ЗАНЯТИЕ № 17 (практическое - 6 часов)

Методические указания

к практическим занятиям для студентов медицинского факультета.

ЗАНЯТИЕ № 16 (практическое - 6 часов)

 

Тема1: Биохимия и патобиохимия крови. Дыхательная функция эритроцитов. Патологические формы Нв. Кислотно-основное состояние. Биохимический состав крови в норме и при патологии: белки острой фазы воспаления, ферменты плазмы крови.

Тема 2: Небелковые азотосодержащие и безазотистые органические компоненты крови. Остаточный азот. Липопротеины плазмы крови. Биохимия иммунных процессов и биохимические механизмы иммунодефицитных состояний.

 

Цель: Уметь определять производные гемоглобина и объяснять значение спектрального анализа в судебно-медицинской экспертизе. Уметь определять общий белок и фракции белков сыворотки крови электрофоретическим методом и объяснять полученные результаты как важные диагностические тесты.

Уметь определить процентное соотношение α-ЛП/β-ЛП  и дать клиническую оценку данному показателю. Уметь определять остаточный азот крови и применять этот анализ для диагностики заболеваний почек, печени, эндокринных расстройств и др.

 

Профессиональная ориентация студентов: Определение с помощью спектрального анализа производных гемоглобина, которые циркулируют в крови, дает возможность врачу установить действие токсического фактора на организм (угарного газа, окислителей и др.) Исследование фракций белков методом электрофореза дает возможность врачу использовать данные показатели для диагностики заболеваний печени, почек, злокачественных опухолей, инфекционных болезней и др.

Среди современных методов диагностики гепатита, сахарного диабета и особенно атеросклероза важное место занимает анализ содержания в крови липопротеинов высокой и низкой плотности. ЛПНП являются атерогенными, потому их увеличение в крови повышает риск развития атеросклероза и его осложнений. Азотемия – важный диагностический показатель почечной недостаточности, болезней, сопровождающихся усилением катаболизма белков, сердечно-сосудистой недостаточности, дегидратации организма.

 

Методика выполнения практической работы: - 9.00-12.00 год.

I Биохимия и патобиохимия крови. Дыхательная функция эритроцитов. Патологические формы Нв.  Кислотно-основное состояние .

Работа 1. Провести спектральный анализ производных гемоглобина.

 

II Биохимический состав крови в норме и при патологии: белки острой фазы воспаления, ферменты плазмы крови.

Работа 2. Определить % содержание фракций белков сыворотки крови, разделённых методом электрофореза.

Техника выполнения лабораторных работ прилагается

 

Работа 1. Спектральный анализ производных Нв.

Принцип метода. Нв и его производные имеют свойство избирательно поглощать лучи определённой длины волны, при этом на спектре в соответствующих местах появляются тёмные полосы (спектры поглощения). Они характерны для каждого производного.

Ход работы.

Вначале приготовить производные Нв.

а) В пробирку внести 5-6 капель дефибринированной крови, развести водой (3-5 мл). Получен раствор оксигемоглобина (НвО2).

б) Приготовить раствор оксиНв, как указано выше, добавить 3-4 капли реактива Стокса (отбирает кислород), оксиНв превращается в «восстановленный» Нв.

в) В пробирку внести 5-6 капель дефибринированной крови, добавить 3 капли [K3Fe(CN)6], развести водой (3-5 мл). Получен раствор метНв (НвОН).

г) В пробирку внести 5 - 6 капель карбоксиНв (Нв СО ), развести водой (3-5 мл).

Полученные производные Нв рассматривают в спектроскопе, отмечают характерные линии поглощения, зарисовывают в протоколе, анализируют практическое значение спектрального анализа.

Проба на карбоксиНв (НвСО).

На предметное стекло нанести 1 каплю карбоксигемоглобина (НвСО), а рядом 1 каплю дефибринированной крови (НвО2). На обе капли нанести по 1 капле 10 % NaOH. НвСО окрашивается в ярко-красный цвет, а НвО2 – в бурый вследствие распада НвО2 и образования гематина. Реакция используется для установления отравления оксидом углерода (СО).

Работа 2. Определение содержания  общего белка в сыворотке крови биуретовым  и рефрактометрическим  методами

Принцип биуретового метода заключается в образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белка с СuSO4 в щелочной среде. Интенсивность цвета пропорциональна содержанию белка в растворе и определяется колориметрией.

