БИОХИМИЯ КАК НАУКА: БИОМОЛЕКУЛЫ; МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПУТИ. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ. ИЗОФЕРМЕНТЫ, КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ. ФЕРМЕНТОДИАГНОСТИКА, ФЕРМЕНТОПАТИИ. ВСТУПЛЕНИЕ К ОБМЕНУ ВЕЩЕСТВ. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ И ОБЩИЕ ПУТИ ПРЕВРAЩЕНИЙ УГЛЕВОДОВ, ЛИПИДОВ И БЕЛКОВ.
Ферменты (энзимы) – это биологические катализаторы белковой природы, которые катализируют все биохимические реакции в организме.
Fermentacio – кипение. Ферменты проявляют все свойства белков: высокий молекулярный вес, денатурация, при гидролизе распадаются на аминокислоты, выделение в форме кристаллов белка, амфотерность, электрофоретическая подвижность, не способность к диализу, высокая специфичность, получение в синтетическом виде.
По строению ферменты разделяются на простые и сложные.
Простые (апоферменты) при гидролизе дают только аминокислоты. Сложные (голоферменты) при гидролизе дают кроме аминокислот еще и небелковую часть.
Голофермент состоит из апопротеина (белковая часть) и кофактора (небелковая).
Кофактором могут быть металлы, анионы неорганических кислот.
Если природа кофактора органическая, то это кофермент. Если кофактор связан с апопротеином сильной ковалентной связью, то он называется простетической группой.
Коферментами могут быть:
1. Металлы (тирозиназа – медь; АДГ – цинк; СДГ - железо).
Металлы отвечают за третичную структуру белка-фермента.
2. Порфириновые комплексы (гем и его производные. Например, в пероксидазе, цитохромах, каталазе).
3. Витамины и их производные – все водорастворимые витамины: витамин Н (биотин) в составе карбоксилазы; витамины В10 , В12 превращают одноуглеродные радикалы СН3СООН, СН.
4. Фосфорилированные витамины: В1 – тиамингидрофосфат (ТПФ) – окисление ПВК.
5. Нуклеотиды (АМФ, АДФ, ГДФ). Ферменты состоят из активного центра и аллостерического (allos – другой) (steros – пространственный).
Активный центр фермента – та часть молекулы фермента, которая принимает участие в превращении субстрата. В состав активного центра входят много аминокислот.
В составе активного центра есть контактный участок и каталитический.
За образование активного центра отвечает третичная и четвертичная структуры белка.
В простых ферментах в состав активного центра входят SH,- ОН- группы, фенольный радикал, амидазольное кольцо.
В сложных ферментах белки отвечают за тип реакции. Это называется специфичностью действия ферментов.
Ферменты имеют один или несколько активных центра (если 2-3 полипептидных цепи).
Аллостерические центры – это регуляторные центры. Они характерны для сложных ферментов.
Все ферменты ускоряют химическую реакцию путем уменьшения энергии активации. Энергия активации – это та энергия, которую нужно затратить, чтобы перевести 1 моль вещества в активное состояние. Ферменты катализируют только термодинамически возможные реакции.
Есть несколько теорий механизма действия ферментов:
1. Теория Фишера (специфичности действия). Фермент действует только на тот субстрат, который пространственной конфигурацией и электростатическим сродством подходит к нему как ключ к замку.
2. Теория Кошланда (он опроверг теорию Фишера). Он довел, что сначала субстрат действует на фермент, а потом уже фермент приспосабливается к субстрату. Это теория “резиновой перчатки”.
3. Современная теория фермент-субстратного комплекса Михаэлиса-Ментена. За этой теорией механизм действия ферментов включает 3 стадии:
1. Мгновенное образование FS
2. Распад на активные формы FS* и FS** (медленно проходит, образуются новые связи, деформация молекул и формирование новых форм).
3. Мгновенно – освобождение продуктов реакции.
Изоферменты – это множественные формы фермента, отличающихся друг от друга по сродству, скорости катализируемой реакции или регуляторными свойствами. Они складываются с двух и больше единиц, объединенных в разных пропорциях и существуют в виде нескольких подобных, но не одинаковых молекулярных форм.
