Медицина

БІОСИНТЕЗ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДІВ

МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ РЕПЛІКАЦІЇ ДНК. ТРАНСКРИПЦІЯ – БІОСИНТЕЗ РНК. БІОСИНТЕЗ БІЛКА В РИБОСОМАХ. ЕТАПИ ТА МЕХАНІЗМ ТРАНСЛЯЦІЇ, РЕГУЛЯЦІЯ ТРАНСЛЯЦІЇ. АНТИБІОТИКИ – ІНГІБІТОРИ ТРАНСКРИПЦІЇ ТА ТРАНСЛЯЦІЇ

 

Нуклеїнові кислоти — складні високомолекулярні біополімери, мономерами яких є нуклеотиди. Природні нуклеїнові кислоти — ДНК і РНК — виконують у всіх живих організмах роль передачі і експресії генетичної інформації. Даний термін був введений Рихардом Альтманом. Вперше їх виявлено в ядрі клітини, звідки й походить назва цих сполук (від лат. нуклеус — ядро). Молекула нуклеотиду складається із залишків нітратної основи, п'ятивуглецевого моносахариду (пентози) і фосфатної кислоти. Залежно від виду пентози, що входить до складу нуклеотиду, їх поділяють на дезоксирибонуклеїнову (ДНК) та рибонуклеїнову (РНК).

Дезоксирибонуклеї́нова кислота́ (ДНК) — один із двох типів природних нуклеїнових кислот, який забезпечує зберігання, передачу з покоління в покоління і реалізацію генетичної програми розвитку й функціонування живих організмів. Основна роль ДНК в клітинах — довготривале зберігання інформації про структуру РНК і білків.

У клітинах еукаріотів (наприклад, тварин, рослин або грибів) ДНК знаходиться в ядрі клітини в складі хромосом, а також в деяких клітинних органелах (мітохондріях і пластидах). У клітинах прокаріотів (бактерій і архей) кільцева або лінійна молекула ДНК, так званий нуклеоїд, знаходиться в цитоплазмі і прикріплена зсередини до клітинної мембрани. У них і у нижчих еукаріот (наприклад дріжджів) зустрічаються також невеликі автономні кільцеві молекули ДНК, так звані плазміди. Крім того, одно- або дволанцюжкові молекули ДНК можуть утворювати геном ДНК-вірусів.

З хімічної точки зору, ДНК — це довга полімерна молекула, що складається з послідовності блоків нуклеотидів. Кожний нуклеотид складається з азотистої основи, цукру (дезоксирибози) і фосфатної групи (або гомологічної арсеноїдної). Зв'язки між нуклеотидами в ланцюжку утворюються за рахунок дезоксирибози і фосфатної групи. У переважній більшості випадків (окрім деяких вірусів, що містять одноланцюжкові ДНК) макромолекула ДНК складається з двох ланцюжків, орієнтованих азотистими основами один проти одного. Ця дволанцюжкова молекула утворює спіраль. В цілому структура молекули ДНК отримала назву «подвійної спіралі».

У ДНК зустрічається чотири види азотистих основ (аденін, гуанін, тимін і цитозин) (виняток становлять випадки пізніших модифікацій нуклеотидів, наприклад метилювання). Азотисті основи одного з ланцюжків сполучені з азотистими основами іншого ланцюжка водневими зв'язками згідно з принципом комплементарності: аденін з'єднується тільки з тиміном, гуанін — тільки з цитозином. Послідовність нуклеотидів дозволяє «кодувати» інформацію про різні типи РНК, найважливішими з яких є інформаційні, або матричні (мРНК), рибосомальні (рРНК) і транспортні (тРНК). Всі ці типи РНК синтезуються на матриці ДНК (тобто за рахунок копіювання послідовності ДНК у послідовність макромолекули, що синтезується) у процесі транскрипції і беруть участь у біосинтезі білків (процесах сплайсингу і трансляції). Крім кодуючих послідовностей, ДНК клітини містить послідовності, що виконують регуляторні і структурні функції. Ділянки кодуючої послідовності разом із регуляторними ділянками називаються генами.

Історія дослідження

Структура подвійної спіралі ДНК була запропонована Френсісом Кріком і Джеймсом Ватсоном у 1953 році на основі рентгеноструктурних даних, отриманих Морісом Вілкінсом і Розаліндою Франклін, і «правил Чаргаффа», згідно з якими в кожній молекулі ДНК дотримуються строгі співвідношення, що зв'язують між собою кількість азотистих основ різних типів. Пізніше запропонована Ватсоном і Кріком модель будови ДНК була доведена, а їхня робота відмічена Нобелівською премією з фізіології і медицини 1962 року.