Техника работы

Берут три пробирки. В первую помещают микропипеткой 0,1 мл сыворотки крови, во вторую – 0,1 мл стандартного раствора белка, в третью – 0,1 мл 0,9% NaCl (контроль). Во все пробирки добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок перемешивают и через 15 минут определяют экстинкцию растворов против контроля в кюветах 10 мм при зеленом светофильтре. Расчет по формуле:

ЭОП × ССТ

 
 

 


СОП =                          , где:

ЭСТ

 

 
 

 


СОП – концентрация белка в исследуемой сыворотке (г/л);

ЭОП – экстинкция опыта;

ЭСТ – экстинкция стандарта;

ССТ  – концентрация стандартного раствора белка (60 г/л).

 Оценивают полученный результат, учитывая, что в норме концентрация общего белка в сыворотке крови равна 60 – 85 г/л.

 

Принцип рефрактометрического метода заключается в способности различных сред преломлять луч света, проходящий через них. Отношение sin угла падения к sin угла преломления является величиной постоянной и называется показателем преломления. В сыворотке он зависит главным образом от содержания белка, поскольку размеры молекул других компонентов мало влияют на рефракцию. В этом исследовании используют рефрактометр.

Техника работы

В первую очередь устанавливают нулевую точку прибора. Для этого левым боковым зеркалом освещают шкалу прибора, а передним – рефрактометрическую камеру. Затем открывают рефрактометрическую камеру и пипеткой наносят на ее нижюю призму 1-2 капли дист. воды. Закрывают камеру и, глядя в окуляр, правым винтом совмещают горизонтальную линию свето-тени с точкой пересечения диагональных линий камеры. Показатель преломления воды должен быть равен 1,333 (сравнить со шкалой). Затем открывают камеру, витерают салфеткой воду, наносят на призму 1-2 капли исследуемой сыворотки. Закрывают камеру и наблюдают в окуляр смещение горизонтальной линии свето-тени. Вращя винт, совмещают ее с точкой пересечения диагональных линий камеры и отмечают на шкале показатель преломления.

Концентрацию белка определяют по этому показателю, пользуясь стандартной таблицей.

Примечание: если линия свето-тени нечеткая, вращением второго правого винта корректируют ее.

 

Работа 3. Определение содержания фракций белков сыворотки крови, разделённых методом электрофореза.

Принцип метода. Метод основан на разной скорости движения фракций в электрическом поле в зависимости от величины их заряда. Электрофорез проводят при рН буфера 8,6, при котором белки приобретают отрицательный заряд (наибольший у альбуминов, наименьший – у γ – глобулинов) и движутся к аноду.

Ход работы

На полученной в лаборатории электрофореграмме отмечены: место нанесения сыворотки, заряды, т.е. направление движения фракций (к аноду). Бумажные электрофорегрммы помещают в лоток с раствором бромфеноловым синим на 10-15 мин, затем перемещают в другой лоток с 2 % раствором уксусной кислоты для отмывания от избытка красителя. Высушиват электрофореграммы путём промокания с помощью фильтровальной бумаги или в сушильном шкафу. Фракции при окрашивании проявились в виде синих пятен разной величины и на разных расстояниях от места нанесения. Вырезают ножницами эти участки, помещают в строгом порядке в отдельные пробирки, предварительно измельчив ножницами. В пробирки вливают по 5 мл 0,01 М раствора NaOH и оставляют на 1 час, периодически легко взбалтывая. При этом краситель, поглощённый фракциями, переходит в раствор, а бумажки обесцвечиваются. Измеряют экстинкцию каждой фракции на ФЭКе при красном светофильтре в кюветах 10 мм против воды.

Расчёты:

Сумму показателей экстинкции принимают за 100 %. Исходя из этого, определяют % каждой фракции:

Пример:

Сумма экстинкций 0,58, экстинкция альбумина – 0,36.

% содержание альбумина равно:

0,36×100

-------------= 62 %

0,58

 

Таким же образом рассчитывают содержание остальных фракций.

Оценить полученные результаты, исходя из того, что в норме содержание фракций составляет:

Альбумины – 60 – 65 %

α1 – глобулины – 5 – 6 %

α2 – глобулины – 7 – 8 %

b - глобулины – 9 – 12 %

g - глобулины – 15 – 16 %

 

II. Небелковые азотoсодержащие и безазотистые органические компоненты крови. Остаточны азот крови. Липопротеины плазмы крови.

Работа 4. Определение процентного соотношения альфа- и бета-липопротеинов в сыворотке крови

Работа 5. Количественное определение остаточного азота крови

 

II Биохимия иммунных процессов и биохимические механизмы иммунодефицитных состояний.

Работа 6. Определение циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови.

Техника выполнения лабораторных работ прилагается.

 

Работа 4. Определение процентного соотношения α – ЛП/ b - ЛП.