Например, фермент лактатдегидрогеназа состоит из 4-ех субъединиц двух разных типов Н и М, то активный фермент может представлять одну из следующих комбинаций: НННН, НННМ, ННММ, НМММ и ММММ или ЛДГ, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4 и ЛДГ5. Эти изоферменты локализованы в различных органах. Изменение их активности указывает на развитие патологического процесса в том или ином органе. Например, повышение уровня ЛДГ1,2 говорит о поражении миокарда, а ЛДГ4,5 – о развитии патологического процесаа в печени. Особую группу ферментов составляют надмолекулярные структуры (мультимолекулярные) ферментные комплексы, в состав которых входят разные ферменты, катализирующие последовательное превращение одного и того же субстрата. Например, пируватдегидрогеназный комплекс (состоит из 3-ех ферментов) катализирует превращение ПВК до ацетил – КоА, a - кетоглютаратдегидрогеназный (из 3 ферментов) превращает , a-кетоглютаровую кислоту в сукцинил – КоА.
Основные свойства ферментов
Ферменты имеют общие свойства с неорганическими катализаторами:
1. они не изменяются в процессе реакции
2. действуют в малых концентрациях
3. не влияют на величину константы равновесия реакции
Ферменты, являясь белками, проявляют специфические свойства, которые отличают их от неорганических катализаторов:
1.Термолабильность (чувствительность к повышению температуры). Температура, при которой фермент наиболее активен, называется температурным оптимум. Для ферментов нашего организма это 37оС.
2. Зависимость активности фермента от рН среды. Оптимум рН для ферментов животных тканей 6,0-8,0.
3.Специфичность действия. Она обусловлена структурой активного центра. В зависимости от механизма действия различают ферменты с относительной (или групповой) специфичностью и абсолютной специфичностью.
Например, пепсин расщепляет белки (любого происхождения), но не расщепляет липиды и углеводы. Он действует только на пептидную связь. Это относительная специфичность.
Абсолютная специфичность – это когда фермент катализирует превращение только одного субстрата. Любые изменения в его структуре делают его недоступным для действия фермента. Например, фермент уреаза, который катализирует распад мочевины.
Существует стереохимическая специфичность, обусловлена существованием оптических изомеров L- и Д- форм. Известны оксидазы L- и Д –аминокислот.
Классификация ферментов
Ферменты разделяют на 6 классов:
1.оксидоредуктазы – ферменты, которые катализируют окислительно-восстановительные реакции. Их подразделяют на:
а) дегидрогеназы – катализируют перенос электронов и протонов (ЛДГ, АДГ, СДГ)
б) оксидазы – переносят е и протоны непосредственно на кислород (цитохромоксидазы)
в) пероксидазы – катализируют реакции с участием перекиси водорода (пероксидаза, каталаза)
2. трансферазы – катализируют реакции межрадикалов (АсАТ, АлАЕ).
3.гидролазы – катализируют расщепление внутримолекулярных связей при участии воды (кислая, щелочная фосфатазы)
4.лиазы – катализируют разрыв С-О, С-С, С-N связей и обратимые им реакции (декарбоксилазы).
5.изомеразы – катализируют реакции изомеризации. Если реакция включает внутримолекулярный перенос группы, ферменты называют мутазы (фосфоглюкоизомераза)
6.лигазы (синтетазы) – катализируют синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии АТФ (ДНК – лигазы).
Шифр ферментов состоит из нескольких цифр.
1 – класс; 1 –подкласс; 1-подподкласс; 27 – номер фермента в классе.
Активность ферментов измеряют в различных единицах.
Катал – реакция осуществляется со скоростью 1 моль/с
МЕ – то количество фермента, который превращает 1 мкмоль субстрата за 1 мин.
Удельная активность - выражается числом единиц ферментативной активности на мг белка.
Механизм регуляции ферментативных процессов осуществляется на нескольких уровнях:
1 – на молекулярном, субклеточном
II – на уровне клетки
III – на уровне целого организма
Изменение активности ферментов может происходить и под влиянием неспецифических факторов (рН среды, tо , ионный состав) и специфических (присутствие активаторов и ингибиторов).
