МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕПЛИКАЦИИ ДНК.
ТРАНСКРИПЦИЯ - БИОСИНТЕЗ РНК. БИОСИНТЕЗ БЕЛКА В РИБОСОМАХ. ЭТАПЫ И МЕХАНИЗМ
ТРАНСЛЯЦИИ, РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ. АНТИБИОТИКИ - ИНГИБИТОРЫ ТРАНСКРИПЦИИ И
ТРАНСЛЯЦИИ
СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Нуклеиновые кислоты
составляют существенную небелковую часть сложного класса органических веществ, получивших
название нуклеопротеинов; последние являются основой наследственного аппарата клетки хромосом. Белковые
компоненты нуклеопротеинов подвергаются многообразным превращениям, аналогичным
метаболизму белков и продуктов их
распада – аминокислот.
О нуклеиновых
кислотах, их структуре и функциях в живых организмах в последнее
время накоплен огромный фактический материал, подробно рассмотренный в ряде
специальных руководств и монографий. Помимо уникальной роли нуклеиновых кислот в
хранении и реализации наследственной
информации, промежуточные продукты их обмена, в частности моно-, ди- и
трифосфатнуклеозиды, выполняют важные регуляторные функции, контролируя биоэнергетику клетки и скорость
метаболических процессов. В то же время нуклеиновые кислоты не
являются незаменимыми пищевыми факторами и не играют существенной роли в
качестве энергетического материала. Далее детально рассматриваются (помимо
краткого изложения вопросов переваривания) проблемы метаболизма нуклеиновых кислот и их
производных, в частности пути биосинтеза и распада
пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов,
современные представления о биогенезе ДНК и РНК и их роли в синтезе белка.
Нуклеиновые кислоты представляют линейные полимеры нуклеозидмонофосфатов,
то есть полинуклеотиды. Нуклеотиды построены из трех компонентов:
пиримидинового или пуринового основания, пентозы и фосфорной кислоты. Нуклеотиды
связаны между собой в цепь фосфодиэфирной связью. Она образуется за счет
этерификации ОН — группы С—З- пентозы одного нуклеотида и ОН — группы
фосфатного остатка другого нуклеотида. В результате один из концов
полинуклеотидной цепи заканчивается свободным фосфатом (Р—конец или5-—конец).
На другом конце цепи имеется неэтерифицированная ОН — группа у С—З- пентозы (З-
— конец).
Переваривание нуклеопротеинов и
всасывание продуктов их распада осуществляются в пищеварительном тракте. Под
влиянием ферментов
желудка, частично соляной
кислоты, нуклеопротеины пищи распадаются на полипептиды и нуклеиновые кислоты;
первые в кишечнике подвергаются гидролитическому расщеплению до свободных аминокислот. Распад нуклеиновых кислот
происходит в тонкой кишке в основном гидролитическим путем под действием ДНК- и
РНКазы панкреатического сока. Продуктами реакции при действии РНКазы являются
пуриновые и пи-римидиновые мононуклеотиды, смесь ди- и тринуклеотидов и
резистентные к действию РНКазы олигонуклеотиды. В
результате действия ДНКазы образуются в основном динуклеотиды, олигонуклеотиды и
небольшое количество мононуклеотидов. Полный гидролиз нуклеиновых кислот до
стадии мононуклеотидов осуществляется, очевидно, другими, менее изученными ферментами
(фосфодиэстеразами) слизистой оболочки кишечника. В отношении дальнейшей судьбы
мононуклеотидов существует два предположения. Считают, что мононуклеотиды в
кишечнике под действием неспецифических фосфатаз (кислой и
щелочной), которые гидролизируют фосфоэфирную связь мононуклеотида
(«нуклеотидазное» действие), расщепляются с образованием нуклеозидов и фосфорной кислоты и в
таком виде всасываются. Согласно второму предположению, мононуклеотиды
всасываются, а распад их происходит в клетках слизистой оболочки
кишечника. Имеются также доказательства существования в стенке кишечника
нуклеотидаз, катализирующих гидролитический распад мононуклеотидов. Дальнейший
распад образовавшихся нуклеозидов
осуществляется внутри клеток
слизистой оболочки преимущественно фосфоролитическим, а не гидролитическим
путем. Всасываются преимущественно нуклеозиды, и в таком виде
