Методические указания

 

Методические указания

к практическим занятиям для студентов стоматологического факультета.

 

ЗАНЯТИЕ № 1 (практическое - 6час.)

 

Тема 1: Предмет, задачи, основные этапы и современные направления развития биохимии. Строение и физико-химические свойства белков-ферментов. Механизм действия ферментов, кинетика ферментативного катализа. Регуляция активности ферментов.

 

Тема 2: Ферментативные процессы по типу реакции основных классов ферментов. Единицы измерения каталитической активности ферментов. Механизм возникновения энзимопатий. Энзимодиагностика, энзимотерапия.

 

Цель: Уметь исследовать при помощи качественных реакций зависимость действия ферментов от температуры и природы субстрата. Уметь исследовать зависимость действия фермента амилазы от рН среды и присутствия модификаторов, объяснять значение этих свойств в медицинской практике. Объяснять изменения хода ферментативных процессов и накопления промежуточных продуктов метаболизма при врожденных (наследственных) и приобретенных пороках метаболизма - энзимопатиях. Анализировать изменения активности индикаторных ферментов плазмы крови при патологиях определенных органов и тканей.

 

Профессиональная ориентация студентов:

Ферменты являются участниками всех химических реакций, которые лежат в основе жизнедеятельности. Белковая природа ферментов определяет их высокую лабильность, чувствительность к разным воздействиям и смену активности при  патологических состояниях организма. Определение активности ферментов в биологических жидкостях организма широко применяется в клинической практике с диагностической целью, проверки эффективности лечения. Для достоверности таких анализов важно придерживаться оптимальных условий их проведения, подбор субстратов, оптимального рН среды. Заболевания в той или иной мере сопровождаются нарушением биоэнергетических процессов, что катализируются оксидоредуктазами. Знания функций этих ферментов и факторов, влияющих на них, позволяют предупреждать и корректировать патологические процессы. Исследование диастазы, правильная трактовка результатов есть основой своевременной диагностики острого панкреатита, инфекционного паротита, злокачественных опухолей слюнных желез.

Исследование активности каталазы, пероксидазы дает представление о состоянии антиоксидной защиты организма, и понижение этих показателей есть признаком генетического их дефекта, заболеваний на туберкулез, злокачественные опухоли, анемию.

Знание оптимальных условий каталитической активности ферментов является важной предпосылкой понимания патогенеза болезни и обосновывает выбор методик исследования ферментов с диагностической целью.

 

Методика выполнения практической работы.- 9.00-12.00 час.

 

Работа 1. Выявление амилазы в слюне.

Фермент амилаза постепенно гидролизует крахмал через промежуточные продукты (декстрины) к мальтозе. Последняя под воздействием фермента мальтазы расщепляется на 2 молекулы глюкозы. Нерасщепленный крахмал дает с иодом синее окрашивание. Декстрины, в зависимости от величины молекул, дают с йодом разные окрашивания: амилодекстрины-фиолетовоееритродекстрины-красно-бурое, ахродекстрины-желтое (цвет йода в воде). Конечные продукты гидролиза крахмала - мальтоза и глюкоза имеют свободные альдегидные группы и могут быть обнаружены реакциями Тромера или Фелинга.

 

Принцип метода. О наличии амилазы в слюне свидетельствует расщепление в ее присутствии крахмала, на что указывает в конечном результате негативная реакция с йодом или позитивная реакция Тромера или Фелинга.

Исследуемый материал, реактивы, обладнання- слюна; 1% раствор крахмала; 10% раствор NаОН (или КОН) и 1% раствор сульфата меди, или реактив Фелинга; 0,1% раствор йода в 0,2% растворе йодида калия; термостат или водяная баня; пипетки; пробирки; цилиндр на 10 или 25 мл.

 

Ход работы.   Берут 2 пробирки. В одну из них (опыт) набирают 1 мл слюны, предварительно разведенной в 10 раз. В друге (контроль) наливают 1 мл дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 1 мл 1% раствора крахмала и ставят на 10 мин в водяную баню при 37оС. После инкубации содержание пробирок делят на 2 ровных половины. С одной половиной растворов выполняют качественную реакцию на крахмал, а из другой-реакцию на продукты его гидролиза (Тромера или Фелинга).

 

Реакция на крахмал  (иодная проба).

К 1 мл исследуемого раствора добавляют 1-2 капли иода в иодиде калия. При наличии крахмала появляется синяя расцветка.