Активаторами ферментов чаще всего выступают катионы, реже – анионы.
Катионы (Na, K, Ca, Mg, Fe, Zn, Cu).
Анионы С1- активируют пепсиноген, амилазу.
Активаторами могут быть органические вещества (желчные кислоты активируют липазу).
Активатором ферментативной реакции может быть и субстрат (до определенной границы).
Ингибиторы – могут быть обратимого и необратимого действия.
Если образуется нестойкий комплекс ЕИ (фермент – ингибитор), то при диализе можна получить опять фермент.
Если образуется стойкий комплекс, то он диализу не поддается и мы говорим о необратимом ингибировании.
Ингибиторы делятся на конкурентные, неконкурентные и аллостерические.
Конкурентное ингибирование: между ингибитором и субстратом есть пространственное и электрохимическое сродство, поэтому отмечается их конкуренция за активный центр фермента.
На этом основано действия антиметаболитов, что лежит в основе их лечебного действия. Например, сульфаниламиды похожи к ПАБК, которая входит в состав витамина В10 , который необходим для развития м/о. Сульфаниламиды занимают место ПАБК, но они уже не витамины и рост м/о прекращается.
Неконкурентное ингибирование – фермент и субстрат не похожи. Связывается активный центр фермента, образуется трехкомпонентные комплексы, которые диализу не поддаются. Если использовать вещество, которое заберет ингибитор из комплекса, отмечается реактивация. Реактиваторами могут быть вещества, которые имеют SН-группы (цистеин, глютатион, липоевая кислота).
Аллостерическое ингибирование – характерное для ферментов, которые имеют несколько полипептидных цепей.
Регуляторный, аллостерический центр может реагировать с веществами, которые называют эффекторами. Ферменты с аллостерическими центрами называют регуляторными.
Чем больше аллостерических центров, тем больше выражено регуляторное действие.
Саморегуляция происходит за принципом обратной связи.
ІІ уровень регуляции – выборочно пропускать субстраты и продукты реакции через клеточные мембраны в клетку и с клетки с помощью циклических нуклеотидов. Аденилатциклаза – фермент, который есть в плазматической мембране, его центр аллостерический связывается с гормонами и меняется конфигурация аденилатциклазы. Начинается запускаться каскадная реакция через ц АМФ.
Ш уровень – на всем организме (нейроэндокринная регуляция).
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ В МЕДИЦИНЕ
Энзимопатология
Энзимодиагностика
Эезимотерапия
Энзимопатология – исследование ферментативной активности в норме и при патологии. Многие наследственные болезни являются результатом дефекта определенного фермента. Например, галактоземия – наследственное заболевание, которое сопровождается повышением уровня галактозы в крови. Развивается в результате дефекта синтеза фермента гексозо-1-фосфатуридилтрансферазы, которая катализирует превращение галактозы в глюкозу.
Фенилкетонурия – сопровождается расстройствами психической деятельности. Возникает при потере клетками печени способности синтезировать фермент , который превращает фенилаланин в тирозин.
Энзимодиагностика – использование органоспецифических ферментов для диагностики различных заболеваний. Оказалось, что ряд ферментов появляется в крови при распаде клеток.
Например, при сахарном диабете в крови резко увеличивается уровень липазы, амилазы, трипсина и химотрипсина. Резко повышается в крови уровень АсАТ и АлАТ, креатинкиназы и ЛДГ1,2 при инфаркте миокарда. При патологии костной ткани в крови повышается уровень щелочной фосфатазы, холинэстеразы, гистидазы.
Энзимотерапия – использование ферментов в качестве лекарственных средств. Используют пепсин, трипсин при заболеваниях ЖКТ. РНК-аза, гиалуронидаза, эластаза в смеси с протеиназами используют для обработки ран.
В клинике используют ингибиторы ферментов. При лечении артритов, аллергических заболеваний применяют ингибиторы протеиназ.
Сейчас разрабатываются методы направленного транспорта ферментов, заключенных в специальные контейнеры (тени эритроцитов, липосомы). Иммобилизованные ферменты применяют для экстракорпоральной перфузии крови (типа “искусственной почки”). Это полностью исключает нежелательное воздействие белка чужеродного на организм и может проводиться длительное время.
АЭРОБНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ ПИРУВАТА
Клетки, недостаточно снабжаемые кислородом, могут частично или полностью существовать за счет энергии гликолиза. Однако большинство животных и растительных клеток в норме находится в аэробных условиях и свое органическое «топливо» окисляет полностью до СО2 и Н2О. В этих условиях пируват, образовавшийся при расщеплении глюкозы, не восстанавливается до лактата, а постепенно окисляется до СО2 и Н2О в аэробной стадии катаболизма, при этом первоначально происходит окислительное декарбоксилирование пирувата с образованием ацетил-КоА.
Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты
Окисление пирувата до ацетил-КоА происходит при участии ряда ферментов и коферментов, объединенных структурно в мультиферментную систему, получившую название «пируватдегидрогеназный комплекс».
На I стадии этого процесса пируват (рис.) теряет свою карбоксильную группу в результате взаимодействия с тиаминпирофосфатом (ТПФ) в составе активного центра фермента пируватдегидрогеназы (E1). На II стадии оксиэтильная группа комплекса E1–ТПФ–СНОН–СН3 окисляется с образованием ацетильной группы, которая одновременно переносится на амид липоевой кислоты (кофермент), связанной с ферментом дигидроли-поилацетилтрансферазой (Е2). Этот фермент катализирует III стадию – перенос ацетильной группы на коэнзим КоА (HS-KoA) с образованием конечного продукта ацетил-КоА, который является высокоэнергетическим (макроэргическим) соединением. На IV стадии регенерируется окисленная форма липоамида из восстановленного комплекса дигидролипоамид–Е2. При участии фермента дигидролипоилдегидрогеназы (Е3) осуществляется перенос атомов водорода от восстановленных сульфгидрильных групп дигидролипоамида на ФАД, который выполняет роль простетической группы данного фермента и прочно с ним связан. На V стадии восстановленный ФАДН2 дигидро-липоилдегидрогеназы передает водород на кофермент НАД с образованием НАДН + Н+. Процесс окислительного декарбоксилирования пирувата происходит в матриксе митохондрий. В нем принимают участие (в составе сложного мультиферментного комплекса) 3 фермента (пируватдегидрогеназа, ди-гидролипоилацетилтрансфераза, дигидролипоилдегидрогеназа) и 5 кофер-ментов (ТПФ, амид липоевой кислоты, коэнзим А, ФАД и НАД), из которых три относительно прочно связаны с ферментами (ТПФ-E1, липоамид-Е2 и ФАД-Е3), а два – легко диссоциируют (HS-KoA и НАД). Все эти ферменты, имеющие субъединичное строение, и коферменты организованы в единый комплекс. Поэтому промежуточные продукты способны быстро взаимодействовать друг с другом. Показано, что составляющие комплекс полипептидные цепи субъединиц дигидролипоил-ацетилтрансферазы составляют как бы ядро комплекса, вокруг которого расположены пируватдегидрогеназа и дигидролипоилдегидрогеназа. Принято считать, что нативный ферментный комплекс образуется путем самосборки.
Суммарную реакцию, катализируемую пируватдегидрогеназным комплексом, можно представить следующим образом: (Пируват + НАД+ + HS-KoA –> Ацетил-КоА + НАДН + Н+ + СO2.) Реакция сопровождается значительным уменьшением стандартной свободной энергии и практически необратима. Образовавшийся в процессе окислительного декарбоксилирования ацетил-КоА подвергается дальнейшему окислению с образованием СО2 и Н2О. Полное окисление ацетил-КоА происходит в цикле трикарбоновых кислот (цикл Кребса). Этот процесс, так же как окислительное декарбоксилирование пирувата, происходит в митохондриях клеток.
ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ (ЦИКЛ КРЕБСА)
Цикл трикарбоновых кислот впервые был открыт английским биохимиком Г. Кребсом. Первая реакция катализируется ферментом цитратсинтазой, при этом ацетильная группа ацетил-КоА конденсируется с оксалоацетатом, в результате чего образуется лимонная кислота.