часть азотистых оснований может быть использована для синтеза нуклеиновых кислот организма. Если происходит
дальнейший распад нуклеозидов
до свободных пуриновых и пиримидиновых
оснований, то гуанин
не используется для синтетических целей. Другие основания, как показывают опыты
с меченными по азоту
аденином и урацилом, в тканях могут включаться в
состав нуклеиновых
кислот. Однако экспериментальные данные свидетельствуют, что биосинтез азотистых
оснований, входящих в состав нуклеиновых кислот органов
и тканей, протекает
преимущественно, если не целиком, de novo из низкомолекулярных азотистых и безазотистых
предшественников. Таким
образом, синтез нуклеиновых
кислот, мономерными единицами которых являются мононуклеотиды, будет
определяться скоростью синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов; синтез
последних в свою очередь зависит от наличия всех составляющих из трех
компонентов. Источником рибозы
и дезоксирибозы
служат продукты превращения глюкозы
в пентозофосфатном
цикле. Пока не получены доказательства существенной роли пищевых пентоз в синтезе нуклеиновых кислот. Фосфорная кислота также не
является лимитирующим фактором, поскольку она поступает в достаточном
количестве с пищей. Следовательно, биосинтез нуклеиновых кислот
начинается с синтеза азотистых оснований (точнее, мономерных молекул –
мононуклеотидов).
Пищевые нуклеопротеины, попадая в организм человека, в желудке отщепляют
белковый компонент и денатурируют под действием HCl желудочного сока. Далее
полинуклеотидная часть этих молекул гидролизуется в кишечнике до
мононуклеотидов.
В расщеплении нуклеиновых кислот принимают участие ДНК-азы и РНК-азы
панкреатического сока, которые, будучи эндонуклеазами, гидролизуют
макромолекулы до олигонуклеотидов. Последние под действием фосфодиэстераз
панкреатической железы расщепляются до смеси 3'- и 5'-мононуклеотидов. Нуклеотидазы
и неспецифические фосфатазы гидролитически отщепляют фосфатный остаток
нуклеотидов и превращают их в нуклеозиды, которые либо всасываются клетками
тонкого кишечника, либо расщепляются нуклеозидфосфорилазами кишечника с
образованием рибозоили дезоксирибозо-1-фосфата, пуриновых и пиримидиновых
оснований.
Пищевые пурины и пиримидины не являются незаменимыми пищевыми факторами и
очень мало используются для синтеза нуклеиновых кислот тканей. В энтероцитах
обнаружена высокая активность ксантиноксидазы - фермента, который большую часть
пуринов, поступающих в клетки, превращает в мочевую кислоту, удаляющуюся с
мочой. Пиримидиновые основания, не успевшие поступить в энтероциты, под
действием микрофлоры кишечника расщепляются до NH3, CO2,
β-аланина и β-аминоизобутирата.
Денатурация и ренатурация ДНК
Вторичная структура ДНК стабилизируется лишь слабыми водородными и
гидрофобными связями, следовательно, ДНК способна к денатурации (плавлению) при
повышении температуры до 80—90о и ренатурации при последующем
охлаждении.
При денатурации двухспиральная молекула ДНК разделяется на отдельные цепи.
Температура, при которой 50% ДНК денатурировано, называется температурой
плавления и зависит от качественного состава ДНК. Так как пары Г—Ц
стабилизированы тремя водородными связями, а пары А—Т только двумя, то чем выше
доля Г—Ц пар, тем стабильнее молекула. При денатурации ДНК поглощение света при
длине волны 260 нм повышается (гиперхромный эффект), что позволяет легко
контролировать состояние вторичной структуры ДНК.
Проблема биосинтеза нуклеиновых кислот
является предметом пристального внимания многих исследователей и целых научных
коллективов. Следует прежде всего отметить исключительную трудность решения
этой важнейшей проблемы, связанную с неполными представлениями о природе
белковых факторов и механизмах регуляции синтеза нуклеиновых кислот. До сих пор не раскрыты в
деталях молекулярные механизмы передачи генетической информации, закодированной
в нуклеотидной
последовательности ДНК. Различают три
основных этапа реализации генетической информации.
