Медицина

Будова і властивості ферментів

БУДОВА І ВЛАСТИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ. МЕХАНІЗМ ДІЇ ФЕРМЕНТІВ. ІЗОФЕРМЕНТИ, КЛАСИФІКАЦІЯ ФЕРМЕНТІВ. РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ. ФЕРМЕНТОДІАГНОСТИКА. ФЕРМЕНТОПАТІЇ. ЕНЗИМОТЕРАПІЯ

 

Одна з основних відмінностей між живим і неживим світом полягає в тому, що постійність неживого грунтується на його хімічній незмінності, тоді як стабільність і збереження живого базується на безперервних хімічних змінах, що відбуваються в ньому.

Хімічні процеси в організмі каталізуються особливими речовинами (біокаталізаторами), що називаються ферментами, або ензимами. Вчення про ферменти – одна з найважливіших проблем сучасної біології і біохімії. Саме тому ХХ ст. називають ще століттям ферментів, бо вчення про них – це дітище цього століття. Зараз встановлено, що немає жодного процесу в організмі, який би відбувався без участі ферментів. Травлення, енергозабезпечення, побудова структурних компонентів клітин і тканин, ріст, розмноження, м'язове скорочення, згортання крові пов'язані з роботою ферментів.

Хімічна природа ферментів

За хімічною природою ферменти – це білки, що проявляють каталітичні властивості, тобто вони прискорюють перебіг різних хімічних процесів, які відбуваються в живому організмі. Ферментам притаманні всі фізико-хімічні властивості білків: висока молекулярна маса, розщеплення до амінокислот під час гідролізу, утворення колоїдоподібних розчинів; вони не стійкі до впливу високих температур та солей важких металів, проявляють антигенні властивості, піддаються фракціонуванню. Як і білки, ферменти поділяються на прості й складні. Прості, або однокомпонентні, ферменти містять у своєму складі тільки амінокислоти. Наприклад, пепсин, уреаза, РНКаза та інші. Більшість ферментів є двокомпонентними, тобто складаються з білкової і небілкової (простетичної) частин. Їх називають ще голоферментами, а їх складові, відповідно, апоферментами (білкова частина) і простетичною групою, або кофактором (небілкова частина ферменту).

Простетична група міцно і постійно зв'язана з апоферментом. Якщо небілкова частина ферменту зв'язана з апоферментом непостійно, тобто знаходиться в дисоційованому стані й приєднується до апоферменту тільки під час каталітичного процесу, то її називають коферментом, іноді – кофактором. Усе ж термін кофактор більше вживається в тих випадках, коли небілкова частина ферменту представлена якимось мікроелементом (металом), якому притаманна ще й функція активатора. Загалом, небілкова частина складного ферменту – низькомолекулярна і термостабільна, тоді як білкова – високомолекулярна і термолабільна. Важливо, що апофермент і кофермент проявляють ферментативні властивості тільки при поєднанні їх.

Апофермент у складному ферменті вказує на тип перетворень, відповідає за так звану специфічність дії ферменту. Небілкова частина голоферменту сприяє зв'язуванню ферменту з речовиною, на яку він діє (субстратом), здійснює передачу електронів, атомів, іонів з однієї речовини в іншу. Важливо, що одна і та ж небілкова речовина в одних ферментах може бути зв'язана з білковою міцно (як простетична), а в інших – слабо, і то лише під час реакції (кофермент). Наприклад, ФАД легко відщеплюється від білкової частини оксидази D-амінокислот, а з ферментами тканинного дихання він утворює міцний зв'язок.

Коферменти, або коензими

Кофермент, або коензим, бере участь у перетворенні субстрату, тоді як апофермент вказує на тип реакції. Коферментом можуть виступати різні за природою низькомолекулярні органічні, а також неорганічні речовини (метали), що здатні зв'язуватись із субстратом і видозмінювати його.

Найчастіше коферментами виступають вітаміни та їх похідні. Наприклад, пірофосфорний ефір вітаміну В1 – ТПФ – є коферментом піруватдегідрогенази, альфа-кетоглутаратдегідрогенази та транскетолази; В1 – ТПФ – є коферментом піруватдегідрогенази похідні вітаміну В2 – ФМН, ФАД входять до складу оксидно-відновних ферментів. Сюди ж належать і похідні вітаміну В5 – НАД і НАДФ.

Коферментом переамінування та декарбоксилювання амінокислот є похідні вітаміну В6 – піридоксальфосфат. Вітамін В3 є основою для утво­рення коферменту А (кофермент ацилювання) та пантотеїнфосфату – коферменту ацилпереносного білка синтезу жирних кислот. Вітамін В10 в організмі перетворюється на кофермент ТГФК, що бере участь у перенесенні одновуглецевих фрагментів. Із вітаміну В12 утворюється два коферменти – метилкобаламін та дезоксиаденозил-кобаламін, які разом із ТГФК переносять і видозмінюють одновуглецеві фрагменти під час синтезу нуклеїнових кислот у кровотворних органах.

