ЗАНЯТИЕ № 4 (практическое - 6 часов)

Методические указания

к практическим занятиям для студентов медицинского факультета.

ЗАНЯТИЕ № 3 (практическое - 6 часов)

 

Тема 1: Биоэнергетические процессы: биологическое окисление, тканевое дыхание. Молекулярная организация митохондриальной дыхательной цепи.

Тема 2: Хемиосмотическая теория окислительного фосфорилирования. Ингибиторы и разобщители окислительного фосфорилирования.

 

Цель: Объяснять роль биологического окисления, тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования в генерации АТФ при аэробных условиях. Анализировать нарушение синтеза АТФ при условиях действия на организм человека патогенных факторов химического, физического, биологического происхождения.

 

Профессиональная ориентация студентов:

Исследование активности ключевых ферментов тканевого дыхания, агентов, которые их тормозят, необходимое для объяснения хода окислительных процессов в организме и, связанных с этим, способов преобразования и накопления энергии жизнедеятельности в здоровом организме и при условиях их нарушения при болезнях, интоксикациях, отравлениях.

 

Методика выполнения практической работы. - 900-1200 час.

I Биоэнергетические процессы: биологическое окисление, тканевое дыхание. Молекулярная организация митохондриальной дыхательной цепи.

Работа 1. Исследовать наличие цитохромоксидазы в мышцах.

ІІ Хемиосмотическая теория окислительного фосфорилирования. Ингибиторы и разобщители окислительного фосфорилирования.

Работа 2. Исследование разобщения окислительного фосфорилирования с помощью 2,4-динитрофенола.

Техника выполнения лабораторных работ прилагается.

 

Работа 1. Исследование цитохромоксидазы мышц.

Принцип: Выявление цитохромоксидазы основано на её способности окислять с участием кислорода воздуха некоторые органические вещества, в

 

частности соединение парафенилендиамина и α-нафтола (реактив «НАDИ»), который при этом окрашивается в синий цвет.

 

Техника работы.

Берут 1 г мышечной ткани, измельчают ножницами, растирают в ступке, добавляя 5 мл H2О. Полученный гомогенат помещают на воронку с двумя слоями марли и фильтруют, можно промыть кашицу водой и отжать. Разделить гомогенат на 2 части. Одну часть помещают на фильтровальную бумагу, а другую – в пробирку с 1 мл H2О , которую кипятят 1 мин и охлаждают под проточной водой. Оставшуюся жидкость из пробирки выливают, мышечный гомогенат переносят стеклянной палочкой на фильтровальную бумагу отдельно от первой части. Готовят реактив «НАDИ». Для этого смешивают 0,5 мл α-нафтола и 0,5мл п-фенилендиамина. На обе мышечные кашицы наносят по 1-2 капли реактива «НАDИ». На какой части гомогената появится синий цвет, а на какой не наблюдается? Объяснить.

 

Работа 2. Исследование разобщения окислительного фосфорилирования с помощью 2,4-динитрофенола.

Принцип: Об интенсивности окислительного фосфорилирования свидетельствует уменьшение неорганического фосфата, используемого для синтеза АТФ, в реакционной среде малат + суспензия митохондрий. Неорганический фосфат определяют молибденовой реакцией.

 

Техника работы.

Берут 2 пробирки и вносят реактивы:

І контроль

ІІ опыт

1 мл инкубационной смеси

1 мл инкубационной смеси

0,02 мл АДФ (2 капли)

0,02 мл АДФ (2 капли)

0,5 мл малата

0,5 мл малата

0,5 мл 0,85% NaCl

0,5 мл 2,4-динитрофенола

0,5мл суспензии митохондрий

0,5мл суспензии митохондрий

 

Пробы перемешивают и обе пробирки оставляют при комнатной температуре на 15 мин. Затем в обе пробирки добавляют по 1 мл 10% трихлоруксусной кислоты. Фильтруют содержимое каждой пробирки в 2 чистые и определяют в них неорганический фосфат. Для этого приливают по 1 мл 2,5% раствора молибденового реактива, перемешивают, добавляют по 0,5 мл 0,5 % раствора эйконогена (или аскорбиновой кислоты), снова перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 мин для развития окраски. Сравнивают интенсивность окраски в контроле и опыте, после чего делают вывод о действии 2,4-динитрофенола на окислительное фосфорилирование (использование H3PO4 для синтеза АТФ из АДФ).

 

 Программа самоподготовки студентов к занятию.

I Биоэнергетические процессы: биологическое окисление, тканевое дыхание. Молекулярная организация митохондриальной дыхательной цепи.

1. Узловые вопросы биоэнергетики: энергетические субстраты, механизм изъятия и акумуляции энергии, пути использования энергии в организме.

2. Экзэргонические и эндэргонические процессы.

3. Типы реакций биологического окисления: дегидрогеназные, оксидазные, оксигеназные, свободнорадикальные, их суть и биологическое значение.

4. Макроэргическая связь, примеры макроэргических соединений.

5. Пути образования АТФ в организме. Субстратное и окислительное фосфорилирование, локализация в клетке, их отличия.

6. Тканевое дыхание: локализация, молекулярная организация митохондриальной дыхательной цепочки, последовательность реакций, редокс-потенциалы.