У відомій доповіді 1957 року, Крік окреслив основи так званої «Центральної догми» молекулярної біології, яка передбачає взаємовідношення між ДНК, РНК і білками, та сформулював «адаптерну гіпотезу». Остаточне підтвердження механізму копіювання, запропонованого на основі спіральної структури, було отримане в 1958 році за допомогою експерименту Мезельсона-Сталя. Подальші роботи Кріка і його лабораторії показали, що генетичний код засновується на трійках основ, що не перекриваються, кодонах, що пізніше дозволило Гару Ґобінду Хорані, Роберту Голлі і Маршаллу Ніренбергу розшифрувати генетичний код. Ці відкриття позначають початок молекулярної біології.                                      

Дезоксирибонуклеїнова кислота є біополімером (поліаніоном), мономерами якого є нуклеотиди. Кожен нуклеотид складається із залишку фосфорної кислоти, приєднаного за 5'-положенням до цукру дезоксирибози, до якого також через глікозидний зв'язок (C—N) за 1'-положенням приєднана одна з чотирьох азотистих основ. Саме наявність характерного цукру і складає одну з головних відмінностей між ДНК і РНК, зафіксовану в назвах цих нуклеїнових кислот (до складу РНК входить цукор рибоза). Приклад нуклеотиду — аденозинмонофосфат — де основа, приєднана до фосфату і рибози, це аденін, показаний на малюнку.

Виходячи із структури молекул, основи, що входять до складу нуклеотидів, розділяють на дві групи: пуринові (аденін [A] і гуанін [G]), утворені сполученими п'яти- і шестичленним гетероциклами і піримідинові (цитозин [C] і тимін [T]) — утворені одним шестичленним гетероциклом.

Полімер ДНК має досить складну структуру. Нуклеотиди ковалентно сполучені між собою в довгі полінуклеотидні ланцюжки. Ці ланцюжки в переважній більшості випадків (окрім деяких вірусів, що мають одноланцюжковий ДНК-геном), у свою чергу, попарно об'єднуються за допомогою водневих зв'язків у структуру, що отримала назву подвійної спіралі. Фосфатні групи формують фосфодіестерні зв'язки між третім і п'ятим атомами вуглецю сусідніх молекул дезоксирибози, в результаті взаємодії між 3-гідроксильною (3 —ОН) групою однієї молекули дезоксирибози і 5-фосфатною групою (5 —РО3) іншої. Асиметричні кінці ланцюжка ДНК називаються 3' (три-прайм) і 5' (п'ять-прайм). Полярність ланцюжка грає важливу роль при синтезі ДНК (подовження ланцюжка можливе тільки шляхом приєднання нових нуклеотидів до вільного 3' кінцю).

Кожна основа на одному з ланцюжків зв'язується з однією певною основою на іншому ланцюжку. Таке специфічне зв'язування називається комплементарним. Пуринові основи комплементарні піримідиновим (тобто, здатні до утворення водневих зв'язків з ними): аденін утворює зв'язки тільки з тиміном, а цитозин — з гуаніном. У подвійній спіралі ланцюжки також зв'язані за допомогою гідрофобної взаємодії і стекінгу, які не залежать від послідовності основ ДНК.

Різні пари основ утворюють різну кількість водневих зв'язків. A-T зв'язані двома, G-C — трьома водневими зв'язками, тому на розрив GC потрібно більше енергії. Відсоток GC пар і довжина молекули ДНК визначають кількість енергії, необхідної для дисоціації ланцюжків: довгі молекули ДНК з великим вмістом GC більш «тугоплавкі».

РНК (рибонуклеїнова кислота) — клас нуклеїнових кислот, лінійних полімерів нуклеотидів, до складу яких входять залишок фосфорної кислоти, рибоза (на відміну від ДНК, що містить дезоксирибозу) і азотисті основи — аденін, цитозин, гуанін і урацил (на відміну від ДНК, що містить замість урацила містить тимін). РНК містяться головним чином в цитоплазмі клітин. Ці молекули синтезуються в клітинах всіх клітинних живих організмів, а також містяться в віроїдах та деяких вірусах. Основні функції РНК в клітинних організмах — шаблон для трансляції генетичної інформації в білки та поставка відповідних амінокислот до рибосом. В вірусах є носієм генетичної інформації (кодує білки оболонки та ферменти вірусів). Віроїди складаються з кільцевої молекули РНК та не містять в собі інших молекул. Існує гіпотеза світу РНК, згідно з якою, РНК виникли до білків й були першими формами життя.

Клітинні РНК утворюються в ході процесу, що зветься транскрипцією, тобто синтезу РНК на матриці ДНК, що здійснюється спеціальними ферментами - РНК-полімерази. Потім матричні РНК (мРНК) беруть участь у процесі, що називається трансляцією. Трансляція - це синтез білка на матриці мРНК за участю рибосом. Інші РНК після транскрипції піддаються хімічним модифікаціям, і після утворення вторинної та третинної структур виконують функції, що залежать від типу РНК.

Для одноланцюжкових РНК характерні різноманітні просторові структури, в яких частина нуклеотидів одного і того ж ланцюга спарені між собою. Деякі високо структуровані РНК беруть участь у синтезі білка клітини, наприклад, транспортні РНК служать для впізнавання кодонів та доставки відповідних амінокислот до місця синтезу білка, а матричні РНК служать структурною і каталітичною основою рибосом.

Однак функції РНК в сучасних клітинах не обмежуються їх роллю в трансляції. Так малі ядерні РНК беруть участь у сплайсингу еукаріотичних матричних РНК та інших процесах.

