Методические указания

к практическим занятиям для студентов стоматологического факультета.

 

ЗАНЯТИЕ № 5  (практическое - 6 час.)

Темы:

1.     Специфические пути метаболизма липидов: катаболизм триацилглицеролов, фосфолипидов, стеридов. Транспортные формы липидов в крови. Регуляция липолиза. Окисление глицерола и жирных кислот. Биоэнергетика процессов. Биосинтез жирных кислот, триацилглицеролов, фосфолипидов.

2.     Биосинтез и биотрансформация холестерола. Метаболизм кетоновых тел. Регуляция и нарушения липидного обмена.

 

 Цель: Объяснять биохимические функции простых и сложных липидов в организме: участие в построении и функционировании биологических мембран клеток, резервная, энергетическая функции, использование в качестве предшественников в биосинтезе биологически-активных соединений липидной природы; биохимические закономерности внутриклеточного метаболизма липидов: катаболизм и биосинтез жирных кислот, триацилглицерола, фосфолипидов. Объяснить биохимические закономерности биосинтеза холестерола, его трансформацию с образованием биологически активных соединений. Усвоить сущность кетогенеза и использование кетоновых тел как альтернативных источников энергии. Объяснить диагностическое значение гиперхолестеринемии,кетонемии.

 

 Профессиональная ориентация студентов:

Причиной расстройств метаболизма липидов в организме часто является нарушение их пищеварения и всасывания, что в значительной мере зависит от присутствия желчных кислот. Поэтому исследование дуоденального содержимого имеет большое значение в диагностике заболеваний печени, желчных путей, поджелудочной железы. Содержание фосфолипидов в крови является важным показателем полноценного питания человека, функционального состояния печени, возможностей транспорта и обмена холестерина. Увеличение кетоновых тел в крови (а, следовательно, и в моче) является показателем усиления катаболизма жира в организме и в то же время несостоятельность использования тканями кетотел как альтернативных энергетических субстратов. Это обстоятельство и является причиной развития кетоза при голодании, сахарном диабете, длительных стрессах, тиреотоксикозе и др. Увеличение холестерина в крови является признаком нарушения обмена липидов, вызванного употреблением преимущественно животных жиров, углеводов, вредными привычками (курение, злоупотребление алкоголем) и др. и приводит к атеросклерозу и его осложнениям (ишемическая болезнь сердца, гипертония, инсульт).

 

Методика выполнения практической работы. - 9.00-12.00 час.

Выполнение практической работы проходит согласно с "Методическими указаниями для студентов" с обязательным выводом в конце каждой работы.

 

I Специфические пути метаболизма липидов:

катаболизм триацилглицеролов, фосфолипидов, стеридов. Транспортные формы липидов в крови. Регуляция липолиза.

 

 Работа 1. Исследование влияния желчи на активность липазы.

Принцип метода: Гидролиз жира сопровождается образованием свободных жирных кислот, количество которых постоянно увеличивается. Их определяют титрованием NaOH в присутствии фенолфталеина, который при нейтрализации кислот приобретает слабо-розовый цвет. В присутствии желчи липаза более активна и жир расщепляется быстрее.

Источником липазы служит вытяжка из поджелудочной железы, источником жира – молоко, жир которого находится в эмульгированом состоянии.

Техника работы.

В 2 пробирки наливают по 5 мл молока и по 1 мл 5% раствора вытяжки из поджелудочной железы. В первую пробирку добавляют 1 мл H₂O, во вторую – 1 мл желчи. Содержимое пробирок хорошо перемешивают. Из каждой пробирки в две другие отбирают по 1 мл смеси, добавляют в каждую 1-2 капли 0,5% фенолфталеина и титруют 0,05 н NaOH по каплям из пипетки до появления слабо-розового  цвета (НЕ ПЕРЕТИТРИРОВАТЬ!).     Записывают количество млNaOH, использованного на титрование в первой и во второй пробирках.