В качестве промежуточного продукта образуется связанный с ферментом цитрил-КоА. Затем последний самопроизвольно и необратимо гидролизуется с образованием цитрата и HS-KoA. В результате второй реакции образовавшаяся лимонная кислота подвергается дегидратированию с образованием цис-аконитовой кислоты, которая, присоединяя молекулу воды, переходит в изолимонную кислоту (изоцитрат). Катализирует эти обратимые реакции гидратации–дегидратации фермент аконитатгидратаза (аконитаза). В результате происходит взаимоперемещение Н и ОН в молекуле цитрата.
Третья реакция, по-видимому, лимитирует скорость цикла Кребса. Изолимонная кислота дегидрируется в присутствии НАД-зависимой изо-цитратдегидрогеназы.
В ходе изоцитратдегидрогеназной реакции изолимонная кислота одновременно декарбоксилируется. НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа является аллостерическим ферментом, которому в качестве специфического активатора необходим АДФ. Кроме того, фермент для проявления своей активности нуждается в ионах Mg2+или Мn2+. Во время четвертой реакции происходит окислительное декарбокси-лирование α-кетоглутаровой кислоты с образованием высокоэнергетического соединения сукцинил-КоА. Механизм этой реакции сходен с таковым реакции окислительного декарбоксилирования пирувата до ацетил-КоА, α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс напоминает по своей структуре пируватдегидрогеназный комплекс. Как в одном, так и в другом случае в реакции принимают участие 5 коферментов: ТПФ, амид липоевой кислоты, HS-KoA, ФАД и НАД+.
Пятая реакция катализируется ферментом сукцинил-КоА-синтета-зой. В ходе этой реакции сукцинил-КоА при участии ГТФ и неорганического фосфата превращается в янтарную кислоту (сукцинат). Одновременно происходит образование высокоэргической фосфатной связи ГТФ за счет высокоэргической тиоэфирной связи сукцинил-КоА.
В результате шестой реакции сукцинат дегидрируется в фумаровую кислоту. Окисление сукцината катализируется сукцинатдегидрогеназой, в молекуле которой с белком прочно (ковалентно) связан кофермент ФАД. В свою очередь сукцинатдегидрогеназа прочно связана с внутренней ми-тохондриальной мембраной.
Седьмая реакция осуществляется под влиянием фермента фумаратгидратазы (фумаразы). Образовавшаяся при этом фумаровая кислота гидратируется, продуктом реакции является яблочная кислота (малат). Следует отметить, что фумаратгидратаза обладает стереоспецифичностью – в ходе реакции образуется L-яблочная кислота.
Наконец, в ходе восьмой реакции цикла трикарбоновых кислот под влиянием митохондриальной НАД-зависимой малатдегидрогеназы происходит окисление L-малата в оксалоацетат.
За один оборот цикла, состоящего из восьми ферментативных реакций, происходит полное окисление («сгорание») одной молекулы ацетил-КоА. Для непрерывной работы цикла необходимо постоянное поступление в систему ацетил-КоА, а коферменты (НАД+ и ФАД), перешедшие в восстановленное состояние, должны снова и снова окисляться. Это окисление осуществляется в системе переносчиков электронов в дыхательной цепи (в цепи дыхательных ферментов), локализованной в мембране митохондрий. Образовавшийся ФАДН2 прочно связан с СДГ, поэтому он передает атомы водорода через KoQ. Освобождающаяся в результате окисления ацетил-КоА энергия в значительной мере сосредоточивается в макроэргических фосфатных связях АТФ. Из 4 пар атомов водорода 3 пары переносят НАДН на систему транспорта электронов; при этом в расчете на каждую пару в системе биологического окисления образуется 3 молекулы АТФ (в процессе сопряженного окислительного фосфорилирования), а всего, следовательно, 9 молекул АТФ. Одна пара атомов от сукцинатдегидрогеназы-ФАДН2 попадает в систему транспорта электронов через KoQ, в результате образуется только 2 молекулы АТФ. В ходе цикла Кребса синтезируется также одна молекула ГТФ (субстратное фосфорилирование), что равносильно одной молекуле