На первом этапе – этапе репликации
происходит образование дочерних молекул ДНК, первичная структура
которых идентична родительской ДНК (копирование ДНК). Репликация ДНК является ключевой
функцией делящейся клетки
и частью таких биологических процессов, как рекомбинация, транспозиция
и репарация.
На втором этапе, названном транскрипцией,
генетическая информация, записанная в первичной структуре ДНК, переписывается в нуклеотидную последовательность
РНК (синтез молекулы РНК на матрице ДНК).
Специальный фермент полимераза
подбирает по принципу комплементарности нуклеотиды и соединяет их в единую
цепочку. Если в нити ДНК стоит Тимин, то полимераза
включает в цепь и-РНК Аденин,
если стоит Гуанин
- включает Цитозин,
если Аденин
- то включает Урацил
(в РНК нет Тимина). По длине каждая из молекул и-РНК короче ДНК в сотни раз, т.к.
она переписывает только некоторые участки цепи (гены), необходимые для
выполнения одной функции.
На третьем этапе – этапе трансляции генетическая
информация, содержащаяся уже в нуклеотидной последовательности
молекулы РНК, переводится в аминокислотную последовательность
белка. Далее представлены
основные итоги исследований и наши представления о биосинтезе полимерных молекул ДНК, РНК и белка, полученные к
середине
Инициация. 1. Узнавание стартового кодона
(AUG), сопровождается присоединением тРНК аминоацилированной метионином (М) и
сборкой рибосомы из большой и малой субъединиц.
Элонгация. 2. Узнавание текущего кодона
соответствующей ему аминоацил-тРНК (комплементарное взаимодействие кодона мРНК
и антикодона тРНК увеличено). 3. Присоединение аминокислоты, принесённой тРНК,
к концу растущей полипептидной цепи. 4. Продвижение рибосомы вдоль матрицы,
сопровождающееся высвобождением молекулы тРНК. 5. Аминоацилирование
высвободившейся молекулы тРНК соответствующей ей аминоацил-тРНК-синтетазой. 6.
Присоединение следующей молекулы аминоацил-тРНК, аналогично стадии (2). 7.
Движение рибосомы по молекуле мРНК до стоп-кодона (в данном случае UAG).
Терминация. Узнавание рибосомой
стоп-кодона сопровождается (8) отсоединением новосинтезированного белка и в
некоторых случаях (9) диссоциацией рибосомы.
Прежде чем изложить современные представления о механизме биосинтеза ДНК, следует представить
сведения о синтезе этого соединения в бесклеточной системе, которыми располагает
биохимия. Известно, что
для любого синтеза полимерной органической молекулы, осуществляемого
in vitro или in vivo, требуется энергия. Источником энергии в реакциях полимеризации
мононуклеотидов является энергия, освобождаемая всеми четырьмя типами
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, участвующих в синтезе ДНК. Образующийся
пирофосфат под действием пирофосфатазы также расщепляется на две молекулы ортофосфата,
давая дополнительную энергию для биосинтеза ДНК.
Помимо энергии, биогенез ДНК требует наличия
специфических ферментов,
катализирующих отдельные этапы синтеза, и множества белковых факторов,
абсолютно необходимых для регулирования процесса репликации и проявления
каталитической активности
ферментов.
Ферментные системы синтеза ДНК у про- и эукариот до конца не
выяснены. По имеющимся данным, в репликации ДНК, включающей узнавание
точки начала процесса, расплетение родительских цепей ДНК в репликационной
вилке, инициацию биосинтеза
дочерних цепей и дальнейшую их элонгацию и, наконец,
окончание (терминация) процесса, участвует более 40 ферментов и белковых факторов,
объединенных в единую ДНК-репликазную систему, называемую реплисомой.
