техника работы.
3-4 мл мочи смешивают в пробирке с 1 мл 10% NaOH, кипятят в течение 1 минуты и оставляют на 10 минут в штативе. Сравнивают визуально полученный цвет в пробирке со стандартной шкалой Альтгаузена. Можно провести колориметрию исследуемого раствора с одним из растворов стандартной шкалы. Результат будет более точным.
Обосновать полученные результаты, исходя из того, что у здоровых людей глюкоза в моче этими методами на определяется.
Работа 9. Качественное и количественное определение кетоновых тел в моче.
а) Качественные реакции на кетоновые тела.
Реакция Легаля.
Принцип метода: Ацетон и ацетоуксусная кислота образуют в щелочной среде с нитропруссидом натрия продукты, окрашенные в красный цвет. При добавлении концентрированной уксусной кислоты образуется комплексная соль вишнёвого цвета.
Техника работы.
Берут 2 пробирки, в одну вносят 0,5 мл мочи здорового человека, во вторую – 0,5 мл патологической мочи (больного сахарным диабетом). В обе пробирки добавляют по 0,5 мл 10% NaOH и по 5 капель нитропруссида натрия. Наблюдают окрашивание в пробирках. Добавляют в обе пробирки по 5-6 капель концентрированной уксусной кислоты. Отмечают изменение цвета в пробирках. При сравнении их делают вывод о наличии или отсутствии в моче ацетона.
Реакция Герхарда.
Принцип метода: При добавлении к моче раствора FeCl3 выпадает в осадок фосфат железа (FeРО4). При наличии ацетоуксусной кислоты после добавления избытка FeCl3 появляется вишнёво-красное окрашивание (при лёгком нагревании реакция проходит активнее).
Техника работы.
Берут 2 пробирки. В первую вносят 2 мл мочи здорового человека, во вторую – 2 мл мочи больного сахарным диабетом. В каждую пробирку добавляют по каплям 10% FeCl3. Образовавшийся осадок фосфатов отфильтровывают с помощью бумажного фильтра. К фильтрату добавляют еще несколько капель FeCl3, наблюдают появление окрашивания. При сравнении цвета в обеих пробирках делают вывод о наличии или отсутствии ацетоуксусной кислоты в моче.
б) Количественное определение кетоновых тел в моче.
Принцип метода: Ацетон в присутствии нитропруссида натрия и уксусной кислоты при наслаивании аммиака образует фиолетовое кольцо, скорость появления которого зависит от концентрации ацетона. Установлено, что появления кольца между 3-4 мин соответствует содержанию ацетона 8,5 мг /1 л мочи.
Техника работы.
Берут 5 пробирок, в каждую вливают по 1 мл Н2О. В первую добавляют мочу, содержащую ацетон (!), перемешивают, получают разведение мочи в 2 раза. Отбирают 1 мл этой мочи из первой пробирки и переносят во вторую, перемешивают, получая разведение в 4 раза. Из этой пробирки 1 мл мочи переносят в третью (разведение в 8 раз) и так до последней. Из последней пробирки 1 мл смеси выливают (во всех пробирках остаётся по 1 мл смеси). Затем во все пробирки добавляют по 8 капель 50% (NH4)2SO4, по 8 капель нитропруссида натрия и по 8 капель концентрированной уксусной кислоты. Содержимое пробирок перемешивают и в каждую по стенкам наcлаивают по 0,5 мл концентрированного аммиака, начиная из последней пробирки. К концу 4 мин отмечают последнюю пробирку, где еще заметно фиолетовое кольцо.
Расчёт ведут по формуле:
Х = 8,5 ×а × 1,5
Х – концентрация ацетона в моче (мг/сутки);
8,5 – эмпирическое число;
а – разведение мочи;
1,5 – пересчёт на суточное количество мочи (
По результатам делают вывод о количестве ацетона в исследуемой моче, исходя из того, что у здоровых людей оно не превышает 40 мг в сутки.
Программа самоподготовки студентов к занятию
I Биохимические функции печени. Метаболизм порфирина: обмен желчных пигментов, биохимия желтух. Биотрансформация ксенобиотиков.