Крім того, що молекули РНК входять до складу деяких ферментів (наприклад, теломерази) у окремих РНК виявлена власна ензиматична активність, здатність вносити розриви в інші молекули РНК або, навпаки, «склеювати» два РНК-фрагмента. Такі РНК називаються рибозимами.

Геноми ряду вірусів складаються з РНК, тобто у них вона відіграє роль, яку у вищих організмів виконує ДНК. На підставі різноманітності функцій РНК в клітині була висунута гіпотеза, згідно з якою РНК - перша молекула, здатна до самовідтворення в добіологічних системах.

Особливості будови РНК

Нуклеотиди РНК складаються з цукру - рибози, до якої в положенні 1 'приєднано одна з підстав: аденін, гуанін, цитозин або урацил. Фосфатна група поєднує рибози в ланцюжок, утворюючи зв'язку з 3 'атомом вуглецю однієї рибози і в 5' становищі іншого. Фосфатні групи при фізіологічному рН негативно заряджені, тому РНК - поліаніонів. РНК транскрибується як полімер чотирьох підстав (аденіну (A), гуаніну (G), урацилу (U) і цитозину (C)), але в «зрілої» РНК є багато модифікованих основ і цукрів. Азотисті основи у складі РНК можуть утворювати водневі зв'язки між цитозином і гуаніном, аденін і урацилом, а також між гуаніном і урацилом. Однак можливі й інші взаємодії, наприклад, кілька аденінів можуть утворювати петлю, або петля, що складається з чотирьох нуклеотидів, в якій є пара основ аденін - гуанін.

Матрична рибонуклеїнова кислота (мРНК, синонім - інформаційна РНК, іРНК) - РНК, що відповідає за перенесення інформації про первинну структуру білків від ДНК до місць синтезу білків. мРНК синтезується на основі ДНК в ході транскрипції, після чого, у свою чергу, використовується під час трансляції як матриця для синтезу білків. Тим самим мРНК грає важливу роль в «прояві» (експресії) генів.

Транспортні (тРНК) - малі, що складаються з приблизно 80 нуклеотидів, молекули з консервативною третинною структурою. Вони переносять специфічні амінокислоти до місця синтезу пептидного зв'язку в рибосомі. Кожна тРНК містить ділянку для приєднання амінокислоти і антикодон для пізнавання та приєднання до кодону мРНК. Антикодон утворює водневі зв'язки з кодоном, що поміщає тРНК в положення, що сприяє утворенню пептидного зв'язку між останньою амінокислотою утвореного пептиду і амінокислотою, приєднаною до тРНК.

Рибосомальні РНК (рРНК) - каталітична складова рибосом. Еукаріотичні рибосоми містять чотири типи молекул рРНК: 18S, 5.8S, 28S і 5S. Три з чотирьох типів рРНК синтезуються в полісом. У цитоплазмі рибосомальні РНК з'єднуються з рибосомальними білками і формують нуклеопротеїн, званий рибосомою. Рибосома приєднується до мРНК і синтезує білок. рРНК складає до 80% РНК, що виявляється в цитоплазмі еукаріотичної клітини.

Порівняння з ДНК

Між ДНК і РНК є три основні відмінності: ДНК містить цукор дезоксирибозу, РНК - рибозу, у якої є додаткова, порівняно з дезоксирибозою, гідроксильна група. Ця група збільшує ймовірність гідролізу молекули, тобто зменшує стабільність молекули РНК. Нуклеотид, комплементарний аденін, в РНК не тимін, як в ДНК, а урацил - неметилована форма тиміну. ДНК існує у формі подвійної спіралі, що складається з двох окремих молекул. Молекули РНК, в середньому, набагато коротше і переважно одноланцюжкові.

Структурний аналіз біологічно активних молекул РНК, включаючи тРНК, рРНК, мяРНК та інші молекули, які не кодують білків, показав, що вони складаються не з однієї довгої спіралі, а з численних коротких спіралей, розташованих близько один до одного і утворюють щось, схоже на третинну структуру білка. У результаті цього РНК може каталізувати хімічні реакції, наприклад, пептид-трансферазний центр рибосоми, що бере участь в утворенні пептидного зв'язку білків, повністю складається з РНК.

БІОСИНТЕЗ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

Проблема біосинтезу білка і нуклеїнових кислот надзвичайно цікава не тільки для медицини й біохімії, але й для молекулярної генетики зокрема. Під час біосинтезу білка відбувається реалізація генетичної (спадкової) інформації, закладеної в ДНК, яка проявляється у вигляді відтворення відповідних білкових та небілкових структур, їх властивостей та поведінки цілого організму.

Етапи біосинтезу білка

Існують три різновиди пере­дачі генетичної інформації:

1. Реплікація — синтез дочірніх молекул ДНК, ідентичних материнській ДНК (ДНК -> ДНК).

2. Транскрипція — синтез на матриці ДНК молекул РНК, нуклеотид-на послідовність яких комплементарна певній ділянці матриці (ДНК—> РНК).На ДНК-матрицях утворюються всі три типи РНК — мРНК, рРНК, тРНК.