 

Реакция Тромера.

Принцип основывается на восстановлении гидроксида меди(ІІ) до оксида меди(І) за счет окисления альдегидной  группы глюкозы или мальтозы.

Ход работы. К 1 мл исследуемого раствора добавляют 1 мл 10% NаОН и 0,5 мл 1% СuSO4. Осторожно нагревают верхнюю часть смеси к моменту закипания. При наличии глюкозы или мальтозы появляется кирпично-красная расцветка (позитивная реакция).

 

Реакция Феллинга. Принцип аналогичен реакции Троммера. Преимуществом реакции Феллинга является то, что медь связана с сегнетовой солью и не образует при избытке реактива Феллинга окиси меди черного цвета, который маскирует основную реакцию.

 

Ход работы. До 1 мл исследуемого раствора добавляют равный объем реактива Феллинга и осторожно нагревают пробирку до закипанию смеси. При наличии глюкозы или мальтозы наблюдается образование кирпично-красного осадка.

 

Работа 2. Исследовать влияние температуры на активность амилазы слюны.

Одним из характерных свойств ферментов есть термолабильность, то есть чувствительность к изменениям температуры. Температура, при которой наблюдается максимальная скорость ферментативной реакции, называется оптимальной. Для большинства ферментов ее значение лежит в пределах 35-40о С. При повышении температуры белковая часть фермента может денатурировать и он теряет каталитические свойства. При снижении температуры активность резко снижается.

Принцип метода. О зависимости активности амилазы слюны от температуры судят за расщеплением под ее влиянием крахмала в разных температурных условиях. Степень расщепления крахмала обнаруживают йодокрахмальной реакцией или реакцией Фелинга.

Исследуемый материал, реактивы, оборудование: слюна; 1% раствор йода в йодиде калия; 0,5% раствор крахмала; реактив Фелинга; термостат или водяная баня; лед; пипетки; пробирки; водяной термометр.

Ход работы.

Набирают в пробирку 1 мл слюны и разводят ее в 10 раз, добавляя 9 мл воды. В другую пробирку отбирают 1 мл этой разведенной слюны и кипятят ее в течение 1-2 мин, после чего охлаждают проточной водой.

В четыре другие чистые пробирки наливают по 1 мл 0,5% раствора крахмала. В первую и вторую добавляют по 1 мл разведенной слюны (приготовленной в самом начале работы). В третью пробирку добавляют 1 мл кипяченой слюны, в четвертую-1 мл воды (контроль). Первую пробирку вмещают в стакан с льдом, остальные три пробирки - в водяную баню при t 38о С на 10 мин. После этого содержание каждой из 4-х пробирок делят на 2 равных части. С первой половиной растворов проводят реакцию с йодом, а со второй половиной- реакцию Феллинга. Отмечают цвет в обеих рядах пробирок. Результаты заносят в таблицу:

 

п/п

Фермент

Субстрат

Температурные условия

Результат реакции с йодом

Результат реакции Феллинга

1.

Амилаза

Крахмал

00

 

 

2.

Амилаза

Крахмал

370

 

 

3.

Амилаза

Крахмал

1000

 

 

4.

Н2О 

Крахмал

370

 

 

 

Работа 3. Исследовать влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.

Принцип работы. Активирующий влияние хлористого натрия и ингибирующее-сернокислой меди на активность амилазы определяют за степенью расщепления крахмала, о чем свидетельствуют результаты реакции с йодом.

Исследуемый материал, реактивы, оборудование-слюна; 1% раствор NаСI; 1% раствор CuSO4; 1% раствор крахмала; 1% раствор йода в иодиде калия; мерный цилиндр; пипетки; пробирки; водяная баня или термостат; водяной термометр.

Ход работы. Развести слюну в цилиндре в 40 раз (в зависимости от активности слюны ее можно развести в 10, 20, 30, 50 раз). В три пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны. В первую пробирку добавляют 2 капли воды (контроль); в другую - 2 капли 1% раствора NаСI; в третью-2 капли 1% раствора СuSO4. Дальше в каждую пробирку добавляют по 5 капель 1% раствора крахмала. Все три пробирки помещают в водяную баню при 38о С на 5 мин. После инкубации во все пробирки добавляют по 1-2 капли раствора йода, перемешивают, наблюдают за расцветкой, за которой и определяют присутствие в пробе активатора или ингибитора. Можно добавить в каждую пробирку 1-2 мл воды - окрашивание будет более выразительно.