По цепочке ДНК, например,
"ездит" фермент ДНК-полимераза, копирующий молекулы ДНК. Ученые
пытаются искусственно создавать подобные структуры, однако до сих пор ни одна
из них не смогла сравниться с естественным аналогами. Авторы исследования
утверждают, что по многим характеристикам их "молекулярная машина"
превосходит остальные. Однако новая разработка может запутываться при ходьбе.
Сейчас создатели работают над преодолением этой трудности.
Основным ферментом, катализирующим биосинтез новообразованной
ДНК (точнее, стадию элонгации репликации ДНК), является
ДНК-полимераза III, представляющая собой мультимерный комплекс собственно
ДНК-полимеразы (мол. масса около 900000) и ряда других белков. ДНК-полимераза III
из Е. coli состоит минимум из 10 субъединиц. Одна из них – β-субъединица
получена в кристаллическом виде, и выяснена ее третичная структура. Имеются
доказательства, что в димерной форме ДНК-полимераза III катализирует
сопряженный синтез ведущей (лидирующей) и отстающей цепей ДНК при репликации (см. далее).
Более точно выяснена также роль ДНК-полимеразы I: она катализирует отщепление
затравочного олигорибонуклеотидного праймера и заполнение образующихся после
этого пробелов (ниш) дезоксирибонуклеотидами.
Известно, что ДНК-полимеразы II из Е. coli (мол. масса 88000) выполняет
«ремонтные» функции, исправляя повреждения цепей ДНК. Укажем также, что
ДНК-полимераза I в качестве матрицы
использует одноцепочечные участки, в то время как ДНК-полимераза III – двухцепочечные ДНК, в которых
имеются короткие одноцепочечные последовательности.
Важную функцию соединения двух цепей ДНК или замыкания двух
концов одной цепи ДНК
в процессе репликации
либо репарации
ДНК выполняет особый фермент – ДНК - лигаза,
катализирующая за счет энергии АТФ образование
фосфодиэфирной связи между 3'-ОН-группой де-зоксирибозы одной цепи и
5'-фосфатной группой другой цепи ДНК. Функцию раскручивания
(расплетения) двойной спирали ДНК в репли-кационной
вилке, происходящего за счет энергии гидролиза АТФ
1.
Генетический код триплетен. Каждая аминокислота кодируется группой из трех
нуклеотидов.
Транскрипция - биосинтез рибонуклеиновой кислоты (РНК) на матрице - дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК). Транскрипция - один из фундаментальных биологических процессов, первый этап реализации генетической информации, записанной в ДНК в виде линейной последовательности 4 типов мономерных звеньев - нуклеотидов. Она осуществляется специальными ферментами, работа которых определяется так называемыми транскрипционными факторами.
Многие белки
и секретируемые пептиды претерпевают различные структурные изменения в результате
котрансляционных и посттрансляционных модификаций, т.е. во время или после
завершения их синтеза рибосомами. Описано более 100 различных
посттрансляционных модификаций белков . Роль большинства этих модификаций не
выяснена; некоторые из них случайны и, по-видимому, не имеют функционального
значения, но есть и такие, которые важны для жизни клетки, так как они
тщательно контролируются специфическими ферментами. Модификации происходят в ЭР и аппарате
Гольджи . В этих органеллах , например, ферменты
гликозилирования добавляют к белкам сложные цепи остатков сахаров, образуя
гликопротеины. Единственный известный случай гликозилирования в цитозоле клеток млекопитающих -
это добавление к белкам N-ацетилглюкозамина.
Среди известных в настоящее время
модификаций описана одна, чрезвычайно важная для доставки белков к месту
назначения. Присоединение жирной
кислоты к белку
направляет его к определенным мембранам, обращенным в цитозоль. Важной функцией фосфоинозитидов является так называемая якорная
функция - к ним
прикрепляются многочисленные белки
наружной поверхности клетки.
Весьма интересен
молекулярный механизм действия дифтерийного
токсина. Он оказался наделенным способностью катализировать реакцию
АДФ-рибозилирования фактора элонгации
эукариот (eEF-2), выключая тем самым его из участия в синтезе
белка. Резистентность многих животных к дифтерийному
токсину, вероятнее всего, обусловлена трудностью или полным отсутствием
проникновения (транспорта) токсина
через мембрану
клеток.