3. Трансляція — синтез білків, амінокислотна послідовність якихвизначається нуклеотидною послідовністю мРНК (мРНК —> білок).

У клітинах, інфікованих РНК-вмісними вірусами, відбуваються ще такі процеси, як зворотна транскрипція  і реплікація РНК. Зворотна транскрипція — синтез ДНК, нуклеотидна послідовність якої комплементарна послідовності молекули РНК (РНК —> ДНК). Реплікація РНК — синтез молекул РНК на матриці вірусної РНК для утворення нових вірусних частинок (РНК -> РНК).

Крім того, важливими процесами у передачі генетичної інформації є репарація, рекомбінація і транспозиція ДНК.

1. Репарація — ферментативне видалення і повторний синтез ділянок ДНК, що отримали пошкодження під дією фізичних та хімічних агентів.

2. Рекомбінація — обмін генетичним матеріалом між різними молекулами ДНК. За цих умов утворюються так звані рекомбінантні ДНК.

3. Транспозиція — переміщення гена чи групи генів із одного місця геному в інше. Такі гени називаються транспозонами, або стрибаючи­ми генами. Вони можуть викликати перебудову тих ділянок ДНК, поряд з якими вони розміщуються, впливають на мінливість організмів і їх еволюцію.

Біосинтез ДНК (реплікація)

Після того, як було встановлено, що ДНК утворюється шляхом побудови на існуючій молекулі нових ланцюгів, виникло питання яким чином відбувається подвоєння вихідної молекули. Були висунуті три гіпотетичних механізми реплікації.

·                     Консервативний механізм — при такому способі розкручування спіралі не відбувається, існуюча подвійна спіраль є матрицею для синтезу двох нових ланцюгів. Нова спіраль будується повністю з нового матеріалу, існуюча спіраль залишається незмінною.

·                     Напівконсервативний механізм — існуюча спіраль розкручується, на кожному полінуклеотидному ланцюзі комплементарно будується новий. Таким чином нова подвійна спіраль є «гібридом» старого та нового ланцюгів

·                     Дисперсивний механізм — існуюча спіраль розривається на кожному півоберті шляхом багаторазової фрагментації. Синтез нових ланцюгів проходить на фрагментах, які потім хрест-нахрест зливаються з відрізками нового матеріалу. Кожний полінуклеотид ний ланцюг складається з відрізків старого та нового матеріалу, які чергуються.

З метою з'ясувати, який механізм є дійсним Меселсон та Сталь провели експерименти з міченою ДНК, яка містила у своєму складі важкий ізотоп азоту. В результаті дослідження вдалося виявити, що ДНК синтезується за напівконсервативним механізмом.

Для реплікації необхідні материнська дволанцюгова ДНК, чотири дезоксирибонуклеозидтрифосфати (дАТФ, дГ ТФ, дТТФ, дІДТФ), іони Мд2+, Zn2+, ферменти і білкові фактори реплісоми.

У кільцевих молекулах ДНК реплікація починається з певної ділянки (нуклеотидної послідовності завдовжки 100-200 пар основ) і перебігає в обох напрямках до повної реплікації молекули. Ділянка, що є точкою початку росту в процесі реплікації ДНК і має V-подібну конфігурацію, називається репліка-тивною вилкою. Реплікація ДНК еукаріотів починається одночасно у багатьох місцях; вважають, що число точок початку реплікації перевищує тисячу. Із кожної точки одночасно у протилежних напрямках рухаються дві реплікативні вилки.

Перед точкою початку реплікації під дією ферментів геліказ (від helix — спіраль) невеличка ділянка подвійної спіралі розплітається, при­чому на розділення кожної пари основ витрачається енергія гідролізу двох молекул АТФ. Далі до ділянки ланцюгів, що розділились, приєднується декілька молекул ДНК-зв'язаних білків, які перешкоджають зворотному з'єднанню ланцюгів. Завдяки цьому нуклеотидні послідовності ланцюгів ДНК стають доступними для дії ДНК-полімерази. Остання синтезує нові ланцюги ДНК, комплементарні ланцюгу матриці. Тобто, якщо в матричному ланцюгу знаходиться тимін, то у дочірньому ланцюгу на це місце стає залишок аденіну, і навпаки. Аналогічним чином, якщо в матричному ланцюгу стоїть залишок цитозину, то у дочірній ланцюг включається залишок гуаніну, і навпаки. Дезоксирибонуклеотиди приєднуються своєю а-фосфатною групою до вільного гідроксилу 3-кінця ланцюга, що синтезується . Енергія на утворення кожного нового фосфодіефірно-го зв'язку забезпечується відщепленням від дезоксирибонуклеозидтрифосфату пірофосфатного залишку. Таким чином, рівняння синтезу ДНК у найпростішій формі має такий вигляд:

m(дАТФ + дТТФ) + n(дГТФ + дЦТФ)

Синтез нових ланцюгів відбувається тільки в напрямку 5'—>3', причому антипаралельно до матричного ланцюга.

