Медицина

Вступ до обміну речовин

Вступ до обміну речовин. Специфічні та загальні шляхи перетворення вуглеводів, ліпідів і білків (окисне декарбоксилювання ПВК, цикл трикарбонових кислот)

 

ВСТУП ДО ОБМІНУ РЕЧОВИН

Живі організми є відкритими системами, оскільки між організмом і навколишнім середовищем постійно відбувається обмін речовин і енергії. Організм людини споживає кисень, воду, вуглеводи, жири, білки, мінеральні солі, вітаміни, а виводить вуглекислий газ, воду, сечовину, сечову кислоту й у незначній кількості інші речовини. Із спожитих харчових речовин синтезуються специфічні для організму білки, нуклеїнові кислоти, ліпіди, вуглеводи, з яких будуються клітини, їх мембрани, органели. Разом з тим, клітини руйнують макромолекули шляхом гідролізу й окиснюють продукти розпаду (глюкозу, жирні кислоти, органічні кислоти) для того, щоб отримати енергію.

Обмін речовин включає процеси споживання, нагромадження, перетворення, використання і видалення речовин і енергії, завдяки чому живі організми ростуть, розвиваються, розмножуються в умовах навколишнього середовища, а також пристосовуються до його постійних змін. Які масштаби обміну речовин? Щоденне споживання дорослою людиною органічних речовин з їжею складає приблизно 0,6 кг; за 40-50 днів маса органічних речовин, що надійде в організм, становить близько 25 кг, що дорівнює загальній масі органічних речовин у тілі людини. Оскільки маса здорової людини зберігається постійною, то за цей період така ж маса речовин виведеться з організму. За 40 років людина споживає приблизно 6 т твердої їжі й близько 38 т води – такі величезні масштаби обміну ­речовин.

 Для розуміння обміну речовин повинні бути відомими структура речовин, реакції, в які вони вступають, ферменти, які каталізують ці реакції, і регуляторні механізми, що забезпечують нормальний обмін речовин, швидкість послідовних реакцій, при яких відбувається перетворення початкового субстрату в кінцевий продукт. Сукупність таких послідовних реакцій перетворення біомолекули до певного продукту складає метаболічний шлях. Наприклад, речовина А перетворюється в кінцевий продукт Є в результаті 6 послідовних ферментативних реакцій.

Ферменти, які каталізують ці послідовні стадії, утворюють мультиферментну систему – продукт першої реакції служить субстратом для наступної реакції, каталізується іншим ферментом тощо. Метаболічні шляхи в основному лінійні, хоч можуть бути і циклічні.

 Із різноманітних метаболічних шляхів складається метаболізм. У щиршому значенні термін "метаболізм" рівнозначний "обміну речовин і енергії", в більш точному і вузькому значенні "метаболізм" означає проміжний обмін, тобто перетворення речовин усередині клітин з моменту їх надходження до утворення кінцевих продуктів.

Катаболізм і анаболізм

 Звичайно процеси метаболізму ділять на процеси катаболізму й анаболізму. Порівняємо основні особливості цих процесів.

 Таким чином, катаболізм і анаболізм – це пов'язані, взаємодоповнювані процеси, що поєднуються через систему АТФ-АДФ, відновлені й окиснені форми коферментів (НАДН+ і НАД+), субстрати і продукти.

 Шлях катаболізму певної речовини і протилежний шлях синтезу цієї ж речовини звичайно дещо відрізняються. Наприклад, розпад глюкози до молочної кислоти в м'язах складається з 11 послідовних стадій, що каталізуються специфічними ферментами. Зворотний шлях (синтез глюкози з молочної кислоти) здійснюється в печінці й включає 8 ферментативних стадій, спільних із катаболічним шляхом, і 3 стадії, відмінні від нього. Аналогічне спостерігається під час синтезу і розпаду жирних кислот, білків, нуклеїнових кислот. Завдяки неідентичності катаболічний і анаболічний шляхи регулюються незалежно один від одного. Протилежно спрямовані катаболічні й анаболічні шляхи відрізняються своєю локалізацією в клітині, що дає їм змогу відбуватись одночасно і використовувати енергію, яка звільняється під час розпаду речовин, для біосинтезу в інших місцях клітини. Наприклад, окиснення жирних кислот відбувається в мітохондріях, а синтез – у цитоплазмі.

 Розглянемо катаболізм детальніше. У ньому можна виділити три головні стадії.