Вітамін Н (біотин) утворює активний кофермент – карбоксибіотин, що бере участь у процесах карбоксилювання. Роль коферментів можуть відігравати і вітаміноподібні речовини – ліпоєва кислота, убіхінон, карнітин та інші. Перша з них входить до складу піруватдегідрогеназного комплексу і бере участь в оксидно-відновному перетворенні альфа-кетокислот. Убіхінон служить проміжним переносником електронів і Н+ в дихальному ланцюзі, а карнітин входить як кофермент до складу трансфераз, що переносять залишки жирних кислот через мітохондріальну мембрану.

Найчастіше коферментами виступають нуклеозиддифосфати, рідше– нуклеозидмонофосфати. У складі коферментів нуклеозиддифосфати зв'язуються з вуглеводами, ліпідами, амінокислотами тощо. Реакції, в яких беруть участь нуклеотидні коферменти, зводяться до перетворення субстрату в молекулі коферменту. Наприклад, перетворення УДФ-глюкози в УДФ-галактозу (стереоізомеризація). Нуклеотидні коферменти можуть також виступати в ролі донорів субстратів у реакціях переносу груп. Так, УДФ-глюкоза є донором глюкози для біосинтезу глікогену, УДФ-глюкуронова кислота – донор залишку глюкуронової кислоти в реакціях кон'югації (наприклад, білірубіну). ЦДФ-холін може служити донором холіну під час біосинтезу холінфосфатидів.

Ці коферменти за своєю структурою подібні або навіть тотожні гему в гемоглобіні. Вони містять іони металів, зокрема заліза, які можуть змінювати свою валентність (Fe+2  Fe+3) і за рахунок цього брати участь у перенесенні електронів під час окисно-відновних процесів. Порфіринові коферменти входять до складу таких ферментів, як цитохроми (b, с, а1, а3), каталаза, пероксидаза та ін.

Значна кількість ферментів для своєї дії потребує наявності металів. У таких ферментах метали беруть участь в окисно-відновних процесах або відповідають за утворення зв'язку між ферментом і субстратом. Іноді важко з'ясувати, чи даний метал або його іон входить до складу ферменту, чи виконує тільки роль активатора ферменту. В останньому випадку фермент може каталізувати реакцію і без металу. Ферменти, що містять у своєму складі метали, без них не будуть проявляти хімічної активності. Наприклад, іони кальцію стабілізують альфа-амілазу, іони цинку– алкогольдегідрогеназу (при відсутності цинку остання дисоціює на субодиниці й втрачає активність).

Коферментами можуть бути і деякі фосфати вуглеводів. Наприклад, 2,3-дифосфогліцерат є коферментом фосфогліцеромутази, що перетворює під час гліколізу 3-фосфогліцерат на 2-фосфогліцерат. Для деяких ферментів роль коферменту можуть виконувати пептиди. Зокрема, трипептид глутатіон (глутамілцистеїнілгліцин), що може знаходитись у відновленій або окисненій формі (HS-SH- або -S-S-), виконує функцію коферменту для багатьох оксидоредуктаз, наприклад глутатіонпероксидази.

Структурно-функціональні особливості ферментів

Більшість ферментів має чотири рівні структурної організації (первинну, вторинну, третинну і четвертинну), тобто є олігомерними білками, що складаються із протомерів. Кожна із субодиниць або окремі їх частини відіграють певну роль у процесі функціонування ферменту. Прості (однокомпонентні) ферменти здійснюють ферментативне перетворення субстрату з участю власне білкової молекули. Безпосередню участь у реакції бере не весь поліпептидний ланцюг ферменту, а тільки незначна його частина, що близько прилягає до субстрату. У ферментативну реакцію включається тільки декілька залишків амінокислот. Ці залишки можуть розташовуватися в поліпептидному ланцюзі як поруч, так і далеко один від одного, але просторово вони повинні бути досить зближені.

Та частина молекули ферменту, яка з'єднується із субстратом, називається активним центром ферменту. Активний центр відповідає за специфічну спорідненість ферменту із субстратом, утворення ферментосубстратного комплексу і каталітичне перетворення субстрату. В активному центрі ферменту умовно розрізняють так звану каталітичну ділянку, де відбувається каталітичне перетворення субстрату, і контактну, або якірну ділянку, що зв'язує фермент із субстратом. Схема розташування складових компонентів активного центру показана на рисунку.