Один ланцюг (ведучий) синтезується безперервно в напрямку руху реплікативної вилки, а другий (відстаючий) переривчасто з утворенням фрагментів завдовжки близько 2000 нуклеотидів у прокаріотів і значно коротших в еукаріотів. Ці так звані фрагменти Оказакі (японський учений, який вперше їх відкрив) синтезуються у напрямку, протилежному руху реплікативної вилки.

Головний фермент, що каталізує реплікацію обох ланцюгів у прокаріотів — ДНК-полімераза III, а в еукаріотів — ДНК-полімераза а. Інші ДНК-полімерази відіграють допоміжну роль у реплікації. При дослідженні різних ДНК-полімераз з'ясувалось, що вони не спроможні почати синтез нового ланцюга, а приєднують нуклеотиди до З'-ОН-кінця ланцюга приманки. Приманкою служить короткий відрізок РНК, комплементарний матричному ланцюгу ДНК. Такий олігонуклеотид називають праимером (від англ primer — приманка) і синтезується він за допомогою специфічної РНК-полімерази (праймази).

 

Таким чином, синтез фрагмента Оказакі починається з праймера, який після завершення синтезу фрагмента видаляється, а розриви між фрагментами заповнюються де-зоксирибонуклеотидами під дією ДНК-полімерази І. Врешті фрагменти Оказакі з'єднуються один з одним за допомогою ферменту ДНК-лігази. Два нові ланцюги, з'єднані зі своїми комплементарними ланцюгами, утворюють дві дочірні подвійні спіралі, кожна з яких містить один материнський і один новосинтезований ланцюг.

Важливе значення має здатність ДНК-полімераз проявляти, крім полімеразної активності, екзонуклеазну. Якщо в ході реплікації включиться некомплементарний нуклеотид, фермент робить крок назад, відщеплює неправильний нуклеотид і після цього знову продовжує полімеразні реакції. Завдяки такому коректуванню частота помилок при реплікації ДНК не перевищує однієї помилки на 109-1010 нуклеотидів.

Біосинтез РНК (транскрипція)

Для транскрипції необхідні ДНК-матриця, фермент ДНК-залежна РНК- полімераза, 4 нуклеозидтрифосфати й іони Мд2+. Як матриця використовується тільки один ланцюг ДНК.

Друга відмінність транскрипції від реплікації: транскрибується не вся молекула ДНК, а лише певна ділянка (ген чи група генів). Тому в ДНК є сигнальні нуклеотидні послідовності, які вказують на початок та кінець ділянок молекули, що підлягають транскрипції (промоторні і термінальні послідовності).

У прокаріотів є тільки одна РНК-полімераза, яка каталізує синтез усіх 3 типів РНК, а в еукаріотів є три ядерні РНК-полімерази (І, II і III) і одна мітохондріальна. РНК-полімераза І бере участь у транскрипції рРНК, II — у транскрипції мРНК і III — у транскрипції тРНК і 5S-pPHK.

Спочатку РНК-полімераза розпізнає промоторну ділянку ДНК і зв'язується з нею. Це зумовлює локальне розходження ланцюгів подвійної спіралі ДНК. Для початку синтезу РНК не потрібна приманка. Фермент розміщує перший нуклеозидтрифосфат (звичайно ГТФ або АТФ) комп­лементарно до матриці і послідовно приєднує нуклеотиди фосфодіефір-ним зв'язком до вільної З'-ОН групи рибози. Таким чином, ланцюг РНК синтезується у напрямку 5'-3'. Комплементарні пари у процесі транскрипції Г—Ц і А—У, тобто замість тимінових залишків ДНК у РНК включається залишок урацилу. РНК-полімераза, на відміну від ДНК-полімерази, не здатна виправити помилки. Синтез ланцюга РНК припиняється, як тільки РНК-полімераза доходить до термінальної послідовності ДНК (стоп-сигналу).

Після завершення транскрипції і звільнення РНК відновлюється двоспіральна структура ДНК. Відзначимо, що з одного гена можуть одночасно транскрибуватись багато ланцюгів РНК.

Ряд антибіотиків гальмують синтез РНК і використовуються для вивчення механізму цього процесу. Одні з них зв'язуються з матрицею ДНК, інші — з РНК-полімеразою. Актиноміцин Д проникає (інтеркалює) всередину між сусідніми основами Г-Ц. Це зумовлює  локальну деформацію матриці перешкоджає рухові НК-полімерази по матриці. Актиноміцин Д гальмує синтез всіх типів РНК як у прокаріотів, так і в еукаріотів. Він проявляє протипухлинну дію, але внаслідок великої токсичності використовується рідко. Аналогічним чином діє рубоміцин.

Рифампіцин зв'язується з Р-субодиницею РНК-полімерази прокаріотів, гальмуючи ініціацію синтезу РНК. На РНК-полімерази еукаріотів рифампіцин не діє і широко використовується як протимікробний препарат.

Стрептолідигін також зв'язується з Р-субодиницею, але інгібує процес елонгації після ініціації росту ланцюга РНК. а-аманітин, отруйна речовина із блідої поганки, є сильним інгібітором РНК-полімерази II еукаріотів, пригнічує синтез матричних РНК.