 На першій стадії макромолекули білків, жирів і вуглеводів розпадаються до своїх мономерів (гексози, пентози, жирні кислоти, гліцерин, амінокислоти). На другій стадії ці метаболіти перетворюються в один спільний продукт – ацетил-КоА. Ці дві стадії складають специфічні шляхи катаболізму, тобто різні для білків, вуглеводів і ліпідів. На третій стадії ацетил-КоА потрапляє в циклічний процес, який називається циклом лимонної кислоти, або циклом Кребса, і окиснюється до СО2 і Н2О. Перетворення піровиноградної кислоти в ацетил-КоА, цикл лимонної кислоти і ланцюг тканинного дихання відносять до загального шляху катаболізму, який завершує специфічні етапи розпаду вуглеводів, ліпідів і білків. Таким чином, під час катаболізму з різних вихідних речовин утворюються однакові кінцеві продукти.

Анаболізм також відбувається в декілька стадій, але є відмінності між тваринами, рослинами і бактеріями щодо тих речовин, з яких починаються анаболічні шляхи. Фотосинтезуючі організми будують вуглеводи із СО2 і Н2О. В організмі тварин і людини анаболізм починається з піровиноградної кислоти, ацетил-КоА, з проміжних продуктів циклу лимонної кислоти. Із порівняно невеликої кількості простих молекул-попередників утворюється широкий набір різноманітних макромолекул.

 Перетворення білків, ліпідів і вуглеводів складають центральні метаболічні шляхи: потоки метаболітів на цих шляхах досить великі (сотні чи десятки грам). В організмі є ще інші метаболічні шляхи зі значно меншим потоком метаболітів (добовий синтез чи розпад вимірюється міліграмами). Ці шляхи становлять вторинний метаболізм. Роль його полягає в утворенні таких різних біологічно активних речовин, як коферменти, гормони, медіатори, пігменти.

Отже, метаболізм виконує чотири специфічні функції:

1) постачання хімічної енергії, яка отримується шляхом розщеплення багатих енергією харчових речовин, синтезу макроергічних сполук (АТФ та інших), їх використання для виконання різних видів роботи;

2) перетворення молекул харчових речовин у низькомолекулярні метаболіти (будівельні блоки), що застосовуються далі клітиною для побудови макромолекул;

3) синтез білків, ліпідів, полісахаридів, нуклеїнових кислот та інших клітинних компонентів із цих будівельних блоків із використанням енергії АТФ і НАДФН;

4) синтез і розпад низькомолекулярних, біологічно активних речовин, необхідних для виконання будь-яких специфічних функцій.

Усі метаболічні шляхи в кінцевому результаті взаємозв'язані й при порушенні будь-якого з них змін зазнають усі інші.

Регуляція обміну речовин

 Організм здійснює тонку регуляцію метаболізму, забезпечуючи принцип максимальної економії. Швидкість катаболізму визначається не наявністю в організмі клітинного палива (глюкози, жиру), а потребою в енергії. Білки, нуклеїнові кислоти та їх структурні компоненти синтезуються тільки тоді, коли вони потрібні, й у такій кількості, яка необхідна. Надлишок харчових речовин відкладається в організмі тварин і людини. Такими запасними речовинами є глікоген і жир, а білки і нуклеїнові кислоти в запас не відкладаються.

Є декілька видів регуляторних механізмів:

1) регуляція швидкості надходження метаболітів у клітину;

2) регуляція синтезу ферментів шляхом індукції і репресії;

3) регуляція активності наявних ферментів шляхом алостеричної регуляції, ковалентної модифікації, активації проферментів.

В організмі людини клітини різних органів і тканин диференційовані для виконання специфічних біохімічних і фізіологічних функцій. Тому існують системи, які узгоджують і координують роботу різних органів і тканин. Таку інтегруючу роль відіграють гормональна (ендокринна) і ­нервова системи, а також судинна система, яка служить для перенесення всіх хімічних речовин в організмі. У нормі ці системи взаємодіють, доповнюючи одна одну.

 Дорослий здоровий організм знаходиться в стаціонарному стані й головним фактором, який визначає баланс процесів обміну речовин, є співвідношення між споживанням їжі й витратою енергії. Недостатнє харчування швидко призводить до зворотної мобілізації енергії із депонованих продуктів, однак тривале голодування чи неповноцінне харчування викликає незворотний розпад тканин. Процеси катаболізму ­часто переважають в умовах патології. А в період одужання після захворювань, у процесі загоювання ран, у молодому організмі, який росте, та під час вагітності переважає анаболізм. Патологічно виражена перевага анабо­лізму може призвести до надмірного росту (гігантизм) чи ожиріння.

Для біохімічної діагностики захворювань використовують той факт, що регуляторні механізми підтримують концентрацію ряду важливих метаболітів у певних межах (рівень норми), а при патології концентрація їх змінюється, причому ці зміни часто бувають специфічними для тієї чи іншої хвороби. Оскільки концентрація метаболітів змінюється і внаслідок споживання їжі, переходу від спокою до фізичної роботи, то дослідження проводять звичайно натще, після нічного сну.