1. Функции печени.
2. Роль печени в обмене углеводов, липидов и белков.
3. Участие печени в регуляции витаминного и водно-минерального обмена.
4. Желчеобразующая и экскреторная роль печени.
5. Катаболизм Нв, образование жёлчных пигментов.
6. Понятие о “прямом” и “непрямом” билирубине, истинном уробилине.
7. Механизм возникновения желтух, их биохимическая характеристика.
8. Клиническое значение анализа билирубина в сыворотке крови и метод его определения.
9. Обезвреживание токсических веществ в печени; биотрансформация ксенобиотиков и эндогенных токсинов.
10. Типы реакций биотрансформации инородных и эндогенных химических соединений в печени.
11. Реакции микросомального окисления; индукторы и ингибиторы микросомальных монооксигеназ.
12. Реакции конъюгации в гепатоците: биохимические механизмы, функциональное значение.
13. Клиническое значение исследования функционального состояния печени с помощью тимоловой пробы и качественной реакции на индикан.
II Мочеобразовательная функция почек. Физико-химические свойства и химический состав нормальной мочи. Патобиохимия почек. Патологические компоненты мочи.
1. Функции почек в организме:
а) выделение конечных продуктов обмена;
б) регуляция кислотно-щелочного равновесия;
в) регуляция водно-солевого обмена, кровяного давления;
г) эндокринная функция.
2. Особенности биохимических процессов в почках.
3. Механизм образования мочи (фильтрация, реабсорбция, секреция).
4. Представление о клиренсе.
5. Регуляция образования мочи.
6. Физико-химические свойства и составные части мочи:
а) суточный объем и физико-химические свойства мочи;
б) минеральные компоненты мочи;
в) органические компоненты мочи.
7. Методы исследования физико-химических свойств, определение общего азота мочи, диагностическое значение.
8. Патологические компоненты мочи, которые вызваны определенными нарушениями обмена веществ в организме:
а) глюкозурия;
б) кетонурия;
в) билирубинурия;
г) уробилинурия;
д) креатинурия;
ж) индиканурия;
з)фенилкетонурия.
9. Причины изменения содержания в моче нормальных компонентов:
а) мочевины
б) креатинина;
в) аминокислот;
г) мочевой кислоты;
д) ферментов;
ж) неорганических веществ;
з) общего азота.
3. Показатели, которые свидетельствуют о нарушении функции почек:
а) протеинурия;
б) гематурия;
в) глюкозурия;
г) пиурия;
д) креатинурия.
10. Методы определения в моче белка, глюкозы, кетоновых тел, крови. Диагностическое значение.
Семинарское обсуждение теоретических вопросов и практической работы:
- 12.30-14.00 час. при 6-часовом занятии
Образцы тестовых заданий и ситуационных задач (привести 5-6 примеров).
1. Показатель тимоловой пробы исследуемой сыворотки крови составляет 20 ЕД. Дайте оценку полученному результату.
2. Реакция на индикан в моче положительная. Какую оценку функции печени можно дать в данном случае?
3. В моче человека обнаружен билирубинглюкурониды и мезобилирубиноген (уробилиноген). В сыворотке крови содержание общего билирубина составляет 40 мкмоль/л, прямого билирубина 25 мкмоль/л, непрямого-15 мкмоль/л, кал гипохолический. О чем свидетельствуют данные показатели?
4. У больного желтухой общий билирубин составляет 54 мкмоль/л, прямой билирубин-29 мкмоль/л, непрямой-25 мкмоль/л. Кал ахолический. В моче положительная реакция на билирубин. Какое заболевание можно предположить?
5. У
пациента за сутки выделяется более
6. У больного выделяется моча с удельным весом 1,035. Отвечает ли это норме? Какие причины такого состояния?
7. За
сутки больной выделяет
8. При исследовании порций мочи, собранных в отдельные посудины на протяжении суток, оказалось, что удельный вес мочи колеблется в пределах 1,008-1,012. Как трактовать такое состояние? Когда это может наблюдаться?