Пробирки с остатками первоначальной смеси помещают в водяную баню при 37 ºС. Через каждые 15 мин повторяют титрование смесей обеих пробирок так, как в первом случае, т. е. до начала гидролиза. Результаты титрования в мл заносят в таблицу:

 

Сравнивая результаты титрования, делают вывод о влиянии желчи на активность липазы.

 

Работа 2. Исследование наличия фосфолипаз в панкреатическом соке.

Принцип метода: О наличии фосфолипаз свидетельствует появление H₃PO₄, отщеплённого от фосфолипидов в результате их гидролиза. Неорганический фосфат  определяется молибденовой реакцией (образует жёлтый осадок при нагревании).

Техника работы.

В 2 пробирки вносят по 5 капель суспензии лецитина или яичного желтка. В первую пробирку добавляют 2 капли панкреатина, а во вторую – 2 капли H₂O (контроль). Обе пробирки помещают в водяную  баню при 37 ºС на 20 мин. После инкубации в обе пробирки вносят по 5 капель молибденового реактива, нагревают их в пламени горелки и затем охлаждают проточной водой. В одной из пробирок появляется жёлтый осадок. Объяснить результат.

 

Работа 3. Определение соотношения ЛПВП / ЛПНП.

Принцип  метода   основывается  на электрофоретическом разделении на фракции предварительно окрашенных суданом черным липопротеинов сыворотки крови со следующим определением оптической плотности экстрагированных фракций и расчетом процентного соотношения между   a  -ЛП и   b  - ЛП.

Исследуемый  материал,  реактивы, оборудование : сыворотка крови; веронал-мединаловий буфер рН 8,6 (10,32 граммов мединала и 1,84 граммов веронала растворяют в 1 л дистиллированной воды); раствор судана черного (0,4 граммов судану на 100 мл 960  этилового спирта, хранить в темной посуде в холодном месте); смесь абсолютного этанола с ледяной уксусной кислотой в соотношении 4:1; центрифужные пробирки; хроматографическая бумага; аппарат для электрофореза; ФЕК; центрифуга; сушильный шкаф.

Ход  работы. В центрифужную пробирку наливают 1 мл сыворотки, добавляют 1 мл раствора судана черного, перемешивают и оставляют на 1 час при комнатной температуре. Окрашенную сыворотку центрифугируют при 2500 об/хв., сверхосадочную жидкость сливают и наносят на горизантальноразмещенные полоски хроматографической бумаги для электрофоретического разделения липопротеинов на фракции. По окончании электрофореза полоски сушат на воздухе, а затем в сушильном шкафу в течение 15 минут при t⁰ 800⁰ .

На липопротеинограмме четко различают два темных пятна на белом фоне. Окрашенные участки вырезают, измельчают, помещают в пробирки, заливают 4 мл смеси этанола и уксусной кислоты и ставят в темное место на 1 час. Элюат фотометрируют на ФЭК  с красным светофильтром (650-660 нм) в кюветах толщиной0,5 см. Высчитывают процентное соотношение между   -a  -ЛП и   b  - ЛП, принимая сумму экстинкций за 100 %.

      У здоровых людей   a -ЛП в сыворотке крови составляют 25-30%   и     b  - ЛП  - 65-70%.

 

Клинико- диагностическое  значение. При  острых гепатитах, циррозе печенки, застойных желтухах наблюдается уменьшение  a  -ЛП в сыворотке крови. Увеличение фракции b -ЛП может иметь место при сахарном диабете, гипотиреозе, атеросклерозе и др.

 

ІІ Окисление глицерола и жирных кислот. Биоэнергетика процессов. Биосинтез жирных кислот, триацилглицеролов, фосфолипидов .

Работа 3. Определение общих фосфолипидов в сыворотке крови методом Блюра.