Принцип метода. Метод основан на электрофоретическом разделении предварительно окрашенных суданом чёрным липопротеинов сыворотки крови с последующим экстрагированием судана из фракций и определением их оптической плотности.

Ход работы.

На липопротеинограммах, подготовленных в лаборатории, отмечены: место нанесения сыворотки, заряды, т.е. направление движения фракций (к аноду), окрашенные пятна, соответствующие фракциям. Окрашенные участки вырезают, измельчают и помещают в отдельные пробирки, добавляют к ним по 4 мл смеси этанола и уксусной кислоты. Оставляют пробирки на 1 час в тёмном месте, периодически слегка взбалтывая. При этом судан переходит в раствор. Растворы фотометрируют на ФЕКе при красном светофильтре в кюветах 0,5 см против воды. Принимая сумму экстинкций за 100 %, рассчитывают % каждой фракции. Анализируют результаты, исходя из того, что α – ЛП/ b - ЛП в норме составляет 25 - 30 %  / 65-70 % и учитывая атерогенные и антиатерогенные свойства липопротеинов.

 

Работа 5. Определение остаточного азота крови.

Принцип метода. Безбелковый фильтрат крови минерализуют концентрированной H2SO4 при нагревании. Вследствие этого азот отщепляется от азотсодержащих соединений в виде аммиака, образуя с H2SO4 сульфат аммония (NH4)2SO4. Последний определяется с помощью реактива Несслера. Полученное соединение имеет жёлто-оранжевый цвет, интенсивность которого определяется колориметрией.

Ход работы

Минерализат крови получают в лаборатории.

Берут 2 пробирки. Вносят: в первую – 0,5 мл минерализата, во – вторую – 0,5 мл стандартного раствора (NH4)2SO4. В обе пробирки добавляют по 5 мл Н2О, по 3 капли 50 % NaOH и по 0,5 мл реактива Несслера. Фотометрируют растворы против воды в кюветах на 5 мм при синем светофильтре.

Расчёт проводят за формулой:

ССТ × ЭОП

Х =  -------------  , где:

ЭСТ

 

Х – концентрация остаточного азота в г/л;

ССТ – концентрация стандарта (указана на флаконе);

ЭОП  и ЭСТ  - экстинкции опыта и стандарта.

 

Полученный результат оценить, исходя из того что в норме содержание остаточного азота в крови составляет 0, 2 - 0, 4 г/л (или 14, 3 – 28, 6 ммоль/л). Коэффициент пересчёта на ммоль/л составляет 0, 714. Указать причины азотемии.

 

Работа 6. Определение циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови.

Принцип метода. Заключается в изменении величины светового рассеивания полиэтиленгликоля вследствие осаждения им  циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).

Ход работы

В пробирку вносят 0,3 мл сыворотки, добавляют 0,6 мл боратного буфера (рН 8,4), тщательно перемешивают. Содержимое разливают по 0,3 мл в две пробирки. В первую добавляют 2,7 мл боратного буфера (контроль), во вторую – 2,7 мл полиэтиленгликоля (опыт). Содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной . Затем определяют оптическую плотность растворов на ФЕКе при длине волны 450 нм в кюветах 1 см против воды. Разность показателей экстинкции опыта и контроля умножают на 1000 и получают содержание ЦИК в сыворотке крови, выраженное в условных единицах.

 

Усл. ед. = (ЭОП­ – ЭКОНТР) × 1000

 

Норма содержания  ЦИК в сыворотке крови равна 50-70 у.е.

 

Программа самоподготовки студентов к занятию

I Биохимия и патобиохимия крови. Дыхательная функция эритроцитов. Патологические формы Нв. Кислотно-основное состояние.

1. Функции крови, их характеристика.

2. Биохимия клеток крови. Дыхательная функция эритроцитов.

3. Строение, структура и биологическая роль гемоглобина.

4. Типы гемоглобина. Молекулярные болезни, связанные с патологией гемоглобина.

5. Производные гемоглобина, условия их образования.

6. Принцип спектарального анализа производных гемоглобина, клиническое значение.

7. Буферные системы крови.

II Биохимический состав крови в норме и при патологии: белки острой фазы воспаления, ферменты плазмы крови.

1. Общее содержание белка в плазме крови.

2. Фракции белков плазмы крови: строение, физико-химические свойства и функции альбуминов, глобулинов, фибриногена.

3. Подфракции a1, a2, β- γ- глобулинов, их функции. Место синтеза каждой фракции и подфракции белков плазмы крови.

4. Компоненты системы неспецифической резистентности организма и белки “острой фазы” воспалительных процессов - (С-реактивный протеин,  a1фетопротеин, a2-макроглобулин,  a1-протеиназный ингибитор, фибронектин, криоглобулин, интерферон).