 

Работа 4. Исследовать влияние рН среды на активность амилазы слюны.

Фермент проявляет максимальную активность при оптимальном значении рН. Каждый фермент имеет свой оптимум рН: пепсин - 1,5-2,5; аргиназа-9,5; амилаза-6,8-7,0. С изменением рН меняется степень диссоциации ионогенных групп, фермент изменяет свою конфигурацию, в том числе, активного центра, который предопределяет снижение или потерю его каталитических свойств.

Принцип метода. Оптимум рН для амилазы слюны можно установить за расщеплением крахмала при разных значениях рН среды. Степень гидролиза крахмала оценивается за результатом реакции с йодом. При оптимальном значении рН расщепление крахмала происходит полностью (расцветка с йодом отсутствует). По мере отдаления от оптимума рН в кислую  или щелочную сторону расщепления крахмала проходит частично, к стадии декстринов (фиолетовая или красно-бурая расцветка) или крахмал вообще не расщепляется (синяя расцветка).

Исследуемый материал, реактивы, оборудование - 0,2М Nа2НРО4; 0,1М раствор лимонной кислоты; 0,5% раствор крахмала; 0,1% раствор йода в 0,2% растворе иодида калия; термостат или водяная баня; пробирки; пипетки; мерный цилиндр; водяной термометр.

Ход работы. Берут 6 пробирок и готовят буферные растворы с разным значением рН согласно таблицы:

 

Таблица  Приготовления буферных растворов

 

п/п

Количество 0,2М Nа2НРО4, мл

Количество 0,1М лимонной кислоты, мл

рН растворов

1.

0,63

0,37

6,0

2.

0,69

0,31

6,4

3.

0,77

0,23

6,8

4.

0,87

0,13

7,2

5.

0,94

0,06

7,6

6.

0,97

0,03

8,0

 

В каждую пробирку приливают по 1 мл 0,5% раствора крахмала и по 1 мл слюны (предварительно разведенной в 50 раз). Содержание пробирок перемешивают и вмещают в термостат или водяную баню на 10 мин. при 37о С. После инкубации во все пробирки добавляют по 1 капле раствора йода, перемешивают. Наблюдают расцветку и отмечают рН, при котором амилаза действует наиболее активно. Чтобы расцветка была более выразительной, можно в каждую пробирку добавить по 1-2 мл воды.

 

Работа 5. Исследовать специфичность действия амилазы и сахаразы.

Специфичностью называется способность ферментов катализировать определенные химические реакции. Различают абсолютную, относительную, специфичность стереохимии. Специфичность предопределена белковой частью ферментов, а также строением их активного центра. Только некоторые четко определены функциональные группы ферментов могут принимать участие в образовании фермент-субстратних комплексов. Амилаза ускоряет гидролиз только полисахаридов (крахмала, гликогена) и не действует на олигосахариды. Мальтаза гидролизует расщепление мальтозы, но не действует на сахарозу.

Принцип метода. О специфичности амилазы и сахаразы свидетельствует их выборочное действие на субстраты. Продукты гидролиза субстратов определяются реакциями Троммера или Феллинга.

Исследуемый материал, реактивы, оборудование - слюна; вытяжка из дрожжей; 0,5% раствор сазарозы; 1% раствор крахмала; 10% раствор NаОН и 1% раствор CuSO4 (или реактив Феллинга); термостат или водяная баня; пробирки; пипетки; водяной термометр.

 

Специфичность амилазы

Ход работы.

В 2 пробирки вмещают по 1 мл слюны, разведенной в 5 раз. В первую пробирку добавляют 1 мл 1% крахмала, в другую-1 мл 0,5% раствора сахарозы. Обе пробирки ставят в термостат или водяную баню на 15 мин при t0 380С, после чего с содержанием пробирок выполняют реакцию Феллинга. Отмечают, с каким субстратом реакция позитивная.

Специфичность сахаразы

Ход работы. В 2 пробирки наливают по 1 мл вытяжки из дрожжей. В первую пробирку добавляют 1 мл 0,5% раствора сахарозы, в другую-1 мл 1% раствора крахмала. Обе пробирки ставят в термостат или водяную баню на 15 мин при t 38о С, после чего с содержанием пробирок выполняют  реакцию Феллинга. Отмечают, с каким субстратом реакция позитивная.