За утворення активного центру ферменту, як і за його каталітичну дію, відповідає третинна структура білко­вої молекули. Отже, при по­рушенні третинної структури (денатурація) роз'єднуються просторово поєднані амінокислотні залишки і, як наслідок, фермент втрачає активність. У складі активного центру простого ферменту знаходиться приблизно 15 залишків амінокислот. Активний центр утво­рюють залишки таких амінокислот, як серин, цистеїн, гістидин, тирозин, лізин та деякі інші, що надають ферменту як просторової, так і електричної спорідненості із субстратом. В утворенні тимчасового комплексу між ферментом і субстратом важлива роль належить дисульфідним, іонним, а також слабким зв'язкам (водневі зв'язки, гідрофобна взаємодія).

Активний центр складних (двокомпонентних) ферментів містить у своєму складі як кофермент, так і ту частину апоферменту, що просторово прилягає до нього. Кофермент при цьому може відповідати за утворення зв'язку із субстратом, формування третинної або четвертинної структури апоферменту і каталітичне перетворення субстрату. Ферменти можуть мати 1, 2, 3 і більше активних центрів, що залежить від кількості протомерів (субодиниць), які входять у його структуру.

Крім активних центрів, у ферментах можуть бути ще так звані алостеричні центри (від грец. алос – інший, другий; стереос – просторовий, структурний). Алостеричні центри служать місцем впливу на фермент різних регуляторних чинників, тому їх ще називають регуляторними центрами, а речовини, що взаємодіють з алостеричним центром, отримали назву ефекторів. Приєднання до алостеричного центру ефектора призводить до певних структурних змін в активному центрі та, як наслідок, пригнічення або підвищення активності ферменту.

Ферменти мають ряд властивостей, подібних до небіологічних каталізаторів, але одночасно і відрізняються від них. Спільними для всіх видів каталізаторів є:

1. Вони пришвидшують тільки ті реакції, які можливі з точки зору термодинаміки, тобто ті процеси, що йдуть у напрямку термодинамічної рівноваги, але з малою швидкістю.

2. Вони не змінюють напрямку реакції.

3. Каталізатори збільшують швидкість наближення системи до термодинамічної рівноваги, не змінюючи при цьому точки рівноваги.

4. Відносно не змінюються після реакції, тобто вивільняються і знову можуть реагувати з наступними молекулами субстрату.

5. Усі каталізатори діють у відносно малих концентраціях.

Разом із тим, ферменти як білкові структури мають властивості, від­мінні від властивостей каталізаторів неорганічних. Що це за властивості? Для ферментів характерні: специфічність, чутливість до дії сторонніх чин­ників, залежність дії від рН і t°, ферментам, на противагу іншим каталі­заторам, притаманна значно вища каталітична активність. Розглянемо ці властивості.

Специфічність дії ферментів

Специфічність є характерною рисою, що відрізняє ферменти від усіх інших небіологічних каталізаторів. Так, дрібно розпушені платина, залізо чи нікель можуть виступати каталізаторами розкладу перекису водню на воду і кисень. Серед ферментів таку дію проявляє в основному каталаза. Таким чином, ферментам притаманна виражена специфічність дії. Кожен фермент діє на певний субстрат або на певну групу близьких за структурою субстратів чи на певний тип зв'язку в молекулі.

Висока специфічність дії ферментів зумовлена конформаційною й електростатичною комплементарністю між молекулами субстрату і ферменту, а також особливістю структури активного центру ферменту, що забезпечує високу спорідненість із субстратом і вибірковість перебігу однієї якоїсь реакції серед багатьох інших, які здійснюються в клітині. В активному центрі є функціональні групи для зв'язування відповідного специфічного субстрату, а також компоненти, що перетворюють субстрат на продукт реакції. Таку властивість називають субстратною специфічністю ферменту. Завдяки специфічності ферменти не тільки пришвидшують перетворення субстратів, але і визначають напрямок метаболічного процесу.

Ферменти можуть проявляти відносну (групову), абсолютну та просторову, або стереоспецифічність. Ферментами з відносною спе­цифічністю можуть служити фосфатази, ліпази, протеази та ін. Так, фос­фатази здатні гідролізувати різні фосфороорганічні сполуки, наприклад бета-гліцерофосфат, глюкозо-6-фосфат, холінфосфат; ліпаза розщеплює різні жири тваринного і рослинного походження; протеази (пепсин, трипсин та ін.) також гідролітично розщеплюють пептидні зв'язки в білкових молекулах.

Відносна специфічність властива переважно ферментам травної системи, що має важливе біологічне значення, бо економить засоби впливу на субстрати. Спільним для розглянутих вище ферментів є їх дія на однакові зв'язки певної групи субстратів.