МЕТОДИ ВИВЧЕННЯ ОБМІНУ РЕЧОВИН

У процесі вивчення обміну речовин дослідника цікавить, яких перетворень зазнають речовини (субстрати) і які ферменти каталізують їх, як забезпечуються енергією хімічні процеси, які поживні речовини потрапляють у клітини і як виводяться кінцеві продукти обміну.

Залежно від конкретної мети, вивчення обміну речовин здійснюється на різних рівнях структурної організації живого. Це можуть бути непошкоджений організм, видалені окремі органи чи тканини, популяції клітин чи субклітинних компонентів і окремі молекулярні перетворення. Розглянемо приклади методів для кожного з названих рівнів організації.

Дослідження обміну речовин на рівні всього організму

Існує ряд способів, які дають можливість з’ясувати роль перетворення окремих речовин в організмі.

 Найчастіше згодовують лабораторних тварин штучними раціонами, в яких відсутня необхідна для організму речовина. На основі таких експериментів сформувалися поняття про незамінні поживні речовини. Вони потрібні для підтримання на стаціонарному рівні обмінних процесів дорослого організму або для росту і розвитку молодого орга­нізму. Сюди були віднесені вітаміни, деякі амінокислоти та поліненасичені жирні кислоти, мінеральні речовини, макро- і мікроелементи.

 Такі речовини обов’язково повинні потрапляти в організм із продуктами харчування. Спостереження за людьми, в раціоні яких була недостатня кількість свіжих овочів і фруктів, показали, що вони хво­ріють на цингу, а у випадках обмеження надходження з продуктами харчування рослинних жирів у них спостерігається "куряча сліпота". Результати аналогічних спостережень підтвердились в експериментах на тваринах і сприяли відкриттю вітамінів С, А тощо.

Балансові дослідження

 Їх також проводять на всьому організмі. Вони дають змогу встановити добову потребу та ступінь засвоєння певних речовин їжі.

В основі балансових досліджень знаходиться визначення співвідношення між кількістю речовин, що потрапляють в організм, та кількістю речовин (або продуктів їх розщеплення), що виводяться з організму через органи виділення. Ці дослідження проводяться в так званих обмінних (метаболічних) клітках, в яких для кожної експериментальної тварини враховується кількість спожитих продуктів і виділених кінцевих метаболітів. Найчастіше вивчають азотний, водний та мінеральний баланси.

Якщо в організм з їжею і водою потрапляє більше речовин, ніж виводиться, то має місце позитивний балансовий обмін. Наприклад, при позитивному балансі води спостерігається затримка води в організмі й зменшене її виділення з екскрементами та потом. Негативний баланс води супроводжується надмірним виділенням води, тобто тканини втрачають її. У тих випадках, коли надходження речовини в організм зрівноважується такою ж кількістю продуктів кінцевого обміну, то говорять про нульовий баланс. Оскільки балансові дослідження обміну речовин проводять, як правило, на різних лабораторних тваринах (морських свинках, щурах, мишах, курчатах), то результати можуть бути різними. Найближчі до метаболізму людини результати можна одержати при проведенні балансових досліджень на мавпах та інших приматах.

У клініці нерідко проводять балансові дослідження при вивченні обміну білків, води, мінеральних речовин у здорових і хворих людей.

Цей метод досить інформативний і не має протипоказань для проведення.

Експериментальні нориці

 Експериментальні нориці допомагають вивчати обмін речовин в окремих органах чи тканинах за життя експериментальних тварин.

 Хірургічним способом у різних ділянках шлунково-кишкового тракту, зокрема на жовчних протоках тварин, створюють штучні нориці, а далі збирають кров чи лімфу, що надходить у відповідний орган і що відтікає від нього. Збирають також секрети, що виділяються у різних ділянках шлунково-кишкового тракту, і досліджують вміст окремих речовин та продуктів їх обміну. Метод дає можливість стежити за перетворенням сторонніх речовин, внесених в організм per os або парентерально.

Катетеризація кровоносних судин

Участь будь-якого органа в метаболізмі можна оцінювати, порівнюючи хімічний склад крові, що надходить до нього по артеріях і відтікає через вени. За допомогою цього методу досліджують також вплив на метаболізм специфічних речовин при введенні їх в артеріальну кров. Наприклад, катетеризація сонної артерії та яремної вени дає можливість з’ясувати роль мозку в перетворенні амінокислот, глюкози чи інших речовин, які можна додатково вводити через катетер в артерію, і стежити за зміною їх концентрації (або їх метаболітів) у венозній крові.

Дослідження in vitro. Метод ізольованих органів

Хірургічне виділення органів – один із найдавніших підходів до вивчення метаболізму. Наприклад, відомості про метаболічну роль печінки були одержані в результаті спостережень за собаками, в яких хірургічно видалили печінку. Зокрема, так була встановлена роль печінки в утворенні сечовини, глікогену тощо.