9. У больного суточный диурез составляет 3,5 литра. В моче обнаружены глюкоза и кетоновые тела. Какие причины и возможные последствия такого состояния?
10. У больного обнаружено увеличение содержания мочевины и креатинина в крови и уменьшение их в моче. Какие возможные причины и следствия такого состояния?
Исходный уровень знаний и умений проверяется путем решения ситуационных задач по каждой теме, ответами на тесты типа "Крок", конструктивные вопросы и тому подобное (1415 - 1500 час.).
Студент должен знать:
1. Распад гемоглобина в тканях.
2. Механизм детоксикации билирубина.
3. Понятие о "прямом" и "непрямом" билирубине, их содержании в крови.
4. Виды желтух, их биохимическая характеристика.
5. Значение анализа билирубина для клинической практики.
6. Обезвреживание токсических веществ в печени; биотрансформация ксенобиотиков и эндогенных токсинов.
7. Функции почек, механизм и регуляция образования мочи.
8. Роль почек в регуляции гомеостаза.
9. Физико-химические свойства и химический состав мочи здорового человека и их изменения при заболеваниях почек и нарушениях процесса обмена в организме.
Студент должен уметь:
1. Определять содержание общего билирубина в сыворотке крови, объяснять значение данного анализа в диагностике желтух.
2. Определить наличие индикана в моче, по результатам анализа оценить обезвреживающую функцию печени.
3. Провести тимоловую пробу с сывороткой крови, обьяснить её значение в диагностике белоксинтезирующей функции печени.
4. Исследовать физико-химические свойства мочи.
5. Определить содержание общего азота мочи.
6. Определить наличие и количество глюкозы, белка, ацетона, наличие крови в моче.
7. Обосновать значение этих анализов в клинической практике.
Эталоны ответов на тесты и ситуационные задачи:
1. Имеет место повышение показателя, что наблюдается при вирусном гепатите, паренхимаозной желтухе.
2. Обезвреживающая функция печени не нарушена.
3. У больного паренхиматозная желтуха.
4. Механическая желтуха.
5. Наблюдается полиурия. Возможные причины: употребление мочегонных средств, сахарный диабет, несахарный диабет, некоторые нервные заболевания, болезни почек, употребление большого количества жидкости.
6. Удельный вес мочи повышен (гиперстенурия). Это возможно при потере воды организмом (длительное пребывание в горячем климате, рвота, диарея, высокая температура тела), при некоторых заболеваниях почек, сахарном диабете.
7. Увеличение содержания общего азота в моче может свидетельствовать о повышенном употреблении белковых продуктов или усиленном распаде белков в организме (лихорадочные состояния, злокачественные опухоли, туберкулезный процесс, рассасывание эксудатов и транссудатов).
8. Имеет место изостенурия, что может быть при тяжелой почечной недостаточности, когда почки теряют концентрационную способность и выделяют мочу с плотностью, которая не отличается от плотности первичной мочи.
9. Сочетание полиурии, глюкозурии и кетонурии возможно при недостаточности инсулина (сахарном диабете), при этом нарушается углеводный, белковый, липидный и водно-минеральный обмены, может возникнуть кетоз.
10. Заболевание, которое приводит к почечной недостаточности. Следствие - интоксикация организма (уремия).
Источники информации:
Основные:
- Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - Г.: Медицина, 1990. - 543 с.
- Савицкий И.В. Биологическая химия - К.: Высшая школа, 1982. -470 с.
- Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина. 1983 с. 97–100.
- Конспекты лекций.
- Веб-страница университета > Материалы для подготовки к практическим занятиям.
- Веб-страница университета > Презентации лекций.
Дополнительные:
1. Николаев А.Я. Биологическая химия. - М: Высшая школа, 1989. - 496 с.
2. Ленинджер А. Основы биохимии: Перевод с англ. - М.: Мир, 1985. - 1024 с.
Обсуждено и утверждено на заседании кафедры
«11» июня 2013 г. протокол № 13
Пересмотрено и утверждено на заседании кафедры
«29» августа 2013 г. протокол № 2