7. Ферменты биологического окисления в митохондриях: пиридиновые, флавинзависимые дегидрогеназы, цитохромы, их строение и функции.

8. Молекулярные комплексы внутренней мембраны митохондрий: НАД-КоQ-редуктаза, сукцинат-КоQ-редуктаза, КоQ цитохром с1-редуктаза, цитохром с-оксидаза.

9. Пути включения НАДН и ФАДН2 в дыхательную цепочку митохондрий.

ІІ Хемиосмотическая теория окислительного фосфорилирования. Ингибиторы и разобщители окислительного фосфорилирования.

1. Суть хемиосмотической теории окислительного фосфорилирования:

а) механизм формирования трансмембранного протонного потенциала на внутренней мембране митохондрий;

б) строение, механизм функционирования Н+АТФ-синтетазы;

в) точки сопряжения окисления и фосфорилирования в дыхательной цепочке митохондрий для НАДН2 и ФАДН2;

г) коэффициент окислительного фосфорилирования, дыхательный контроль.

2. Условия эффективного сопряжения окисления и фосфорилирования, роль витаминов.

3. Причины и следствия нарушений тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования:

а) ингибиторы транспорта электронов, примеры, место их действия;

б) разобщители окисления и фосфорилирования, примеры.

 

Семинарское обсуждение теоретических вопросов: - 1230-1400 час.

 

Тестовые задания и ситуационные задачи.

1. У больного гиперфункция щитовидной железы. Как это повлияет на процесс тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования?

2. Установлено, что у больного имеет место активация перекисного окисления липидов. Как это повлияет на окислительное фосфорилирование?

3. Субстратами дыхательной цепи являются продукты, которые образуются в:

А. ЖКТ

В. В гликолизе (анаэробная фаза)

С. Цикле Кребса

Д. Эндоплазматическом ретикулуме

Е. В глюконеогенезе

4. Где происходит образование АТФ во время окислительного фосфорилирования?

А. В митохондриях (внешняя мембрана)

В. В цитозоле

С. В дыхательной цепи микросом

Д. На рибосомах

Е. На АТФ-синтетазе, которая находится в матриксе и пронизывает внутреннюю мембрану

 

Самостоятельная работа студентов. 1415-1500

Письменное тестирование студентов, которые не сдали контроль за системой «MOODLE», просмотр тематических учебных таблиц, тренинг в копьютерном классе тестов лицензионному экзамену "Крок-1» и кафедральной базы тестов, углубленное изучение материала тем, вынесенных на самостоятельную проработку т.п.

 

Студент должен знать:

1. Реакции биологического окисления; типы реакций (дегидрогеназные, оксидазные, оксигеназные, свободнорадикальные), их биологическое значение. Тканевое дыхание.

2. Ферменты биологического окисления в митохондриях: пиридин-,  флавин-зависимые дегидрогеназы, цитохромы.

3. Последовательность компонентов дыхательной цепи митохондрий. Молекулярные комплексы внутренних мембран митохондрий.

4. Хемиосмотическую теорию окислительного фосфорилирования: трансмембранный потенциал протонов, пункты сопряжения дыхания и фосфорилирования, механизм функционирования Н+АТФ-синтетазы.

5. Ингибиторы транспорта электронов и разобщители окислительного фосфорилирования, следствия их действия на организм.

6. Микросомальное окисление: молекулярная организация оксигеназных цепочек переноса электронов, цитохром Р-450, в5.

 

Студент должен уметь:

1. Исследовать наличие цитохромоксидазы в мышцах, проанализировать значение этого фермента в процессе тканевого дыхания.

2. Оценивать окислительное фосфорилирование, используя как разобщитель 2,4-динитрофенол, объяснять механизм его действия

 

Верные ответы на тесты и ситуационные задачи:

1. Тироксин в избытке разъединяет дыхание и фосфорилирование, поэтому у больного будет наблюдаться повышение tо тела (преобладает свободное окисление), дефицит АТФ в тканях.

2. Активация перекисного окисления липидов может вызвать разрушение митохондриальных мембран, в результате чего нарушатся процессы окислительного фосфорилирования и образование АТФ.

3. С

4. Е

 

Источники информации:

Основные:

1.                  Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - Г.: Медицина, 1990. - 543 с.

2.                  Савицкий И.В. Биологическая химия - К.: Высшая школа, 1982. -470 с.

3.                  Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина. 1983 с. 97–100.

4.                  Конспекты лекций.

5.                  Веб-страница университета > Интранет > На помощь студентам > Материалы подготовки к практическим занятиям

6.                  Веб-страница университета > Интранет > На помощь студентам > Презентации лекций

 

Дополнительные:

1. Николаев А.Я. Биологическая химия. - М: Высшая школа, 1989. - 496 с.

2. Ленинджер А. Основы биохимии: Перевод с англ. - М.: Мир, 1985. - 1024 с.

Методические указания составила ст.преподаватель Шершун Г.Г.

Обсуждено и утверждено на заседании кафедры

«11» июня 2013 г. протокол № 13

Пересмотрено и утверждено на заседании кафедры

«29» августа 2013 г. протокол № 2