Через ізольований орган безупинно прокачують поживну речовину (перфузія) і цим підтримують його життєдіяльність. Перфузію проводять за допомогою плазми крові, фізіологічного розчину, в які додають ті речовини, що підлягають вивченню.

Досліджуючи склад рідини на вході й виході з органа, можна з'ясувати шляхи перетворення внесених речовин і роль відповідних органів у метаболізмі.

Значення цих методів помітно збільшилось з використанням ізотопних індикаторів. Наприклад, вводячи в артерію ізольованої печінки розчин глюкози і визначаючи її вміст на виході з органа (у венозній крові), встановлено, що глюкоза затримується в печінці. А наступні дослідження з використанням мічених атомів показали, що глюкоза в печінці окиснюється до СО2 і Н2О, використовується на утворення глікогену, жирів та амінокислот.

Метод ізольованих органів у поєднанні з перфузією є високоінформативним, але він не дає змоги враховувати контроль ендокринної та нервової систем за обміном речовин, що має місце в усьому організмі.

Метод зрізів органів і тканин

Тонкі зрізи завтовшки приблизно 50 мкм отримують із печінки, нирки, мозку та інших органів. Їх поміщають у рідке середовище, яке за хімічним складом близьке до внутрішнього середовища організму. Додаючи в омиваючу рідину різні речовини, стежать за їх змінами та роблять висновки про їх перетворення у відповідних органах.

Гомогенати і субклітинні фракції

 Зрізи органів містять також неушкоджені клітини, захищені клітинними мембранами та оболонками. Проникність клітинних мембран для різних хімічних речовин неоднакова, таким чином регулюються надходження та видалення речовин із клітин.

При руйнуванні клітинних мембран з'являється можливість для безпосереднього контакту між вмістом клітини і доданими речовинами. Це дає змогу встановити, які ферменти, коферменти і субстрати беруть участь у досліджуваному процесі.

Для одержання гомогенатів орган розрізають на дрібні шматочки, які поміщають у рідке ізотонічне середовище відомого складу (наприклад, 0,25 М розчин сахарози) і розтирають у ступці з піском, але в більшості випадків використовують спеціальний пристрій – гомогенізатор. Найпоширенішим є гомогенізатор Поттера. Це скляна товстостінна пробірка зі сферичним дном, в якій знаходиться підігнаний поршень, що може обертатися навколо осі за допомогою електромотора.

Пробірку з поміщеними в ній шматочками тканини рухають вгору і вниз. Тканина при цьому розтирається, клітини руйнуються, але субклітинні частинки залишаються непошкодженими. Таким чином одержують гомогенат, який значною мірою зберігає біологічну активність.

Субклітинні структури

Дослідження субклітинних структур (органел) стало можливим після освоєння методу диференційованого ультрацентрифугування. Сучасні ультрацентрифуги розвивають прискорення, яке в 300 000 разів перевищує прискорення земного тяжіння.

Для одержання субклітинних фракцій гомогенат суспензують у сахарозі й фракціонують багаторазовим центрифугуванням на холоді. Центрифугування з прискоренням 700-1000 g (g – прискорення земного тяжіння, см/с2) протягом 10 хв осаджує уривки клітинних мембран і ядра, які є найтяжчими компонентами клітини.

Надосадкову рідину від першого центрифугування знову центрифугують при 10000 g протягом 10 хв. В осад випадають переважно мітохондрії, а також лізосоми. Із надосадкової рідини від другого центрифугування під дією відцентрової сили в 100 000 g протягом не менше 1 години осаджують мікросоми і рибосоми.

Остання надосадкова рідина містить цитозоль, тобто розчинені компоненти (в даному випадку – в розчині сахарози).

У табл. наведено типові фракції, які можна одержати при диференційованому центрифугуванні, й показано найважливіші ферментативні системи кожної з них.

Дослідження культури тканин

Метод культури тканин дозволяє досліджувати біохімічні процеси в популяціях тваринних клітин і в ряді наступних клітинних генерацій. Клітини і тканини можуть вирощуватися тільки в середовищі з певним хімічним складом. У середовищі повинен бути набір усіх факторів, ­необхідних для росту і підтримання життєдіяльності клітин (вітаміни, амінокислоти, мікроелементи тощо).

У культурі тканини вирощують багато різних типів клітин, як здорових, так і злоякісних. На тканинних культурах вивчають різні впливи фізичних і хімічних факторів, моделюють різні біологічні процеси, досліджують дію ліків тощо.

Протягом останніх років техніка вирощування культури тканини дозволяє робити трансплантацію гепатоцитів, одержаних від ембріона чи молодого організму з метою компенсації ураженої печінки. Ця методика розглядається як альтернатива пересадці органів. Найчастіше для вирощування в культурі використовують клітини, виділені з ізольованого органа за допомогою ферменту колагенази або трипсину.