Принцип метода: Концентрацию фосфолипидов определяют по содержанию липидного фосфора, частица которого составляет 4% от молекулярной массыфосфолипида. Фосфолипиды экстрагируются из сыворотки крови спиртом, затем при нагревании в присутствии H₂SO₄ от них отщепляется H₃PO₄, которая определяется колориметрическим методом в реакции с молибдатом аммония и эйконогеном (продукт восстановления – молибденовая синька).

Техника работы.

В пробирку вносят 1 мл сыворотки крови и 2,5 мл этилового спирта.

Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой и ставят в кипящую водяную баню на 3-4 мин. Затем содержимое можно перенести вцентрифужную пробирку и процентрифугировать 5 мин, а можно профильтровать через бумажный фыльтр. Отбирают 2 мл прозрачного фильтрата (илинадосадочной жидкости после центрифугирования) в чистую пробирку, добавляют 5 капель концентрированной  H₂SO₄ и помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. Затем пробирку охлаждают проточной водой, переносят смесь в мерную пробирку, добавляют 1 каплю фенолфталеина и по каплям 10% NaOH до появления розового цвета. К смеси добавляют 2,5 мл молибдата аммония и 10 капель эйконогена (восстановитель), перемешивают, доводят объём до 10мл водой.

В другую пробирку вносят 1 мл стандартного раствора фосфора, добавляют 2,5 мл молибдата аммония, 10 капель эйконогена, доводят водой до 10 мл, перемешивают. Через 10 мин окрашенные в синий цвет растворы колориметрируют при красном светофильтре в кюветах толщиной10 мм против воды. Расчёт содержания общих фосфолипидов проводят за формулой:

 

               0,05  x Э _ОП

С_ОП  =  ____________ × 25, где:

                             Э_СТ­

                                                   

С_ОП – концентрация фосфолипидов в опыте (мг/мл или г/л);

Э _ОП – экстинкция опыта;

0,05 – содержание фосфора (мг) в 1 мл стандартного раствора;

Э_СТ­ – экстинкция стандарта;

25 – перерасчёт на общие липиды, исходя из того, что фосфор составляет 4% в составе фосфолипида.

Оценивают результаты, исходя из того, что в норме содержание общих липидов в сыворотке крови составляет 1,5-3,6 г/л.

 

ІІI Биосинтез и биотрансформация холестерола. Метаболизм кетоновых тел.

Работа 1. Качественная реакция на холестерин Сальковского

Принцип метода: Холестерин в присутствии водоотнимающих средств превращается в ненасыщенный углеводород, имеющий специфические цвета.

 

Техника работы.

В сухую пробирку вносят 1 мл  хлороформного раствора холестерина, наслаивают по стенке равный объём концентрированной H₂SO₄ и осторожно взбалтывают.После расслаивания смеси верхний (хлороформный) слой окрашивается в пурпурно-красный цвет, нижний (слой кислоты) – в желто-красный с зеленоватой флуоресценцией.

 

 Работа 2. Количественное определение холестерина в сыворотке крови методом Илька

Принцип метода: Холестерин в присутствии уксусного ангидрида и смеси уксусной и серной кислот образует соединение зелёного цвета, интенсивность которого прямо зависит от концентрации холестерина и определяется колориметрией.

Техника работы.

В 2пробирки вносят по 2 мл реактива №1(смесь ледяной уксусной кислоты - 1 часть, уксусного ангидрида - 5 частей, концентрированной серной кислоты - 1 часть).  и в первую пробирку добавляют  0,1 мл стандартного раствора холестерина, во вторую – 0,1 мл сыворотки крови.

Реактивы в обеих пробирках хорошо перемешивают, оставляют в темном месте при комнатной tº на 10-15 мин, после чего измеряют экстинкцию против воды  при красном светофильтре в кюветах 0,5 см.

 Расчёт ведут по формуле:

 

                                 Эоп × Сст

                  С_ОП    = ------------

                                     Эст                     , где:

 

 

С_ОП – концентрация общего холестерина в сыворотке (мг/100мл);

Э_ОП и Э_СТ – экстинкции опыта и стандарта;

С_СТ – концентрация стандартного раствора холестерина (180мг/100мл).