 

Результаты опытов заносят в таблицу:

 

п/п

Фермент

Субстрат

Результат р-ции Фелинга

Вывод

1.

Амилаза

Крахмал

 

 

2.

Амилаза

Сахароза

 

 

3.

Сахараза

Сахароза

 

 

4.

Сахараза

Крахмал

 

 

 

ІІ. Ферментативные процессы по типу реакци основных классов ферментов. Единицы измерения каталитической активности ферментов. Механизм возникновения энзимопатий. Энзимодиагностика, энзимотерапия.

 

Работа 6. Выявление каталазы в крови.

Выявление каталазы в крови.

Фермент каталаза относится к классу оксидоредуктаз. Содержится во всех тканях и жидкостях организма, но больше всего в строме эритроцитов и печени. В процессе окисаления некоторых веществ образуется пероксид водорода,  токсичный для организма. Каталаза (Н2О2:Н2О2-оксидоредуктаза) разлагает пероксид водорода :

                                  

                                   каталаза

                      2 Н2О2-----------------  2 Н2О + О2

 

Принцип метода. При взаимодействии каталазы крови с пероксидом водорода в пробирке выделяются пузырьки кислорода, который свидетельствует о наличии фермента в исследуемой жидкости.

Исследуемый материал, реактивы, оборудование - кровь; 3% раствор пероксида водорода; пробирки; пипетки.

Ход работы. В две пробирки наливают по 1 мл дистиллированной воды, добавляют по 2 капли крови. Содержание одной пробирки кипятят 1-2 мин. для инактивации фермента. После охлаждения в обе пробирки добавляют 5-10 капель 3% раствора пероксида водорода, встряхивают и наблюдают за выделением пузырьков газа. В пробе, которую кипятят, выделение пузырьков не наблюдается. Для доказательства того, что выделенный газ - кислород, пробирку закрывают пальцем на 20-30 сек, после чего открывают и быстро подносят к ней тлеющую спичку. Вспыхивание спички свидетельствует, что выделяется кислород.

 

Работа 2. Выявление пероксидазы в крови.

Выявление пероксидазы в крови.

К пероксидазам относятся ферменты, которые катализируют окисление субстратов в присутствии пероксида водорода (субстрат: Н2О2-оксидоредуктаза).

                                 Н           Н2О2

                    Суб.          ------------------ суб. окисленный + 2Н2О

                                Н     пероксидаза

 

В реакциях выявления пероксидаз применяют такие вещества, которые изменяют при окислении свою расцветку (фенолы, полифенолы, бензидин). Пероксидаза присутствует главным образом в растениях. У животных обнаруженная в эритроцитах, есть также в молоке.

Принцип метода.  Наличие пероксидазы в крови выявляется реакцией окисления бензидина в присутствии пероксида водорода. Продукты  окисления  бензидина окрашивающиеся в зеленый, синий цвет, который постепенно переходит в бурый.

Исследуемый материал, реактивы, оборудование: кровь, разведенная водой в 10 раз; 3% раствор пероксида водорода; 1% раствор бензидина в ледяной уксусной кислоте; пробирки; капельницы.

 

Ход  работы.   В две пробирки наливают по 5 капель 1% раствора бензидина и по 5 капель 3% раствора пероксида водорода. В первую пробирку добавляют 5 капель разведенной крови, а в другую -5 капель воды. Наблюдают за изменением расцветки.

 

Работа 7. Определение активности каталазы крови.

Каталаза (Н2О2: Н2О2 -оксидоредуктаза) расщепляет пероксид водорода с образованием молекулярного кислорода и воды:

                                    каталаза

                      2 Н2О2 ---------------  О2 + 2Н2О

 

Простетическая группа каталазы построена по типу гемма гемоглобина. Этот фермент содержится во всех тканях организма, но наиболее активным он является в эритроцитах и печени. Биологическая роль каталази заключается в обезвреживании пероксида водорода, который образуется в процессе окислительно-восстановительных реакций в организме. Активность каталазы выражают каталазным числом и показателем каталазы. Каталазным числом называется количество миллиграмм перекиси водорода, которая раскладывается каталазой в 1 мкл крови за 30 мин. В норме оно равняется 10-15. Показателем каталазы называют дробь, в котором числителем является  каталазне число, а знаменателем исло миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.