Аеробний розпад вуглеводів. Цикл лимонної кислоти

В аеробних умовах вуглеводи окиснюються повністю до СО2 і Н2О. Гліколіз становить першу стадію окиснення вуглеводів і закінчується утворенням піровиноградної кислоти, яка не відновлюється до молочної кислоти, як в анаеробних умовах, а окиснюється до ацетил-КоА і СО2. Далі двовуглецеві ацетильні групи (з ацетил-КоА) окиснюються до СО2 і Н2О в ході циклічної послідовності реакцій, що називаються циклом лимонної кислоти, і реакцій тканинного дихання. При окисненні глюкози до СО2 і Н2О вивільнюється значно більше енергії, ніж при гліколізі (максимально 38 моль АТФ на 1 моль глюкози проти 2 моль АТФ при анаеробному гліколізі). АТФ утворюється головним чином шляхом окиснювального фосфорилювання, поєднаного з тканинним диханням.

Окиснювальне декарбоксилювання піровиноградної кислоти

Процес окиснювального декарбоксилювання пірувату включає реакції дегідрування і декарбоксилювання, коли карбоксильна група пірувату вивільняється у вигляді СО2, а ацетильний залишок, тобто залишок оцтової кислоти, переноситься на коензим А.

Каталізує цю сукупність реакцій складний піруватдегідрогеназний комплекс, локалізований у мітохондріях. Тому спочатку піруват переходить із цитоплазми, де відбувається гліколіз, у матрикс мітохондрій.

Піруватдегідрогеназний комплекс складається з 3 різних ферментів: піруватдегідрогенази, дигідроліпоатацетилтрансферази і дигідроліпоатдегідрогенази. До його складу входять 5 коферментів: тіамін-дифосфат (ТДФ), коензим А (КоА), ліпоєва кислота, НАД і ФАД. ТДФ – це похідне вітаміну В1 (тіаміну), КоА – вітаміну В3 (пантотенової кислоти), НАД – вітаміну РР (нікотинаміду), ФАД – вітаміну В2 (рибофлавіну), а ліпоєва кислота є вітаміноподібною сполукою. При нестачі цих вітамінів окиснювальне декарбоксилювання піровиноградної кислоти і ряду інших альфа-кетокислот гальмується; накопичення пірувату і лактату зумовлює ацидоз. У хворих із спадковою недостністю піруватдегідрогенази також може розвинутись ацидоз, особливо після навантаження гдюкозою.

Кожний із ферментів піруватдегідрогеназного комплексу каталізує певний етап сумарної реакції, причому ультраструктура комплексу, компактне розміщення всіх компонентів забезпечують ефективну роботу без звільнення проміжних продуктів до завершення процесу.

Процес окиснювального декарбоксилювання пірувату супроводжується значним зменшенням стандартної вільної енергії і практично незворотний. Активність піруватдегідрогеназного комплексу регулюється двома способами. По-перше, продукти реакції – ацетил-КоА і НАДН – є алостеричними інгібіторами комплексу. І тоді, коли окиснення ацетил-КоА в циклі лимонної кислоти відстає від утворення його пірувату чи жирних кислот, активність піруватдегідрогеназного комплексу гальмується. Такий же ефект має місце при накопиченні НАДН внаслідок перевантаження дихального ланцюга. Активує комплекс фруктозо-1,6-дифосфат – проміжний продукт гліколізу. Алостеричні ефекти проявляються дуже швидко. Другий механізм регуляції (повільніший) – це переходи між активною і неактивною формами ферменту внаслідок фосфорилювання і дефосфорилювання.

Фосфорильована форма піруватдегідрогенази неактивна, а нефосфорильована – активна. Реакцію фосфорилювання ферменту під дією АТФ каталізує кіназа піруватдегідрогенази, яка активується при високому рівні НАДН і АТФ. Отже, в таких умовах піруватдегідрогеназний комплес виключається. Протилежний процес активації піруватдегідрогенази шляхом дефосфорилювання каталізує фосфатаза, яка активується іонами Са+2. Рівень їх у клітині завжди зростає при збільшенні потреби в АТФ. Кіназа і фосфатаза входять до складу піруватдегідрогеназного мультиферментного комплексу.

Реакції циклу лимонної кислоти

Цикл лимонної кислоти включає послідовно 8 реакцій, у результаті яких ацетильна група (СН3СО-) ацетил-КоА розпадається з утворенням СО2 і атомів водню, які передаються на окиснені форми коферментів НАД і ФАД. Послідовність не лінійна, а циклічна, оскільки починається з конденсації двовуглецевої ацетильної групи з щавлевооцтовою кислотою (з чотирма атомами вуглецю). В результаті виникає лимонна кислота (з шістьма атомами вуглецю), далі в реакції декарбоксилювання виділяються 2 молекули СО2 і в останній реакції циклу знову утворюється щавлево­оцтова кислота.