Для пересчёта в ммоль/л  используют коэффициент 0,0258.

Оценивают результат, исходя из того, что в норме концентрация холестерина в крови равна 3-7 ммоль/л.

 

ІІ Регуляция и нарушения липидного обмена.

Работа 3. Качественные реакции на кетоновые тела

а) Реакция Легаля на ацетон и ацетоуксусную кислоту.

Принцип метода: Ацетон и ацетоуксусная кислота образуют в щелочной среде с нитропруссидом натрия продукты, окрашенные в красный цвет. При добавлении концентрированной уксусной кислоты образуется комплексная соль вишнёвого цвета.

Техника работы.

Берут 2 пробирки, в одну вносят 0,5 мл мочи здорового человека, во вторую – 0,5 мл патологической мочи (больного сахарным диабетом). В обе пробирки добавляют по 0,5 мл 10% NaOH и  по 5 капель нитропруссида натрия. Наблюдают окрашивание в пробирках. Добавляют в обе пробирки по 5-6 капель концентрированной уксусной кислоты. Отмечают изменение цвета в пробирках. При сравнении их делают вывод о наличии или отсутствии в моче ацетона.

б) Реакция Герхарда на ацетоуксусную кислоту.

Принцип метода: При добавлении к моче раствора FeCl₃ выпадает в осадок фосфат железа  (FeРО₄). При наличии ацетоуксусной кислоты после добавления избытка FeCl₃ появляется вишнёво-красное окрашивание (при лёгком нагревании реакция проходит активнее).

Техника работы.

Берут 2 пробирки. В первую вносят 2 мл мочи здорового человека, во вторую – 2 мл мочи больного сахарным диабетом. В каждую пробирку добавляют по каплям 10% FeCl₃. Образовавшийся осадок фосфатов отфильтровывают с помощью бумажного фильтра. К фильтрату добавляют еще несколько капель FeCl₃, наблюдают появление окрашивания. При сравнении цвета в обеих пробирках делают вывод о наличии или отсутствии ацетоуксусной кислоты в моче.

 

Работа 4. Количественное определение кетоновых тел в моче

Принцип метода: Ацетон в присутствии нитропруссида натрия и уксусной кислоты при наслаивании аммиака образует фиолетовое кольцо, скорость появления которого зависит от концентрации ацетона. Установлено, что появления кольца между 3-4 мин соответствует содержанию ацетона 8,5 мг /1 л мочи.

Техника работы.

Берут 5 пробирок, в каждую вливают по 1 мл Н₂О. В первую добавляют мочу, содержащую ацетон (!), перемешивают, получают разведение мочи в 2 раза. Отбирают 1 мл этой мочи из первой пробирки и переносят во вторую, перемешивают, получая разведение в 4 раза. Из этой пробирки 1 мл мочи переносят в третью (разведение в 8 раз) и так до последней. Из последней пробирки 1 мл смеси выливают (во всех пробирках остаётся по 1 мл смеси). Затем во все пробирки добавляют по 8 капель 50% (NH₄)₂SO₄, по 8 капель нитропруссида натрия и по 8 капель концентрированной уксусной кислоты. Содержимое пробирок перемешивают и в каждую по стенкам наcлаивают по 0,5 мл концентрированного аммиака, начиная из последней пробирки. К концу 4 мин отмечают последнюю пробирку, где еще заметно фиолетовое кольцо.

Расчёт ведут по формуле:

Х = 8,5 ×а × 1,5

Х – концентрация ацетона в моче (мг/сутки);

8,5 – эмпирическое число;

а – разведение мочи;

1,5 – пересчёт на суточное количество мочи (1,5 л).

По результатам делают вывод о количестве ацетона в исследуемой моче, исходя из того, что у здоровых людей оно не превышает 40 мг в сутки.