 

Определение каталазного числа.

Принцип метода. Активность каталази крови определяют за количеством разложенной перекиси водорода за единицу времени. Количество перекиси водорода определяется титрометрическим методом согласно реакции:

 

  2 КМnО4+5 Н2О2+4Н2SО4-------2КНSО4 + 2МnО4 +8Н2О + 5О2

 

Разница количества КМnО4, использованная на титрование к и после действия каталазы, характеризует активность фермента. Более объективной единицей является показатель каталазы, а не каталазное число, так как фермент находится почти исключительно в эритроцитах.

Исследуемый материал, реактивы, оборудование - кровь; 1% раствор перекиси водорода; 10% раствор серной кислоты; 0,1н раствор перманганата калия; колбочки или стаканы на 50 мл; мерная колба емкостью 100 мл; микропипетки; пипетки; микробюретки.

Ход работы. Разведение крови в 1000 раз: в мерную колбу емкостью 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и добавляют 0,1мл крови. Перемешивают, доливают дистиллированной водой к метке (1 мл гемолизата содержит 1 мкл крови). В две колбочки наливают по 1 мл разведенной крови, доливают по 7 мл дистиллированной воды и по 2 мл 1% раствора перекиси водорода. В контрольную пробу (первая колбочка) сразу же наливают 5 мл 10% раствора серной кислоты (действие каталазы в кислой среде прекращается). Колбочки оставляют при комнатной температуре на 30 мин, периодически перемешивая. Потом в другую колбочку (опыт) доливают 5 мл 10% раствора Н2SО4. Содержание каждой колбочки титруют 0,1н раствором КМnО4 до появления розового цвета. Рассчитывают каталазное число (КЧ) за формулой:

 

                              КЧ = (А-В) 1,7

 

где А - количество 0,1н КМnО4, которое пошло на титрование

           контрольной пробы;

     В - количество 0,1н КМnО4, которое пошло на титрование опытной

           пробы.

Примечание: Грам-эквивалент перекиси водорода равняется 17 граммам.

Следовательно, в 1 мл 0,1н раствора содержится 1,7 мг Н2О2. Поскольку 1 мл 0,1н КМnО4 эквивалентный 1 мл 0,1н Н2О2, то, умножив 1,7 мг на разницу между количеством КМnО4, использованного на титрование контрольной и опытной проб, получают количество мг Н2О2, которая расщепляется 1 мкл крови, то есть непосредственно каталазное число.

 

Клинико-диагностическое значение. Активность каталазы снижается при анемии, туберкулезе, раковых заболеваниях.

 

Работа 8. Определение активности амилазы мочи колориметрическим методом Каравея.

 

Принцип метода  основан на колориметрическом определении остатка нерасщепленного крахмала за интенсивностью его окрашивания с иодом. За единицу диастазы мочи принято количество граммов крахмала, расщепленного амилазой в 1 л мочи за 1 час. В норме она равняется 20-160 граммов/л час.

Исследуемый материал, реактивы, оборудование - моча; субстратно-буферный раствор; основной раствор иода - 0,1н; рабочий раствор иода - 0,01н; 1н HCI; пробирки; пипетки; водяная баня или термостат; ФЕК; водяной термометр.

Ход работы. - за таблицей. Реактивы - в мл.

 

Реактивы

Контроль

Опыт

Субстратно-буферный раствор

2

2

Инкубация в водяной бане 5мин при 37о С

Моча, разведенная в 5 раз

-

0,1

Перемешивание, инкубация в водяной бане 6 мин при 37о С

1н HCI для остановки реакции

3,9

3,9

Моча, разведенная в 5 раз

0,1

-

Рабочий раствор иода

0,1

0,1

    

Перемешать, колориметрировать при 630-690 нм в кювете толщиной 10 мм против дистиллированной воды.

 

Расчет:

 

                                          Ек - Ео

              Диастаза   =   -------------- х 5  х 160

               грамм/л час             Ек

 

где Ек - экстинкция контроля;

     Ео - экстинкция опыта;

       5 - разведение мочи;

     160 - расчетный коэффициент на 1 л мочи и 1 час инкубации.

 

 

Программа самоподготовки студентов к занятию

1.     Понятие о ферментах. Общие и отличительные свойства ферментов и неорганических катализаторов.

2.     Химическая природа и строение ферментов. Кофакторы (коферменты и простетические группы).