5. Причины и следствия изменения содержания общего белка, отдельных фракций и подфракций белков плазмы крови.

6. Суть методов определения содержания общего белка и его фракций в сыворотке крови электрофоретическим методом.

7. Ферменты плазмы крови: происхождение, значение в энзимодиагностике заболеваний внутренних органов.

 

III Небелковые азотосодержащие и безазотистые органические компоненты крови. Остаточный азот. Липопротеины плазмы крови.

1. Небелковые азотсодержащие  и  безазотистые  органические  соединения  плазмы крови.

2. Понятие «остаточный азот», основные его компоненты, пути их образования и содержание в крови.

3. Клинико-диагностическое значение изменений содержания остаточного азота и его компонентов.

4. Пути превращения безазотистого остатка аминокислот. Гликогенные и кетогенные аминокислоты.

5. Принцип метода определения остаточного азота крови, клиническое значение. Виды азотемий.

6. Транспортные формы липидов крови, место их формирования, строение и функции.

7. Модель структуры транспортных форм липидов, роль белков.

8. Транспортные формы холестерина, обосновать атерогенность β-липопротеинов.

9. Принципы определения и клиническая оценка соотношения aβ-ЛП

10. Клинико-биохимическая характеристика первичных и вторичных липопротеинемий за классификацией ВООЗ. Принципы лабораторной диагностики дислипопротеинемий.

 

IV Биохимия иммунных процессов и биохимические механизмы иммунодефицитных состояний.

1. Общая характеристика иммунной системы; клеточные и биохимические компоненты.

2. Иммуноглобулины: виды, структура, биологические функции.

3. Медиаторы и гормоны иммунной системы: цитокины (интерлейкины, интерфероны, белково-пептидные факторы регуляции роста и пролиферации клеток).

4. Биохимические компоненты системы комплемента человека; классический и альтернативный механизмы активации.

5. Биохимические механизмы иммунодефицитных состояний: первичные (наследственные) и вторичные иммунодефициты; синдром приобретенного иммунодефицита человека.

 

Семинарское обсуждение теоретических вопросов: - 12.30-14.00 час.

 

Тестовые задания и ситуационные задачи.

1. В молекуле гемоглобина состоялась замена глутаминовой кислоты на валин. Причины и следствия такого состояния.

2. При спектральном анализе крови больного обнаружены две полосы поглощения, сдвинутые в фиолетовую часть спектра. О чем это свидетельствует? Возможные последствия для больного.

3. Содержание альбуминов в плазме крови составляет 20 г/л. Какие причины и возможные последствия такого состояния?

4. В плазме крови содержание гамма-глобулинов составляет 30 г/л. Отвечает ли это норме? Какие возможные причины такого явления?

5. У больного увеличенная a1-глобулиновая фракция крови в основном за счет роста содержания a-фетопротеина. Какие возможные причины такого состояния?

6. У больного цирроз печени. Какие изменения на электрофореoграмме будут при этом?

7. У больного с жалобами на появление отеков обнаружен белок в моче, содержание общего белка в крови ровно 45 г/л. Возможной причиной такого состояния является болезнь:

A. Печени

B. Почек

C. Поджелудочной железы

D. Мочевого пузыря

E. Сердечно-сосудистой системы

 

8. При анализе крови обнаружено высокое содержание холестерина в бета-липопротеиновой фракции. Возможные последствия такого состояния.

9. У больного увеличено количество a -ЛП фракции. Как оценить такой результат?

10. Содержание остаточного азота в крови равно 0,9 г/л. Отвечает ли это норме? Какие причины такого состояния?

11. В крови содержание остаточного азота равно 0,1 г/л. О чем свидетельствует этот показатель?

12. Как по содержанию остаточного азота в крови и общего азота мочи дифференцировать ретенционную и продукционную азотемию?

13. ВИЧ-инфицированный больной обратился к врачу с жалобами на постоянный кашель, повышенное потоотделение, высокую температуру тела, снижение работоспособности, астению. При рентгенологическом исследовании обнаружена двухсторонняя пневмония.  Какое заболевание можно заподозрить у пациента?

 

Самостоятельная работа студентов. 1415-1500

Письменное тестирование студентов, которые не сдали контроль за системой «MOODLE», просмотр тематических учебных таблиц, тренинг в копьютерном классе тестов лицензионному экзамену "Крок-1» и кафедральной базы тестов, углубленное изучение материала тем, вынесенных на самостоятельную проработку т.п.