Дозрівання РНК

Усі типи РНК синтезуються у вигляді РНК-попередників, які після транскрипції зазнають певних змін, перетворюючись у біологічно ак­тивні РНК. Цей процес називається дозріванням, або процесингом. Молекули 5S-PHK, 8S-pPHK, 18S-pPHK і 28S-pPHK утворюються із одного попередника (прерибосомної РНК) шляхом фрагментації і відщеплення нуклеотидів під дією ендо- і екзонуклеаз. тРНК також утворю­ються із більш довгих РНК-попередників у результаті видалення зайвих нуклеотидів, крім того, ряд основ модифікуються (шляхом метилювання, дезамінування, відновлення). До тРНК у ході процесингу приєднується З'-кінцева послідовність - Ц-Ц-А.

Дуже складним процесом є утворення еукаріотних матричних РНК із попередників, що мають назву гетерогенні ядерні РНК (гяРНК). До 3'-кінця гяРНК послідовно приєднуються 100-200 залишків аденілової кислоти, утворюється полі (А) — хвіст мРНК. До 5'-кінцевого залишка приєднується трифосфатним зв'язком 7-мєтилгуанозин, утворюючи "шапочку", або "кеп". "Хвіст" і "шапочка", вірогідно, підвищують стабільність мРНК, охороняючи її від розщеплення під дією цитоплазматичних нуклеаз. Крім того, "шапочка" бере участь у зв'язуванні мРНК з рибосомами на початкових стадіях біосинтезу білків.

Як відомо, еукаріотні гени містять два види нуклеотидних послідовностей — екзони та інтрони. Екзони кодують амінокислотну послідовність білків, а інтрони не кодують, тобто не транслюються. Функція інтронів точно не встановлена, можливо, вони є регуляторними сигналами. У процесі транскрипції РНК-полімераза списує шформацію із екзошв та інтронів. Тому первинні транскрипти (гяРНК) значно довші, ніж мРНК. На гяРНК діють специфічні ферменти, вирізають інтрони і зшивають екзони. В цьому процесі бере участь мала ядерна РНК (мяРНК). Ферментативне з'єднання екзонів називається сплайсингом. Після завершення сплайсингу зрілі мРНК виходять із ядра в цитоплазму, а інтронні фрагменти розщеплюються нуклеазами до нуклеотидів, які знову використовуються для синтезу РНК в ядрі.

БІОСИНТЕЗ БІЛКА І ЙОГО РЕГУЛЯЦІЯ

Процес синтезу білків (трансляція) значно складніший за синтез нуклеїнових кислот. В ньому беруть участь не менше 20 ферментів, необхідних для активації амінокислот, понад 70 (40S і 30S) різних рибосомних білків, більше десяти білкових факторів ініціації, елонгації і термінації синтезу поліпептидних ланцюгів, понад 70 видів транспортних і рибосомних РНК. Крім того, не менше 100 додаткових ферментів каталізують реакції посттрансляційних модифікацій білків.

Генетичний код

Перед вивченням механізму утворення поліпептидного ланцюга розглянемо спосіб запису генетичної інформації, так званий генетичний код і "слова", або кодони, що його складають. На першому етапі реалізації генетичної інформації, тобто під час транскрипції, нуклеотидна послідовність генів ДНК переписується за принципом комплементарності у нуклеотидну послідовність матричної РНК. На другому етапі послідовність нуклеотидів мРНК визначає послідовність амінокислот у поліпептидному ланцюзі білка.

Властивості генетичного коду

1.                 Триплетність — значущою одиницею коду є поєднання трьох нуклеотидів (кодон). Кожну амінокислоту кодує 3 нуклеотиди.

2.                 Безперервність — між кодонами немає розділових знаків, тобто інформація прочитується безперервно. Кожний з триплетів не залежить один від одного і під час біосинтезу зчитується повністю.

3.                 Дискретність — один і той же нуклеотид не може входити одночасно до складу двох або більш кодонів.

4.                 Специфічність — у переважній більшості випадків певний кодон відповідає тільки одній амінокислоті.Певні кодони відповідають тільки певним амінокислотам .

5.                 Виродженість (надмірність) — одній і тій же амінокислоті може відповідати декілька кодонів. Кожну амінокислоту кодує більше як 1 кодон.

6.                 Універсальність — «стандартний» генетичний код працює однаково в організмах різного рівня складності — від вірусів до людини.

Етапи біосинтезу білка

Першим етапом біосинтезу білків є активація і відбір амінокислот. На цьому етапі, що відбувається у цитозолі клітин, 20 амінокислот приєднуються ефірним зв'язком до відповідних "своїх" тРНК. Високоспецифічні ферменти аміноацил-тРНК-синтетази каталізують дві стадії цього етапу. На першій стадії за рахунок енергії АТФ карбоксил амінокислоти приєднується високоенергетичним зв'язком до залишку аденілової кислоти. Аміноациладенілат залишається зв'язаним з активним центром ферменту, а під час другої стадії фермент каталізує перенесення аміноациль­ного залишку на 3'‑кінцевий залишок аденілової кислоти в молекулі тРНК. Складноефірний зв'язок карбоксилу амінокислоти з гід­ро­ксилом тРНК є високоенергетичним.