Цикл лимонної кислоти називають також циклом Кребса (на честь Г. Кребса – лауреата Нобелівської премії 1953 р., який відкрив його у 1937 р.) та циклом трикарбоновних кислот, оскільки ряд проміжних продуктів циклу є трикарбоновими кислотами.

Ацетил-КоА утворюється не тільки з пірувату, а й із жирних кислот, амінокислот, тому цикл лимонної кислоти розглядається як загальний, кінцевий шлях катаболізму вуглеводів, жирів і амінокислот. Усі реакції циклу відбуваються в мітохондріях. Відновлені НАДН і ФАДН2, які утворюються у реакціях дегідрування циклу, окиснюються шляхом переносу протонів і електронів по дихальному ланцюгу внутрішньої мембрани мітохондрій на кисень.

 

1.           Реакцію конденсації ацетил-КоА з оксалоацетатом з утворенням цитрату каталізує цитрат-синтаза. Реакція не вимагає затрати АТФ, а необхідна енергія забезпечується гідролізом тіоефірного зв'язку ацетил-КоА. Цитрат-синтаза – регуляторний фермент циклу, активність його гальмується АТФ, НАДН і проміжним продуктом циклу – сукциніл-КоА.

2. Цитрат ізомеризується в ізоцитрат двохетапною реакцією під дією аконітази. При відщепленні молекули води утворюється цис-аконітова кислота, яка, не відділяючись від активного центру ферменту, приєднує ту ж молекулу води іншим способом. Реакція зворотна.

3. Ізоцитрат окиснюється шляхом дегідрування й одночасно декарбоксилюється під дією ізоцитратдегідрогенази. Для дії ферменту потрібні іони Мg2+ чи Мn2+. Алостеричні активатори ізоцитратдегідрогенази – АДФ і НАД+, інгібітори – АТФ і НАДН. У цитоплазмі клітин відкрита НАДФ-залежна ізоцитратдегідрогеназа.

4. Окиснювальне декарбоксилювання альфа-кетоглутарату до сукциніл-КоА каталізує альфа-кетоглутаратдегідрогеназний комплекс, що, як і піруват­дегідрогеназний комплекс, включає 3 ферменти і 5 коферментів – ТДФ, ліпоєву кислоту, КоА, ФАД і НАД+. Механізм реакції також аналогічний до окиснювального декарбоксилювання пірувату. Частина енергії, що вивільняється в реакції окиснення, зберігається в макроергічному тіоефір­ному зв'язку сукциніл-КоА. Активність альфа-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу гальмують АТФ і продукти реакції – НАДН і сукциніл-КоА.

5. У наступній реакції розрив макроергічного зв'язку сукциніл-КоА при перетворенні у вільний сукцинат поєднаний з утворенням гуанозинтрифосфату, так що енергія макроергічного зв'язку зберігається.

Отже, ця реакція субстратного фосфорилювання аналогічна реакціям синтезу АТФ у процесі гліколізу. Каталізує її сукциніл-тіокіназа. Синтезований ГТФ може передати свою кінцеву фосфатну групу на АДФ з утворенням АТФ при дії нуклеозиддифосфаткінази.

6. Сукцинат окиснюється до фумарату. Сукцинатдегідрогеназа, яка каталізує цю реакцію, містить простетичну групу ФАД, що відновлюється до ФАДН2, і залізо-сірчані центри. Конкурентним інігібітором сукцинатдегідрогенази є малонова кислота. Серед ферментів циклу лимонної кислоти тільки сукцинатдегідрогеназа локалізована на внутрішній мембрані мітохондрій, а інші знаходяться в їх матриксі.

7. Стереоспецифічний фермент фумараза (фумаратгідратаза) ката­лізує гідратацію фумарової кислоти в L-яблучну (малат).

8. Малат окиснюється НАД-залежною малатдегідрогеназою до оксалоацетату.

Молекула оксалоацетату може з'єднуватись із новою молекулою ацетил-КоА і починати новий оберт циклу.

Аналіз послідовності дозволяє зробити ряд висновків:

1. У цикл входить двовуглецева ацетильна група (в складі ацетил-КоА), а виходять 2 молекули СО2.

2. У чотирьох реакціях дегідрування від проміжних продуктів циклу відриваються 4 пари атомів водню. Із них 3 пари використовуються на відновлення НАД+, а одна пара – ФАД.

3. Частина атомів кисню, необхідних для утворення СО2, і атомів водню – для відновлення коферментів, постачаються молекулами води, які застосовуються в реакціях циклу.

4. Молекула оксалоацетату, що потрапляє в цикл, у результаті ­одного оберту циклу регенерується. Таким чином, оксалоацетат у циклі не ви­тра­чається і наново не утворюється (як і інші проміжні продукти циклу).