Гиперкетонемия и кетонурия наблюдаются при сахарном диабете, дефиците углеводов в питании, расстройствах желудочно-кишечного тракта, перепроизводстве гормонов-антагонистов инсулина (кортикостероидов, тироксина, гормонов передней доли гипофиза и других). Снижение количества кетоновых тел не имеет клинического значения. В раннем детском возрасте длительные расстройства желудочно-кишечного тракта (токсикоз, дизентерия) могут привести к кетонемии в результате хронического голодания и истощения.

 

 

Программа самоподготовки студентов к занятию

I Специфические пути метаболизма липидов: катаболизм триацилглицеролов, фосфолипидов, стеридов. Транспортные формы липидов в крови. Регуляция липолиза.

1.           Классификация липидов по строению, физиологическим функциям, представители каждой группы.

2.           Место и условия, необходимые для пищеварения липидов. Роль печени и поджелудочной железы.

3.           Пищеварение триацилглицеринов, фосфолипидов, стеридов, назвать соответствующие ферменты.

4.           Строение, главные представители и роль желчных кислот.

5.           Назвать конечные продукты пищеварения липидов, механизм их всасывания. Холеиновые комплексы.

6.           Транспортные формы липидов крови, место  их образования, строение и структура, роль белков.

7.           Атерогенные и антиатерогенные липопротеины, объяснить их функцию. Роль липопротеинлипазы, гепарина, ЛХАТ в превращении транспортных форм.

8.           Принцип определения ЛПВП/ЛПНП, диагностическое и прогностическое значение показателя.

9.           Роль гепатоэнтеральной циркуляции желчных кислот.

10.      Ресинтез липидов в энтероцитах, печени, жировой ткани.

11.      Катаболизм триацилглицеролов в адипоцитах, регуляция липолиза.

ІІ Окисление глицерола и жирных кислот. Биоэнергетика процессов. Биосинтез жирных кислот, триацилглицеролов, фосфолипидов.

1.     Окисление глицерина в аэробных и анаэробных условиях, энергетический баланс.

2.     Окисление насыщенных жирных кислот с парным и непарным количеством углеродных атомов. Энергетический баланс, роль витаминов.

3.     Окисление моно- и полиненасыщенных жирных кислот. Механизм ПОЛ.

4.     Биосинтез пальмитиновой кислоты, локализация в клетке. Структура и механизм действия пальмитатсинтетазы.

5.     Элонгация жирных кислот, локализация в клетке. Синтез ненасыщенных жирных кислот.

6.     Биосинтез триацилглицеролов, фосфолипидов.

ІІI Биосинтез и биотрансформация холестерола. Метаболизм кетоновых тел

1.     Содержание холестерина в крови, его транспортные формы, биологические функции.

2.     Биосинтез холестерина: схема реакций, локализация процесса, регуляция.

3.     Пути биотрансформации холестерина: образование желчных кислот, стероидных гормонов, витамина D₃.

4.     Методы определения холестерина в крови, диагностическое значение

5.     Представители кетоновых тел, место и механизм кетогенеза, его назначение.

6.     Механизмы использования ацетоуксусной кислоты в тканях с целью извлечения энергии (кетолиз).

7.     Суть качественного и количественного определения кетоновых тел в моче.

8.     Нарушение обмена кетоновых тел в условиях патологии (сахарный диабет, голодание и др.).

 

 Семинарское обсуждение теоретических вопросов: 12³⁰-14⁰⁰ час.

 

Образцы тестовых заданий и ситуационных задач.

1. В рационе человека отсутствуют растительные масла. Каких незаменимых веществ не получает организм?

2. У больного закупорка общего желчного протока. Какие расстройства в обмене липидов это повлечет?

3. Человек употребляет много сладостей. Как это отобразится на обмене липидов?

4. Конъюгаты желчных кислот образуются присоединением к ним:

А. Глицина, аланина

В. Цистеина, глицина

С. Таурина, глицина

Д. Серина, аланина

Е. Глюкуроновой кислоты

5. У больного содержание холестерина в крови составляет 12 ммоль/л. Дать клиническую интерпретацию анализа, указать возможные причины и последствия для организма.