Велика кількість ферментів характеризується абсолютною специфічністю, тобто здатністю перетворювати тільки якийсь один субстрат. Прикладом таких ферментів може служити фермент уреаза, що каталізує перетворення сечовини, але не впливає на метилсечовину; фермент аргіназа перетворює аргінін, але не діє на метиларгінін; сукцинатдегідрогеназа окиснює сукцинат, але не діє на малеат.

Усій групі ферментів притаманна стереоспецифічність, тобто здатність впливати на один якийсь із стереоізомерів, наприклад на D- або L-ізомер. Так, ферменти, що каталізують перетворення вуглеводів, діють тільки на D-ізомери, але не впливають на L-ізомери; фермент фумараза каталізує перетворення фумарової кислоти, яка є транс-ізомером, але не діє на цис-ізомер – малеїнову кислоту.

Залежність швидкості ферментативної реакції від температури

Підвищення температури завжди збільшує швидкість хімічних реакцій, зокрема ферментативних. Як показник зростання швидкості реакції використовують температурний коефіцієнт Ван-Гофа Q10, що вказує на зростання швидкості реакції при підвищенні температури на 10 °С. Для хімічних процесів, каталізованих небіологічними каталізаторами, величина цього коефіцієнта дорівнює 2, що означає збільшення швидкості реакції вдвічі при зростанні температури на 10 °С. Однак для фермен­тативних процесів така закономірність існує тільки в діапазоні низьких температур – до 50-60 °С. Вище цих температур відбувається денатурація ферменту та, як наслідок, зниження активності. Оптимальні значення температури для більшості ферментів знаходяться в межах 20-40 °С. Сумарна швидкість ферментативної реакції при зміні температури середовища являє собою результуючу від складання двох швидкостей – зростання швидкості у відповідь на підвищення температури і зниження швидкості як функції денатурації білка-ферменту. Сумація цих двох швидкостей для більшості ферментів теплокровних істот дає найбільше значення швидкості при температурі 37-40 С.

Температура, при якій швидкість ферментативної реак­ції максимальна, називається тем­пературним оптимумом. Треба мати на увазі, що його величина буде зале­жати і від тривалості дії температури на фермент. Так, фермент може переносити високу температуру протягом короткого часу і в цей період активність його значно підвищиться. Але тривале перебування ферменту при високій температурі призводить до його денатурації і зниження активності.

Низькі температури також впливають на активність ферментів, але на противагу високим температурам, вони інгібують їх дію, не руйнуючи структури. Перенесення ферментів із низьких температур в оптимальні повністю (в більшості випадків) відновлює їх активність. Цю властивість застосовують у біології і медицині. Охолодження біологічних рідин, тканин, органів використовують для пригнічення в них мета­болічних процесів і попередження автокаталітичного розщеплення.

Температурний оптимум 37-40 °С для більшості ферментів тепло­кровних тварин і людини, очевидно, створює найкращі умови для існування структурної й електростатичної спорідненості між активним центром ферменту та субстратом, необхідним для їх взаємодії. Однак зустрічаються ферменти, що не руйнуються при значно вищих температурах і зберігають ферментативну активність. Так, лужна фосфатаза печінки стабільна при температурі 50 °С, а фермент м'язів міокіназа витримує навіть +100 °С. На активність ферментів впливають ще такі чинники, як концентрація субстрату, рН середовища тощо.

Залежність активності ферментів від рН середовища

Якщо активність ферментів визначати при різних значення рН, то графік залежності матиме вигляд куполоподібної кривої, крива може бути симетрична, з однаковим підйомом і спуском у кислому і лужному середовищах, або йти на зниження в якійсь одній ділянці.

Значення рН, при якому активність ферменту найвища, називається рН-оптимумом ферменту. Звичайно ферменти найактивніші в межах вузької зони рН, яка для більшості з них знаходиться в межах рН 6‑8. Ряд внутрішньоклітинних фермен­тів найкраще функціонує у нейтраль­ному середовищі. Разом із тим, для ферментів шлунково-киш­кового тракту рН‑оптимум може знаходитись у зоні від нейтрального до сильно кислого і лужного сере­довищ. Так, пепсин має оптимум рН 1,5‑2,5, трипсин – рН 8,0-9,0. Для виявлення залежності активності ферменту від концентрації водневих іонів експерименти проводять при оптимальній температурі, достатньо високих концентраціях субстрату, але при різних значеннях рН.