5. Один раз у циклі має місце реакція субстратного фосфорилювання, коли за рахунок макроергічного зв'язку субстрату утворюється молекула ГТФ (АТФ).

Для нових обертів циклу відновлені коферменти повинні окиснитись, що відбувається шляхом переносу електронів і протонів по дихальному ланцюгу внутрішньої мембрани мітохондрій на молекулярний кисень з утворенням молекул води. Саме тому цикл лимонної кислоти є аеробним киснезалежним шляхом, хоч у жодній реакції циклу молекулярний кисень не використовується. За рахунок окиснювального фосфорилювання, поєднаного з переносом електронів і протонів по дихальному ланцюгу, забезпечується синтез основної кількості АТФ. Враховуючи, що окиснення однієї молекули НАДН призводить до утворення 3 молекул АТФ, окиснення однієї молекули ФАДН2 – 2 АТФ, загальний вихід АТФ при окисненні однієї молекули ацетил-КоА складає:

Енергетичний баланс аеробного розпаду глюкози

Для з'ясування кількості АТФ, яка синтезується при повному окисненні глюкози до СО2 і Н2О, необхідно сумувати вихід АТФ у кожній стадії процесу:

1) гліколізу в аеробних умовах;

2) окиснювального декарбоксилювання пірувату;

3) циклу лимонної кислоти;

4) дихального ланцюга.

При гліколітичному розпаді однієї молекули глюкози в аеробних умовах утворюються 2 молекули піровиноградної кислоти, 2 АТФ і 2 НАДН.

Окиснювальне декарбоксилювання двох молекул пірувату дає 2 ацетил-КоА і 2 НАДН.

При окисненні 1 молекули ацетил-КоА, як розглянуто вище, утворюється 12 молекул АТФ. Окиснення в дихальному ланцюгу молекул НАДН, які утворюються при гліколізі й окиснювальному декарбоксилюванні пірувату, дає по 3 АТФ на 1 НАДН. Сумарний вихід АТФ у результаті повного окиснення 1 молекули глюкози складає 38 молекул (або 38 моль на 1 моль глюкози). Із 38 молекул чотири синтезуються шляхом субстратного фосфорилювання (2 – в гліколізі й 2 – в циклі лимонної кислоти) і 34 – в ході окиснювального фосфорилювання, поєднаного з перенесенням електронів по дихальному ланцюгу.

Проте в такому розрахунку не прийнято до уваги, що гліколіз відбувається в цитоплазмі, а тканинне дихання з окиснювальним фосфорилюванням – у мітохондріях. Мембрана мітохондрій непроникна для НАДН, утвореного під час гліколітичного окиснення гліцеральдегід-3-фосфату в цитоплазмі. Тому для передачі водню з цитоплазматичних НАДН на дихальний ланцюг внутрішньої мембрани мітохондрій існують особливі системи, які називаються човниковими. Механізм їх дії такий: цитоплазматичний НАДН відновлює якусь речовину, її відновлена форма переноситься через мембрану в матрикс мітохондрій, де окиснюється НАД- чи ФАД-залежним ферментом і повертається в цитоплазму. Відновлений НАДН чи ФАДН віддає електрони і протони на дихальний ланцюг внутрішньої мітохондріальної мембрани.

У клітинах печінки, міокарда і нирок функціонує малат-аспартатна човникова система, яка забезпечує утворення 3 молекул АТФ на одну молекулу цитоплазматичного НАДН.

У скелетних м'язах і клітинах мозку перенос водню з цитоплазматичного НАДН здійснює гліцеролфосфатна човникова система.

У цьому випадку мітохондріальна гліцерол-3-фосфатдегідрогеназа є флавіновим ферментом, який передає 2 атоми водню на убіхінон, тому утворюються не 3 молекули АТФ, а 2. Таким чином, у скелетних м'язах і мозку окиснення 2 молекул цитоплазматичного НАДН дає 4 молекули АТФ. Отже, сумарний вихід АТФ із молекули глюкози складає 36 молекул.

При повному окисненні глюкози вивільняється 2880 кДж/моль енергії.