 

Студент должен знать:

1. Биохимические и физиологические функции крови. Дыхательная  функция эритроцитов.

2. Гемоглобин: механизмы участия в транспорте кислорода и диоксида  углерода. Типы и патологические формы гемоглобинов человека.

3. Буферные системы крови.  Нарушение кислотно-основного равновесия в организме (метаболический и респираторный ацидоз, алкалоз).

4. Биохимический  состав  крови  человека. Фракции и подфракции белков плазмы крови и их клинико-биохимическая характеристика.

5. Ферменты плазмы крови: происхождение, значение в энзимодиагностике заболеваний органов и тканей.

6. Что такое остаточный азот крови. Его содержание в крови, основные компоненты.

7. Клинико-диагностическое значение определения остаточного азота крови. Виды азотемий.

8. Способы транспорта липидов в крови: строение, место формирования, функции транспортных форм.

9. Атерогенные, антиатерогенные  липопротеины.

10. Биохимические механизмы иммунных процессов организма. Иммуннодефицитные состояния.

 

Студент должен уметь:

1. Определить содержание обжего белка и его фракций в крови методом электрофореза. Оценить результат, обосновать диагностическое значение.

2. Провести спектральный анализ производных гемоглобина, проанализировать результаты, оценить практическое применение метода.

3. Определять содержание остаточного азота крови. Обосновать причины возникновения азотемии.

4. Определить процентное соотношение  альфа- и бета-ЛП. Объяснить атерогенность бета - и антиатерогеннность альфа-липопротеинов.

5. Определить содержание циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови, оценить результат, объяснить диагностическое значение.

 

Верные ответы на тесты и ситуационные задачи:

1. Это наследственное заболевание, которое возникает в результате дефекта гена, в котором закодирована информация о синтезе гемоглобина. Синтезируется гемоглобин с измененной макроструктурой, он легко кристаллизируется и частично теряет способность переносить кислород (серповидно-клеточная анемия).

2. Это свидетельствует о наличии карбоксигемоглобина в крови больного, что приведет к гипоксии.

3. Содержание альбуминов снижено (гипоальбуминемия). Возможные причины: голодание, нарушение всасывания аминокислот в кишечнике, болезнь печени (белок не синтезируется), болезни почек (потеря альбумина с мочой). Следствиями такого состояния могут быть отеки (в результате снижения онкотического давления), нарушения транспортной, дезинтоксикационной и буферной функций плазмы крови.

4. Повышено содержание γ-глобулинов – гипергаммаглобулинемия. Такое состояние бывает при хронических воспалительных, инфекционных заболеваниях, циррозе печени, хроническом полиартрите.

5. Причиной повышения  альфа-фетопротеина может быть чаще всего первичная гепатокарцинома, реже, вторичное  метастатическое поражение печени злокачественной опухолью.

6. Будет снижена фракция альбуминов и повышена фракция гамма-глобулинов.

7. B.

8. Может возникнуть длитедьная гиперхолестеринемия, следствиями которой является атеросклероз, инфаркт миокарда, гипертония, инсульт и др.

9. Это благоприятный результат - уменьшается риск возникновения гиперхолестеринемии и ее следствий (a-ЛП являются антиатерогенными).

10. Содержание остаточного азота повышено - азотемия. Причиной может быть почечная недостаточность или заболевания, которые сопровождаются усиленным распадом белка.

11. Содержание остаточного азота снижено, что может быть при недостатке белка в пище.

12. Если повышение остаточного азота крови сопровождается увеличением азота мочи, то это продукционная азотемия. Если же в моче содержание азота низкое, то причиной азотемии является заболевание почек.

13. Вероятно, у больного пневмония, провоцированная синдромом иммунодефицита человека.

 

Источники информации:

Основные:

1.                Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - Г.: Медицина, 1990. - 543 с.

2.                Савицкий И.В. Биологическая химия - К.: Высшая школа, 1982. -470 с.

3.                Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина. 1983 с. 97–100.

4.                Конспекты лекций.

5.                Веб-страница университета > Интранет > На помощь студентам > Материалы для подготовки к практическим занятиям

6.                Веб-страница университета > Интранет > На помощь студентам > Презентации лекций.

Дополнительные:

1. Николаев А.Я. Биологическая химия. - М: Высшая школа, 1989. - 496 с.

2. Ленинджер А. Основы биохимии: Перевод с англ. - М.: Мир, 1985. - 1024 с.

 

Методические указания составила ст.преподаватель Шершун Г.Г.

Обсуждено и утверждено на заседании кафедры

«11» июня 2013 г. Протокол № 13

Пересмотрено и утверждено на заседании кафедры

«29» августа 2013 г. протокол № 2