Для кожної із 20 амінокислот є своя аміноацил-тРНК-синтетаза, що також розпізнає одну чи де­кілька тРНК, відповідних даній амінокислоті.

Таким чином, аміноацил-тРНК-синтетази мають специфічні ділянки для зв'язування амінокислоти, тРНК і АТФ. Фермент розпізнає ­послідовність нуклеотидів у дигідроуридиловій петлі тРНК, що містить модифіковану основу дигідроуридину, тому цю стадію називають ще ­рекогніцією (з англ. recognition – розпізнавання). Вірогідно, що всі тРНК, специфічні до одної амінокислоти, мають у цій ділянці однакову послідовність нуклеотидів, хоч і різні антикодони в антикодоновій петлі. Точність синтезу поліпептидного ланцюга визначається, головним чином, специфічністю аміноацил-тРНК-синтетазної реакції. Так, якщо після утворення синтетазою аміноацил-тРНК амінокислотний залишок перетворити хімічним шляхом в інший (наприклад, аланін у цистеїн), то під час трансляції у відповідних положеннях поліпептидного ланцюга замість аланіну включається цистеїн.

Після активації молекули аміноацил-тРНК дифундують до рибосом, на яких проходить біосинтез білка. Їх діаметр дорівнює близько 21 нм, маса близько 4 млн, коефіцієнти седиментації цілої рибосоми – 80S, великої субчастинки – 60S і малої – 40S.

У процесі синтезу поліпептидного ланцюга білка розрізняють стадії ініціації, елонгації і термінації.

Стадія ініціації починається з утворення комплексу між малою (40S) субчастинкою рибосоми, молекулами матричної РНК і ініціаторної аміноацил-тРНК. Зв'язування мРНК з рибосомою відбувається за рахунок локального спарювання рРНК з короткою ділянкою на 5'-кінці мРНК. Ініціаторною аміноацил-тРНК при синтезі будь-якого білка служить у прокаріотів N-формілметіонін-тРНК, в якої аміногрупа метіонінового залишку з'єднана з формільною групою, а в еукаріо­тів – метіонін-тРНК.

 Ініціаторна аміноацил-тРНК, що містить антикодон УАЦ, розпізнає ініціаторний кодон тРНК-АУГ і завдяки комплементарній ­взаємодії АУГ – УАЦ, а також взаємодії ­певної ділянки тРНК з рибосомою встановлюється у так званому пептидильному (П) центрі рибосоми, що утворюється після приєднання великої (60S) субчастинки рибосоми. В утворенні ініціаторного функціонально активного комплексу задіяні також додаткові нерибосомні білки – фактори ініціації (близько 10 білків). Під час ініціації також відбувається зв'язування і гідроліз однієї молекули ГТФ.

Елонгація починається з відбору і приєднання аміноацил-тРНК з антикодоном, комплементарним кодону мРНК, що йде за ініціаторнимі. Зв'язування аміноацил-тРНК в А-центрі здійснюється за участю білка-фактора елонгації (ФТ-1) і супроводжується гідролізом ГТФ. Між метіоніном (у прокаріотів – формілметіоніном) і амінокислотою, що знаходиться в А-центрі, утворюється пептидний зв'язок. При цьому залишок метіоніну зі своєї тРНК переноситься на аміногрупу другої амінокислоти, тобто метіонін взаємодіє з карбоксильною групою, а аміногрупа його буде вільною. Таким чином, синтез поліпептидного ланцюга починається з N-кінця і йде у напрямку до С-кінця. Реакцію утворення пептидного зв'язку каталізує пептидилтрансфераза, що входить до складу 60S-субчастинки рибосоми. В результаті реакції в П-центрі буде вільна метіонінова тРНК, а в А‑центрі – дипептидил-тРНК.

Далі рибосома переміщується вздовж мРНК у напрямі до 3'-кінця на один кодон, метіонінова тРНК вивільняється із комплексу, а дипептидил-тРНК попадає в П-центр. Ця фаза елонгації називається транслокацією і потребує участі другого фактора елонгації (ФТ-2) і гідролізу ще однієї молекули ГТФ. У звільненому А-центрі рибосоми до наступного кодону мРНК приєднується аміноацил-тРНК із відповідним антикодоном і цикл повторюється. Таким чином, під час стадії елонгації відбувається послідовне нарощення поліпептидного ланцюга по одній амінокислоті відповідно до порядку кодонів мРНК.

Швидкість нарощення поліпептидного ланцюга оцінюється в 10 амі­нокислотних залишків за секунду. На включення в поліпептид одного амінокислотного залишку затрачається 1 молекула АТФ (на стадії активації) і 2 молекули ГТФ (на стадії елонгації). Оскільки АТФ розщеплюється до АМФ, всього затрачаються 4 високоенергетичні зв'язки. Така велика витрата енергії на синтез білка служить одним із факторів забезпечення точності трансляції.