Механізми та особливості перебігу ферментативних реакцій

Ферменти, як і інші каталізатори, прискорюють тільки ті реакції, які термодинамічно можливі, тобто ті, що відбуваються самовільно, але з малою швидкістю. Можливість перебігу хімічної реакції визначається різницею між вільною енергією початкових речовин і продуктів реакції. Якщо вільна енергія продуктів реакції менша, ніж початкових речовин, тобто відбувалося розсіювання енергії, то реакція перебігає самовільно – вона термодинамічно можлива. У випадку переважання вільної енергії продуктів реакції над вихідними речовинами реакція енергетично стає неможливою (це так звана ендергонічна реакція). Вона може здійснюватись тільки за умов надходження зовніш­ньої енергії в кількості, більшій за енергію утворюваних продуктів.

Швидкість будь-якої реакції залежить від величини енерге­тичного бар'єру, який необхідно подолати реагуючим молекулам, але для різних реакцій величина цього бар'єру неоднакова. У зви­чайних умовах (при відсутності каталізатора, ферменту або при низьких температурах) є дуже мала кількість молекул, здатних перемагати цей бар'єр і вступати в реакцію. Отже, без каталізаторів та при низьких тем­пературах швидкість реакцій буде низькою.

Здатність молекул вступати в хімічну реакцію визначається енергією активації, яка затрачається на перемагання сил відштовхування, що виникають між електронними хмаринками взаємодіючих молекул. Інакше кажучи, енергія активації витрачається на утворення проміжного комплексу між реагуючими молекулами.

Механізм ферментативних реакцій

За всю історію вчення про ферменти було запропоновано багато гіпотез, що пояснювали механізм їх дії. Більшість із них має суто історичний характер і не витримала випробувань у світлі нових даних про структуру ферментів та їх активного й алостеричного центрів. Заслуговує уваги гіпотеза, запропонована на початку ХХ ст. Варбургом і Бейлісом. Її значення полягає в тому, що вона пов'язувала механізм дії ферментів із дією неорганічних каталізаторів. Ця гіпотеза пояснювала, що поверхня ферменту служить місцем для адсорбції реагентів. За цих умов різко зростає кількість молекул субстрату, що припадає на одиницю площі ферменту, а отже, за законом діючих мас зростає і швидкість реакції. Також припускалось, що в результаті зв'язування субстрату з активним центром ферменту відбуваються механічні зміни молекул субстрату, що призводить до більшої реакційної здатності. Але адсорбційна гіпотеза не могла пояснити специфічності дії ферментів, тому вона не використовується.

Для пояснення специфічності дії ферментів у 1894 р. Е. Фішер запропонував гіпотезу, яку ще й досі називають гіпотезою "ключа і замка" або гіпотезою "шаблону". В основі специфічності, за цією гіпотезою, лежить жорстка просторова відповідність субстрату і активного центру ферменту. За Е. Фішером, реакція можлива тільки в тому випадку, якщо просторово субстрат підходить до ферменту, як ключ до замка. Якщо субстрат (ключ) просторово відрізняється від структури активного центру ферменту (замок), то реакція не відбувається.

Але і ця гіпотеза (її ще називають гіпотезою відповідності) не може пояснити різні види специфічності, бо важко уявити собі ситуацію, коли декілька ключів (субстратів) підходить до одного замка (ферменту). Тому ця гіпотеза була замінена і доповнена гіпотезою вимушеної співвідповідності (гіпотеза індукованої адаптації ферменту до субстрату). Згідно з цією гіпотезою, конфігурація ферменту і його активного центру є гнучкою й еластичною, що змінюється під впливом субстрату, тобто субстрат індукує у ферменті зміни конфігурації молекул відповідно до власної структури. Іншими словами, "замкова щілина", за Кошлендом, виготовлена з еластичного матеріалу і тому набуває форми "ключа" при контакті з ними. Але приєднання субстрату до ферменту може викликати зміни активного центру, при яких він утворює із суб­стратом неактивний комплекс, і тоді реакція не відбувається. Значну роль у вивченні механізму взаємодії ферменту і субстрату відіграли класичні праці Міхаеліса і Ментен, опубліковані в 1913 р., про так звані ферментосубстратні комплекси. Згідно з гіпотезою Міхаеліса-Ментен, ферментативна реакція завжди супроводжується утворенням проміжної короткоіснуючої сполуки – ферментосубстратного комплексу.

Кінетика ферментативних реакцій

Основи кінетики ферментативних процесів були закладені у працях Міхаеліса і Ментен, зокрема в рівнянні ферментосубстратного комплексу.

Під кінетикою ферментативних процесів розуміють розділ науки про ферменти, що вивчає залежність швидкості ферментативної реакції від хімічної природи субстрату, умов середовища, а також сторонніх чинників, які впливають на перебіг реакції.

Коли концентрація субстрату досить велика, то вона вже не впливає на швидкість, бо остання стала максимальною (свідчення того, що весь фермент зв'язаний із субстратом).