3.     Роль апофермента и кофактора в каталитических реакциях.

4.     Современные представления о механизме действия ферментов (теория фермент-субстратного комплекса).

5.     Активные центры ферментов, группы, которыми они представлены, их условные участки.

6.     Структурная комплементарность ферментов и субстратов (теории Фишера и Кошланда).

7.     Аллостерические ферменты, регуляторные (модуляторные) центры.

8.     Множественные формы ферментов (изоферменты).

9.     Мультиферментные комплексы. Полифункциональные ферменты, их преимущества. Примеры.

10.           Термолабильность ферментов. Использование явления термолабильности в медицинской практике.

11.           Специфичность действия ферментов. Виды специфичности.

12.           Регуляция активности ферментов:

а) чувствительность к изменению рН среды, объяснить механизм;

б) проферменты, примеры, механизм их активации;

в) аллостерические модификаторы ферментов, принцип их действия, примеры;

г) конкурентные и неконкурентные ингибиторы, механизм их действия, примеры;

д) регуляция активности ферментов при участии циклических нуклеотидов;

е) принцип обратной (негативной и позитивной) связи в саморегуляции активности ферментов.

13.           Принцип исследования термолабильности амилазы слюны и специфичности амилазы и сахаразы.

14.           Принцип исследования влияния рН среды, активаторов и ингибиторов на действие ферментов, использования этих свойств в медицине.

15.           Принцип международной классификации и номенклатуры ферментов. Классы ферментов.

16.           Гидролазы. Механизм действия эстераз, пептидаз, гликозидаз. Примеры.

17.           Тканевая и внутриклеточная локализация гидролаз, их роль в обмене веществ.

18.           Оксидоредуктазы: дегидрогеназы, оксидазы, пероксидазы. Примеры.

19.           Химическое строение оксидоредуктаз, их коферментые и простетические группы.

20.           Роль оксидоредуктаз в процессах биологического окисления.

21.           Принцип качественного выявления каталазы, пероксидазы, цитохрома с в биологических жидкостях.

22.           Органоспецифичность ферментов.

23.           Локализация ферментов в клеточных структурах.

24.           Адаптивные и конституционные ферменты. Примеры.

25.           Принцип и критерии количественного определения ферментов. Единицы измерения.

26.           Каталаза: строение, свойства, биологическая роль.

27.           Принцип определения каталазы крови, единицы измерения, диагностическое значение.

28.           Происхождение ферментов крови. Примеры.

29.           Нарушение хода ферментативных процессов: врожденные (наследственные) и приобретенные энзимопатии (фенилкетонурия, алкаптонурия, галактоземия, альбинизм), врожденные пороки метаболизма, их клинико-лабораторная диагностика.

30.           Ферментная диагностика заболеваний сердца, печени, поджелудочной  и слюнных желез, мышц,  костной системы.

31.           Энзимотерапия - использование ферментов и коферментов в качестве лекарственных средств.

 

Семинарское обсуждение теоретических вопросов:  12.30-14.00 час. 

 

Образцы тестовых заданий и ситуационных задач.

1. Общими свойствами ферментов и неорганических катализаторов являются:

А. Термолабильность

В. Катализ только термодинамически возможных реакций

С. Специфичность действия

Д. Зависимость от количества субстрата

Е. Зависимость от эфекторов.

2. В организме человека выявлен дефицит витамина В5. Это повлечет нарушение синтеза коферментов:

А. ТПФ

В. НАД и НАДФ

С. ПАЛФ

Д. ПАМФ

Е. Убихинона

3. В первую пробирку с крахмалом и во вторую с сахарозой добавили фермент. Через 10 мин. с содержанием обеих пробирок выполнили реакцию Фелинга. В первой пробирке она оказалась позитивной, во второй - негативной. Какой фермент прибавили в пробирки?

4. К двум пробиркам с определенными субстратами прибавили вытяжку из дрожжей. Через 10 мин. с содержанием обеих пробирок выполнили реакцию Фелинга. В первой пробирке она оказалась позитивной, во второй - негативной. Какие субстраты находились в пробирках?

5. В инкубационную среду «янтарная кислота + сукцинатдегидрогеназа» прибавили малоновую кислоту. Почему тормозится действие фермента? Является ли этот процесс обратным, при каких условиях?

6. При инфекционных заболеваниях рекомендуют употреблять сульфаниламидные препараты. На чем основывается их лечебное действие?