Посттрансляційні зміни білків

У міру синтезу поліпептидного ланцюга формується вторинна і третинна структура білка, яка визначається амінокислотною послідовністю, тобто первинною структурою. Досить часто синтезований по­ліпептидний ланцюг набуває біологічно активної конформації тільки після додаткових змін структури. Ці зміни можуть бути різними і об'єднуються під поняттям посттрансляційних модифікацій, які включають:

1. Утворення дисульфідних зв'язків (містків) між залишками ­цистеїну.

2. Відщеплення одного чи декількох амінокислотних залишків з кінця поліпептидного ланцюга (наприклад, метіоніну, сигнальної послідовності).

3. Розщеплення певних пептидних зв'язків у молекулі білка-попередника і видалення фрагмента ланцюга, наприклад, при перетворенні проінсуліну в інсулін, хімотрипсиногену в хімотрипсин.

4. Хімічні модифікації певних амінокислотних залишків (фосфорилювання, метилювання, гідроксилювання, карбоксилювання, йодування, ацетилювання).

5. Приєднання простетичних груп чи кофакторів, наприклад гему, піридоксальфосфату, біотину, іонів металів.

6. Утворення олігомерних білків із декількох поліпептидних ланцюгів, мономерів.

Деякі із посттрансляційних модифікацій відбуваються спонтанно, без участі ферментів. Інші, зокрема ковалентні модифікації амінокислотних залишків і реакції обмеженого протеолізу, є ферментативними процесами. Посттрансляційні модифікації приводять до утворення біологічно активної структури білка. У ряді випадків вони є зворотними і служать для регуляції активності ферментів, наприклад фосфорилювання-дефосфорилювання фосфорилази і глікогенсинтетази. Приєднання простетичних груп до апоферментів відіграє безпосередню роль у ферментативній функції і менш важливе як фактор, що визначає структуру білка.

 

Інгібітори синтезу білків

Для вивчення білкового синтезу використовуються різні антибіотики, які гальмують специфічним чином певні етапи процесу трансляції. Частина з них специфічно пригнічує синтез білків прокаріотів, але не діє на еукаріоти і завдяки цьому використовується як протимікробні засоби. Нечутливість еукаріотів до дії ряду антибіотиків зумовлюється відмінностями структури білків рибосом та інших компонентів систем трансляції прокаріотів і еукаріотів.

Стрептоміцин зв'язується з 30S-субчастинкою рибосом прокаріо­тів, порушує її структуру і зумовлює помилки при розпізнаванні кодону антикодоном.

Тетрациклін гальмує стадію елонгації, блокуючи зв'язування аміноацил-тРНК в А-центрі рибосом. Левоміцетин (хлорамфенікол) інгібує активність пептидилтрансферази 50S-субчастинок рибосом прокаріотів.

Циклогексимід діє аналогічним чином, але на фермент 60S-субчастинок рибосом еукаріотів. Пуроміцин перериває елонгацію полі­пептидного ланцюга у прокаріотів і еукаріотів. За структурою він по­дібний до кінцевого аміноациладенілату в складі аміноацил-тРНК, і під час елонгації пептидний ланцюг, що росте, переноситься не на аміно­ацил-тРНК, а на пуроміцин. Далі приєднання амінокислот стає неможливим і незавершений ланцюг з пуроміцином на кінці відділяється від рибосоми.

Еритроміцин зв'язується з 50S-субчастинкою рибосом і блокує стадію транслокації. Мутації відповідних рибосомальних білків зумовлюють появу бактерій, стійких до дії антибіотиків.Один із потужних інгібіторів білкового синтезу – являється пуроміцин. Він являє собою аналог кінцевої ділянки аміноацил-тРНК аденілової кислоти і тому легко взаємодіє з А-центром пептидил-тРНК з утворенням пептидил-пуроміцину.

Пептидил-пуроміцин не несе на собі триплет антикодону і тому тормозить єлонгацію пептидного зв»язку, викликаючи обрив реакції, тобто передчасну термінацію синтезу білка. За допомогою пуроміцину було доказано, наприклад, що гормональний ефект у ряді випадків залежить від синтезу белка de novo. Пуроміцин викликає гальмівну дію на синтез белка як у прокаріот, так і у еукаріот.

Стійкість бактерій до антибіотиків може зумовлюватись також синтезом специфічних ферментів, які розщеплюють антибіотики (наприклад, пеніцилінази), модифікують їх шляхом ацетилювання, фосфорилювання та інших реакцій і, таким чином, інактивують антибіотики. Крім того, стійкість виникає внаслідок змін бактеріальних мембран.

Специфічно гальмує синтез білків у еукаріотів дифтерійний токсин білкової природи. В клітинах еукаріотів цей білок розщеплюється протеолітичним ферментом на дві частини, одна з яких є ферментом АДФ-рибозилтрансферазою, що каталізує перенесення АДФ-рибозильного залишку з НАД+ на фактор елонгації ТF-2. Інактивація фактора зупиняє процес трансляції.