6. К кетоновым телам относят:

А. Ацетоацетат, b-оксибутират, ацетон

В. Ацетоацетат, сукцинат, ацетон

С. Ацетон, фумарат, b-оксибутират

Д. b-оксибутират, малат, ацетоацетат

Е. Ацетоацетат, цитрат, сукцинат

7. У больного сахарным диабетом имеется угроза развития ацидоза вследствие гиперкетонемии. Ограниченное усвоение кетоновых тел тканями происходит вследствие дефицита:

А. Оксалоацетата

В. Ацетил-КоА

С. Цитрата

Д. Глюкоза

Е. Жирных кислот

8. У 52-летнего пациента в последние месяцы значительно увеличилась масса тела, появилась одышка, быстрая утомляемость. Какая погрешность в диете могла вызвать такое состояние?

 

Cамостоятельная работа студентов: 14.15 – 15.00 час.

 

Студент должен знать:

1. Катаболизм триацилглицеролов, фосфолипидов, стеридов в желудочно-кишечном тракте, в адипоцитах жировой ткани: последовательность  реакций, роль печени и поджелудочной железы. Регуляция липолиза в адипоцитах.

2. Окисление глицерола, жирных кислот, биоэнергетика процессов, ПОЛ.

3. Биосинтез жирных кислот, триацилглицеролов и фосфоглицеридов: локализация, субстраты, ферментные комплексы, связь с углеводным обменом.

4. Транспортные формы липидов в крови.

 

Студент должен уметь:

1. Определить активность липазы и наличие фосфолипаз в пищеварительном соке поджелудочной железы и доказать зависимость активности липазы от желчных кислот.

2. Определить концентрацию фосфолипидов в крови и анализировать клиническое значение данного показателя.

3. Определять процентное соотношение ЛПВП / ЛПНП, анализировать диагностическое значение данного показателя.

4.   Определить содержание кетоновых тел в моче и обосновать диагностическое значение этого показателя.

5. Определить содержание холестерина в крови, анализировать диагностическое значение данного показателя

 

 

  Эталоны ответов на тесты и ситуационные задачи:

1. Полиненасыщеных жирных кислот, которые в организме не синтезируются.

2. Нарушается эмульгирование жиров, снижается активность липазы, то есть тормозится расщепление и всасывание липидов. Возникает стеаторея, гиповитаминоз жирорастворимых витаминов, истощение.

3. Избыток углеводов создает условия для усиленного синтеза жира, холестерина. Развивается ожирение, атеросклероз и связанные с этим болезни.

4. С.

5. Имеет место гиперхолестеринемия. Это могло повлечь избыточное употребление углеводов, животных жиров, уменьшение α-липопротеинов. Вследствие этого может развиться атеросклероз и его осложнения (ишемическая болезнь сердца, гипертония, инсульт и др.).

6. А

7. А

8. Это могло быть вызвано чрезмерным употреблением легкоусваиваемых углеводов, которые превращаются в жир.

 

  Источники информации:

Основные:

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - Г.: Медицина, 1990. - 543 с.

2. Савицкий И.В. Биологическая химия - К.: Высшая школа, 1982. -470 с.

3. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина. 1983 с. 97–100.

4. Конспекты лекций.

5. Веб-страница университета > Материалы для подготовки к практическим занятиям.

6. Веб-страница университета > Презентации лекций.

Дополнительные:

1.     Николаев А.Я. Биологическая химия. - М: Высшая школа, 1989. - 496 с.

2.     Ленинджер А. Основы биохимии: Перевод с англ. - М.: Мир, 1985. - 1024 с.

  

Методическое указание составила доц. Яворская С.И

 

Обсуждено и утверждено на заседании кафедры

«11» июня  2013 г. протокол № 13

Пересмотрено и утверждено на заседании кафедры

«29» августа   2013 г. протокол №  2