Роль циклу лимонної кислоти в анаболізмі

Як розглянуто вище, цикл лимонної кислоти служить для окиснення до СО2 і Н2О ацетил-КоА і, таким чином, є заключним етапом катаболізму вуглеводів, жирних кислот і амінокислот. Але, крім того, цикл відіграє значну роль і в біосинтезі основних класів біомолекул. Так, субстрат і проміжні продукти можуть виходити з циклу і використовуватись як попередники для біосинтезу різних сполук. Зокрема, альфа-кетоглутарат, оксалоацетат, а також тісно зв'язаний із циклом лимонної кислоти піруват використовуються для синтезу амінокислот. Оксалоацетат є проміжним продуктом глюконеогенезу – процесу синтезу глюкози з невуглеводних попередників (лактату і пірувату, амінокислот). Таким чином, будь-який проміжний продукт циклу лимонної кислоти, переходячи в оксалоацетат, може застосовуватись для синтезу глюкози і глікогену. Ацетил-КоА є вихідною речовиною для синтезу жирних кислот, який здійснюється в цитоплазмі. І оскільки ацетил-КоА утворюється в мітохондріях, а через мітохондріальну мембрану прямо не переноситься, транспортною системою є сама лимонна кислота. Тобто в умовах, які сприяють використанню ацетил-КоА для синтезу жирних кислот, мітохондріальна цитрат-синтаза каталізує утворення лимонної кислоти, яка не починає цикл, а виходить у цитоплазму, де під дією ферменту цитратліази розпадається на ацетил-КоА й оксалоацетат. Ще один проміжний продукт циклу лимонної кислоти – сукциніл-КоА – використовується для синтезу гему.

При застосуванні проміжних продуктів циклу лимонної кислоти (від цитрату до оксалоацетату) для біосинтезу різних речовин у клітині знижується вміст оксалоацетату і в результаті активність циклу повинна би зменшуватись аж до зупинки його. Така вірогідність запобігається реак­ціями, які покривають втрати проміжних продуктів циклу. Основною з них є перетворення в мітохондріях пірувату в оксалоацетат під дією піруваткарбоксилази.

У піруваткарбоксилазі коферментом виступає вітамін біотин. За ­рахунок розщеплення АТФ утворюється проміжний комплекс – фермент-біотин-СОО-, з якого карбоксильна група переноситься на піруват. Активатором піруваткарбоксилази є ацетил-КоА. Таким чином, при на­явності ацетил-КоА і недостачі оксалоацетату стимулюється піруваткарбоксилазна реакція, в результаті утворюється більше оксалоацетату, що забезпечує синтез лимонної кислоти і функціонування циклу. Використання проміжних продуктів циклу лимонної кислоти з біосинтетичною метою повинно супроводжуватись катаболічною активністю циклу для утворення АТФ, який необхідний для здійснення реакцій анаболізму. Таким чином, цикл повинен одночасно виконувати обидві функції. Зазначимо, що окиснення ацетил-КоА в циклі, тобто катаболічна функція, не вимагає одночасного застосування проміжних продуктів для синтезу біомолекул.

Отже, цикл лимонної кислоти разом із тканинним диханням і окиснювальним фосфорилюванням забезпечує утворення основної кількості АТФ у клітині, об'єднує процеси метаболізму всіх основних класів біомолекул, зв'язує процеси катаболізму й анаболізму.

Регуляція циклу лимонної кислоти

Цикл лимонної кислоти регулюється рядом факторів. По-перше, концентрацією субстратів – ацетил-КоА і оксалоацетату. Ацетил-КоА утворюється при катаболізмі вуглеводів і жирних кислот, його рівень визначається активністю піруватдегідрогеназної реакції і ­окисненням жирних кислот. Концентрація в мітохондріях оксалоацетату, який утворюється в піруваткарбоксилазній реакції, а також з аспарагінової кислоти, досить низька і залежить від метаболічних умов. Використовується оксалоацетат у різних метаболічних шляхах:

1) у циклі лимонної кислоти;

2) для глюконеогенезу;

3) для утворення аспарагінової кислоти, яка застосовується для синтезу пуринів, піримідинів, аргініну і сечовини;

4) для компенсації втрат із циклу лимонної кислоти інших проміжних продуктів (цитрату, альфа-кетоглутарату, сукциніл-КоА).

У нормальних умовах баланс між кількістю ацетил-КоА й оксалоацетату досягається завдяки активації ацетил-коензимом А піруваткарбоксилазної реакції. Баланс порушується під час голодування, коли внаслідок окиснення тканинного жиру в печінці накопичується надлишок ацетил-КоА, і при цукровому діабеті, коли порушується катаболізм глюкози і внаслідок недостачі пірувату не утворюється достатня кількість оксало­ацетату. У цих випадках відносна нестача оксалоацетату, порівняно з рівнем ацетил-КоА, гальмує цикл лимонної кислоти, зумовлює підвищений синтез з ацетил-КоА кетонових тіл і розвиток кетозу.

Крім цитрат-синтази, регуляторними ферментами циклу лимонної кислоти є ізоцитратдегідрогеназа й альфа-кетоглутаратдегідрогеназа. Усі вони чутливі до співвідношення концентрацій у клітині АТФ/АДФ, НАДН/НАД+.

При високих значеннях цих відношень активність регуляторних ферментів циклу пригнічується. Таким чином, коли в клітині є високий рівень АТФ, робота циклу припиняється, а при використанні АТФ і зростанні рівня АДФ – стимулюється. Інгібітором цитрат-синтази й альфа-кето­глутаратдегідрогенази служить також сукциніл-КоА – проміжний продукт циклу.