Дослідження активності фер­ментів проводять при великих концентраціях субстратів (нульовий порядок реакції). У цих умовах усі зміни швидкості реакції будуть залежати тільки від кількості ферменту. Але в живих клітинах концентрації субстрату, як правило, далекі від насичення ферментів. Це означає, що ферменти в клітинах використовують не всю свою потужність.

Залежність швидкості ферментативної реакції від кількості ферменту

Якщо субстрат знаходиться в надлишку, що практично має місце в експериментальних умовах, то швидкість реакції пропорційна кількості ферменту. Але, якщо кількість ферменту збільшити настільки, щоб субстрат перестав бути в надлишку, то така пропорційність порушиться.

Швидкість ферментативної реакції лінійно зростає із збільшенням вмісту ферменту. Але надмірне зростання концентрації ферменту призводить до того, що субстрату стає менше, ніж ферменту і це проявляється зменшенням наростання швидкості реакції.

Дія на ферменти модуляторів

Активність ферментів може змінюватись не тільки за зміною кількості субстрату, ферменту, рН середовища, але і під впливом різних хімічних речовин. Речовини, що впливають на хід ферментативних реакцій, називаються їх модуляторами, або ефекторами. Вони поді­ляються на активатори та інгібітори, тобто під їх впливом реакція може при­скорюватись або сповільнюватись. Вивчення дії модуляторів фер­ментів має практичне значення, бо дозволяє глибше зрозуміти природу дії ферментів. Деякі з них відіграють роль природних регуляторів метаболізму. Існує багато типів модуляторів активності ферментів, що відрізняються між собою за будовою та механізмом дії.

Активатори ферментів

Роль активаторів можуть відігравати як органічні (жовчні кислоти, ферменти й ін.), так і неорганічні речовини (іони металів, аніони). Нерідко зустрічаються випадки, коли одна і та ж речовина стосовно одного ферменту є активатором, а відносно іншого – інгібітором. Іони металів бувають досить специфічними активаторами для певних ферментів. Вони можуть сприяти приєднанню субстрату до ферменту, брати участь у формуванні третинної структури ферменту або бути складником активного центру. Іони багатьох металів (натрію, калію, кальцію, магнію, заліза, міді та ін.) є обов'язковими компонентами, що необхідні для нормального функціонування багатьох ферментів. Іноді для деяких ферментів потрібно декілька різних іонів. Наприклад, для Nа+, К+-АТФази, що здійснює транспорт іонів через плазматичну мембрану, потрібні для нормального функціонування іони калію, натрію та магнію.

Метали можуть входити до складу простетичних груп ферментів. Наприклад, залізо в складі порфіринових сполук є необхідним компонентом ферментів цитохромної системи, каталази і пероксидази; кобальт входить до простетичної групи гомоцистеїнтрансметилази і метилмалонілізомерази ферментів; мідь – до аскорбатоксидази; марганець є активатором ізоцитратдегідрогенази.

Металоферменти, що містять у своєму складі переважно дво- і тривалентні іони, утворюють із залишками функціональних груп амінокислот та відповідними іонами клешнеподібні хелатні сполуки. У таких сполуках іони надають ферментам певної просторової структури і сприяють утворенню ферментосубстратних комплексів. Деякі ферменти при відсутності металів просто не проявляють ферментативної дії. Наприклад, вугільна ангідраза без цинку не має властивостей ферменту і дію цинку не можна замінити жодним іншим іоном.

Існує група ферментів, що активуються за допомогою циклічного АМФ. Такі ферменти називаються протеїнкіназами. Механізм їх активації такий. Протеїнкіназа складається з двох субодиниць: ката­літичної, що містить активний центр, і регуляторної, в якій розміщений центр зв'язування циклічного АМФ. Фермент неактивний, бо його активний центр закритий. Він звільняється тільки при взаємодії ц‑АМФ і регуляторного центру ферменту.

Циклічний АМФ

Активація ряду ферментів залежить від процесів фосфорилювання і дефосфорилювання. Так, фосфорилаза, що відщеплює від глікогену одну молекулу глюкози, проявляє свою дію тільки у фосфорильованому стані (фосфорилаза А), в нефосфорильованому стані (фосфорилаза В) вона неактивна. Аналогічно ліпаза жирової тканини активність свою проявляє значно інтенсивніше у фосфорильованому стані. Фосфорилювання цих ферментів здійснюється за рахунок АТФ при участі протеїнкіназ.

Дефосфорилювання фосфорильованої ліпази здійснюється під впливом фосфопротеїнфосфатази.