7. Дегидрогеназы - это ферменты, что:

А. Отщепляют СО2

В. Отщепляют воду

С. Присоединяют кислород

Д. Присоединяют воду

Е. Отщепляют атомы водорода или электроны

8. Пероксид водорода инактивируется в организме:

А. Церулоплазмином

В. Каталазой

С. Глутатион редуктазой

Д. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой

Е. Супероксиддисмутазой

9. Для выделения фермента использовали насыщенный раствор сульфата аммония. Какими способами можно очистить фермент?

10. В организме человека выявили дефицит железа. Как это повлияет на функцию ферментов и каких?

11. В организм не поступает достаточное количество витамина РР. Как это отобразится на функции оксидоредуктаз?

 

Cамостоятельная работа студентов: 14.15 – 15.00 час.

 

Студент должен знать:

1.     Особенности строения и свойств ферментов как биологических катализаторов.

2.     Гипотезы механизма действия ферментов.

3.     Принципы исследования наличия ферментов в биологических объектах.

4.     Уровни структурной организации ферментов. Активные и аллостерические центры.

5.     Неспецифические (температура, рН среды) и специфические (активаторы, ингибиторы) факторы регуляции активности ферментов.

6.     Множественные формы ферментов, полиферментные комплексы, их преимущества.

7.     Конкурентные и неконкурентные ингибиторы ферментов, их примеры.

8.     Классификация и номенклатура ферментов, характеристика отдельных классов ферментов.

9.     Коферменты: типы реакций, катализирующие отдельные классы коферментов.

10.           Принципы и методы выявления ферментов в биообъектах. Единицы измерения активности и количества ферментов.

11.           Использование  ферментов, коферментов, ингибиторов ферментов в клинической практике.

 

Студент должен уметь:

1.     Определить рН и температурный оптимум амилазы слюны.

2.     Исследовать специфичность амилазы слюны и сахаразы дрожжей.

3.     Доказать активирующее влияние NaCI и ингибирующее влияние CuSO4 на амилазу слюны.

4.     Анализировать полученные результаты исследований.

5.     Объяснить роль проведенных исследований в стоматологической практике.

6.     Провести качественные реакции на оксидоредуктазы для их выявления в биологических жидкостях.

7.     Определять каталазное число крови и обосновать диагностическое значение данного показателя.

 

Правильные ответы на тесты и ситуационные задачи:

1. В

2. В

3. Прибавили фермент амилазу, которая расщепляет крахмал, но не действует на сахарозу.

4. В первой пробирке была сахароза, которая расщепилась сахаразой дрожжей, во второй - какой-нибудь другой субстрат.

5. Малоновая кислота является конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы, поскольку структурно сходна к янтарной кислоте. Активность фермента возобновится, если в инкубационную среду прибавить больше янтарной кислоты.

6. На принципе конкурентного торможения функции фоллиевой кислоты, что необходима для роста и размножения микроорганизмов (сульфаниламиды структурно схожи к парааминобензойной кислоте - компонента фоллиевой).

7. Е

8. В

9. Диализом, гель-фильтрацией.

10. Тормозится активность Fe-зависимых ферментов: каталазы, пероксидазы, цитохромов. Нарушаются процессы тканевого дыхания, обезвреживания пероксида водорода.

11. Нарушится функция НАД- и НАДФ- зависимых оксидоредуктаз (дегидрогеназ), тормозиться дегидрирование многих субстратов.

 

 Источники информации:

Основные:

  1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - Г.: Медицина, 1990. - 543 с.
  2. Савицкий И.В. Биологическая химия - К.: Высшая школа, 1982. -470 с.
  3. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина. 1983 с. 97–100.
  4. Конспекты лекций.
  5. Веб-страница университета > Материалы для подготовки к практическим занятиям.
  6. Веб-страница университета > Презентации лекций.

 

Дополнительные:

1. Николаев А.Я. Биологическая химия. - М: Высшая школа, 1989. - 496 с.

2. Ленинджер А. Основы биохимии: Перевод с англ. - М.: Мир, 1985. - 1024 с.

 

Методическое указание составила доц. Яворская С.И.

 

  

Обсуждено и утверждено на заседании кафедры

«11» июня  2013 г. протокол № 13

Пересмотрено и утверждено на заседании кафедры

«29» августа   2013 г. протокол №  2