Деякі ферменти проявляють каталітичну дію тільки в нефосфо­рильованому стані, а фосфорилювання призводить до втрати їх активності. Прикладом може служити фермент глікогенсинтаза. Таким чином, за допомогою поєднаної дії ферментів протеїнкіназ і фосфатаз певні ферменти можуть переходити з неактивного стану в активний і навпаки, що має важливе значення в регуляції метаболічних процесів. В основі активації ферментів, як було показано вище, лежать різні механізми. Серед них можна назвати такі:

1 – активація за допомогою впливу на активний центр;

2 – активація шляхом відщеплення від ферменту частини пептидного ланцюга або якоїсь неорганічної сполуки, що закривала активний центр;

3 – активація шляхом приєднання до ферменту якоїсь модифікуючої сполуки;

4 – активація шляхом дисоціації неактивного комплексу ферменту на субодиниці, одна з яких проявляє властивості ферменту.

Інгібітори ферментів

Подібно до активаторів, інгібуючу дію на ферменти можуть проявляти різні за будовою і за механізмом дії речовини. Вивчення різних інгібіторів відкриває великі можливості для розуміння механізмів дії ферментів. Інгібітори (від лат. інгібіціо – затримка, гальмування) – речовини, що, на відміну від активаторів, послаблюють або цілком призупиняють дію ферментів. Деякі інгібітори ферментів є отрутами для живих організмів (наприклад, ціаніди, сірководень, монооксид вуглецю). Ряд лікарських засобів також має виражені інгібуючі властивості щодо певних ферментних систем. Тому інгібітори широко застосовують в експериментальній медицині для з'ясування механізму дії лікарських середників.

За механізмом дії інгібітори поділяються на дві групи:

1. Інгібітори, що вступають із ферментами у зворотну реакцію.

2. Інгібітори, що реагують із ферментами незворотно.

Незворотний інгібітор утворює з ферментом міцну сполуку за рахунок ковалентних зв'язків. Ці зв'язки виникають між різними функціональними групами, що поєднуються з активним центром ферменту. Такий комплекс не розпадається і не дисоціює на вихідні речовини, наприклад, ціанідна кислота і її похідні, фосфороорганічні, тіолові отрути та ін.

Конкурентне інгібування

Конкурентні інгібітори здатні зворотно зв'язуватись з активним центром ферменту і конкурувати із субстратом за активний центр. Такі інгібітори часто є структурними аналогами субстрату і тому комплементарні активному центрові ферменту. Та сполука, концентрація молекул якої більша, буде переважно спо­лучатися з активним центром і визначати напрямок реакції. Зняти гальмівний вплив інгібітора можна надлишком субстрату, який витіснить інгібітор активних центрів молекул ферменту. Конкурентне інгібування називають ще ізостеричним. Воно викликається речовинами, які за своєю структурою близькі до субстратів. Прикладом конкурентного гальмування є пригнічення малонатом активності сукцинатдегідрогенази – ферменту, що окиснює сукцинат, який при цьому перетворюється у фумарат. Якщо в середовище, де відбувається окиснення сукцинату, внести малонову кислоту (інгібітор сукцинатдегідрогенази), яка за структурою дуже подібна до сукцинату і відрізняється від неї тільки тим, що містить одну групу СН2, то утвориться фермент-інгібіторний комплекс, який не здатний окиснюватись, тобто два атоми водню не відщеплюються. У результаті приєднання малонату до ферменту реакція окиснення сукцинату загальмовується. Отже, сукцинат і малонат, як близькі за структурою речовини, конкурують за зв'язування з активним центром ферменту. Тому напрямок реакції буде визначатися співвідношенням концентрацій субстрату й інгібітора. Інакше кажучи, якщо в середовищі одночасно наявні субстрат та інгібітор, то у випадку переважання концентрації інгібітора реакція загальмується і, щоб зупинити його гальмівну дію, потрібно внести надлишок субстрату. Останній за законом діючих мас витіснить із комплексу інгібітор, і реакція відновиться. Таку ж конкурентну дію на сукцинатдегідрогенезу проявляє і оксалоацетат, який також близький за структурою до сукцинату.

Конкурентне інгібування широко застосовується в медичній практиці для боротьби з інфекціями, в сільському господарстві – для знищення шкідників, а також у військовій справі.

Конкурентними інгібіторами (ізостеричними) можуть виступати про­міжні продукти обміну – метаболіти, накопичення яких регулює активність ферментів. Дія багатьох лікарських середників відбувається за принципом конкурентного інгібування. Наприклад, сульфаніламіди, що широко застосовуються для лікування інфекційних захворювань, структурно подібні до параамінобензойної кислоти (ПАБК), яку бактерії використовують для синтезу фолієвої кислоти. Остання входить до складу ферментів, необхідних для їх росту. Сульфаніламіди витісняють ПАБК із комплексу з ферментом, що призводить до гальмування росту бактерій.

Конкурентну дію проявляють також деякі аналоги вітамінів. На­приклад, дезоксипіридоксин – аналог вітаміну В5 або аміноптерин – аналог фолієвої кислоти. Ці аналоги вітамінів називаються ще антивітамінами. Вони можуть утворювати так звані антикоферменти, що проявляють властивості конкурентних інгібіторів. Антикоферменти або їх попередники антивітаміни застосовуються в біохімічних дослідженнях або в медичній практиці як ефективні лікувальні засоби. Наприклад, аміноптерин використовують для лікування лейкозу і пухлинних захворювань; ізоніазид (аналог вітаміну В5) – туберкульозу; кумарини, що є антивітамінами нафтохінонів (вітаміни К), застосовують в лікуванні й в профілактиці тромбозів.

Неконкурентне інгібування

Неконкурентне інгібування викликається речовинами, які не мають структурної спорідненості (подібності) із субстратом і зв'язуються з каталітичними групами активного центру та ділянками, що розташовані поза активним центром. Таке приєднання інгібітора до ферменту змінює конфігурацію активного центру, що пригнічує його взаємодію із субстратом. До неконкурентних інгібіторів належить багато різних речовин, наприклад солі важких металів (срібла, ртуті, свинцю, кадмію, міді), сполуки арсенію, фосфороорганічні речовини, алкілувальні речовини, йодацетат, ціаніди, окис вуглецю, сірководень. Конкретні механізми дії кожного з названих інгібіторів будуть різними. Так, в основі інгібуючої дії солей важких металів лежить здатність їх блокувати SH-групи каталітичного центру ферментів; ціаніди міцно з'єднуються з Fe3+ каталітичного центру гемінового ферменту цитохромоксидази, що завершує процес біологічного окиснення з утворенням води. Таке інгібування виключає дихальний ланцюг і клітина гине. Йодацетат як інгібітор взаємодіє із SH‑групами ферменту, утворюючи з ним ковалентну сполуку, що при­зводить до виключення ферменту. Окис вуглецю СО є інгібітором переважно тих ферментів, у складі яких є залізо або мідь. Високу інгібуючу активність проявляють так звані фосфороорганічні речовини. Серед них зустрічаються такі, що застосовуються в практичній медицині, сільському господарстві для боротьби із шкідниками, а деякі – як бойові отруйні речовини (табун, зарин). Ці інгібітори утворюють із ферментами комплекси, які не мають каталітичної дії. Фосфороорганічні інгібітори гальмують дію протеаз (трипсину, хімотрипсину), естераз, зокрема ацетилхолінестерази, що каталізує розпад ацетилхоліну. Як наслідок дії фосфороорганічних інгібіторів буде нагромаджуватись ацетилхолін, що проявляється порушенням функції нервової системи.

Конкурентні та багато неконкурентних інгібіторів відносяться до так званих зворотних чинників, оскільки вони утворюють із ферментами нестійкий комплекс, тобто гальмують реакції без значних змін у структурі ферменту. Ті інгібітори, що вступають у реакції з ферментами і утворюють із ними міцні сполуки за рахунок ковалентних зв'язків, викликають незворотне гальмування. Важливе місце серед неконкурентних зворотних інгібіторів посідають проміжні продукти метаболізму. Вони здатні зворотно зв'язуватися із специфічними ділянками на поверхні деяких алостеричних ферментів і змінювати активність їх каталітичного центру.

Інгібування продуктами реакції

Продукт реакції нерідко за своєю структурою подібний до суб­страту. Тому, нагромаджуючись, такий продукт може поводити себе як конкурентний інгібітор ферменту. Цей процес може виконувати регуляторну функцію, бо нагромадження надлишку утвореного продукту призводить до гальмування його утворення.

Інгібування надлишком субстрату

Наявність в інкубаційному середовищі надмірно високих кон­центрацій субстрату викликає гальмування реакції. За цих умов крива Міхаеліса проявляє тенденцію до зниження. Зрозуміти таке інгібування можна, припустивши, що молекули субстрату через взаємні перешкоди здатні займати неправильні положення в активному центрі ферменту, що перешкоджає нормальному перебігові реакції.

Генетичне інгібування

Генетичне інгібування здійснюється шляхом пригнічення утворення ферменту на генетичному рівні. Генетичне гальмування настає тоді, коли зникає потреба в певному ферментові. Наприклад, у процесі еволюції в людини зникли ферменти, які синтезують речовини, що містяться в достатній кількості в продуктах харчування: деякі амінокислоти, вітаміни С, В1, В2  тощо.