ФУНДАМЕНТАЛЬНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ ОБМІНУ РЕЧОВИН: КАТАБОЛІЗМ, АНАБОЛІЗМ. СТАДІЇ КАТАБОЛІЗМУ. СПІЛЬНІ ШЛЯХИ ПЕРЕТВОРЕНЬ БІЛКІВ, ВУГЛЕВОДІВ, ЛІПІДІВ. ОСОБЛИВОСТІ ФУНКЦІОНУВАННЯ ЦИКЛУ ТРИКАРБОНОВИХ КИСЛОТ.

ФУНДАМЕНТАЛЬНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ ОБМІНУ РЕЧОВИН: КАТАБОЛІЗМ, АНАБОЛІЗМ. СТАДІЇ КАТАБОЛІЗМУ. СПІЛЬНІ ШЛЯХИ ПЕРЕТВОРЕНЬ БІЛКІВ, ВУГЛЕВОДІВ, ЛІПІДІВ. ОСОБЛИВОСТІ ФУНКЦІОНУВАННЯ ЦИКЛУ ТРИКАРБОНОВИХ КИСЛОТ.

БІОЕНЕРГЕТИЧНІ ПРОЦЕСИ: БІОЛОГІЧНЕ ОКИСНЕННЯ, ТКАНИННЕ ДИХАННЯ. МОЛЕКУЛЯРНА ОРГАНІЗАЦІЯ МІТОХОНДРІАЛЬНОГО ДИХАЛЬНОГО ЛАНЦЮГА. ХЕМІОСМОТИЧНА ТЕОРІЯ ОКИСНОГО ФОСФОРИЛЮВАННЯ. ІНГІБІТОРИ І РОЗ’ЄДНУВАЧІ ОКИСНОГО ФОСФОРИЛЮВАННЯ

 

ВСТУП ДО ОБМІНУ РЕЧОВИН

 

Живі організми є відкритими системами, оскільки між організмом і навколишнім середовищем постійно відбувається обмін речовин і енергії. Організм людини споживає кисень, воду, вуглеводи, жири, білки, мінеральні солі, вітаміни, а виводить вуглекислий газ, воду, сечовину, сечову кислоту й у незначній кількості інші речовини. Із спожитих харчових речовин синтезуються специфічні для організму білки, нуклеїнові кислоти, ліпіди, вуглеводи, з яких будуються клітини, їх мембрани, органели. Разом з тим, клітини руйнують макромолекули шляхом гідролізу й окиснюють продукти розпаду (глюкозу, жирні кислоти, органічні кислоти) для того, щоб отримати енергію.

Обмін речовин включає процеси споживання, нагромадження, перетворення, використання і видалення речовин і енергії, завдяки чому живі організми ростуть, розвиваються, розмножуються в умовах навколишнього середовища, а також пристосовуються до його постійних змін.

Які масштаби обміну речовин? Щоденне споживання дорослою людиною органічних речовин з їжею складає приблизно 0,6 кг; за 40‑50 днів маса органічних речовин, що надійде в організм, становить близько 25 кг, що дорівнює загальній масі органічних речовин у тілі людини. Оскільки маса здорової людини зберігається постійною, то за цей період така ж маса речовин виведеться з організму. За 40 років людина споживає приблизно 6 т твердої їжі й близько 38 т води – такі величезні масштаби обміну речовин.

Використання терміна «метаболізм» може бути в більш розширеному контексті й означати сукупність усіх реакцій від моменту надходження поживних речовин до утворення та виведення кінцевих продуктів обміну. В цьому випадку метаболізм передбачає такі послідовні стадії (рис. 1):

1) надходження білків, ліпідів, вуглеводів, неорганічних речовин з продуктами харчування;

2) перетравлювання органічних речовин до більш простих та їх усмоктування в ШКТ;

3) транспорт сполук кров’ю від ШКТ до клітин організму;

 

Рис. 1. Стадії обміну речовин. Взаємозв’язок обміну речовин і енергії:

1 - травлення; 2, 4 - катаболізм; 3 - анаболізм; 5 - екзергонічні реакції; 6, 7 - ендергонічні реакції; 8 - виділення кінцевих продуктів

 

4) біохімічні перетворення в клітинах різних органів та систем, у тому числі з утворенням кінцевих продуктів;

5) екскреція кінцевих продуктів обміну (СО₂, NH₃, сечовини, сечової кислоти, кон’югатів тощо).

Проте найчастіше під цим поняттям розуміють проміжний обмін (внутрішньоклітинний), що відбувається безпосередньо в клітинах, тобто сукупність усіх хімічних перетворень клітин організму. Так, наприклад, виділяють метаболізм білків, метаболізм вуглеводів, метаболізм нуклеотидів тощо.

Зазначене трактування терміна «обмін речовин» досить умовне. В біохімії людини розглядають як хімічні перетворення, пов’язані з перетравлюванням та всмоктуванням окремих нутрієнтів, так і специфічні реакції, що відбуваються безпосередньо в клітинах.

Для розуміння обміну речовин повинні бути відомими структура речовин, реакції, в які вони вступають, ферменти, які каталізують ці реакції, і регуляторні механізми, що забезпечують нормальний обмін речовин, швидкість послідовних реакцій, при яких відбувається перетворення початкового субстрату в кінцевий продукт. Сукупність таких послідовних реакцій перетворення біомолекули до певного продукту складає метаболічний шлях.

Метаболічний шлях – послідовність біохімічних перетворень, пов’язаних зі специфічним перетворенням сполук у необхідні продукти.

Метаболіти – проміжні продукти метаболічного шляху.

Наприклад, речовина А перетворюється в кінцевий продукт Е в результаті 6 послідовних ферментативних реакцій:

Ферменти, які каталізують ці послідовні стадії, утворюють мультиферментну систему – продукт першої реакції служить субстратом для наступної реакції, каталізується іншим ферментом тощо. Метаболічні шляхи в основному лінійні, хоч можуть бути і циклічні.

Метаболічні шляхи поділяють не лише за видом послідовності реакцій у них, але й за біологічним значенням для життєдіяльності  організму. Виділяють:

Головні метаболічні шляхи – біохімічні перетворення, що пов’язані з розпадом та синтезом найбільш важливих сполук і є загальними для більшості живих організмів.

Специфічні метаболічні шляхи – біохімічні перетворення окремих індивідуальних сполук, які є специфічними для певного виду обміну.

До головних метаболічних шляхів, наприклад, належать синтез ДНК, РНК, білків, цикл Кребса, синтез жирних кислот, тощо. До специфічних метаболічних шляхів потрібно віднести метаболізм глюкуронової кислоти, сорбітолу, карнозину, анзерину тощо.

У клітинах організму відбуваються синтез і розпад сполук, тобто процеси, які мають взаємопротилежні напрям і кінцевий результат. Тому в метаболізмі виділяють:

Анаболізм (anabole – від грец. підйом)  – сукупність біохімічних процесів синтезу складних біомолекул з більш простих.

Катаболізм (katabole – від грец. руйнація) – сукупність біохімічних процесів розщеплення складних молекул до більш простих, у тому числі до кінцевих продуктів обміну.

Відповідно всі метаболічні шляхи в організмі поділяють на:

1) анаболічні – біохімічні перетворення, які спрямовані на синтез білків, ліпідів, вуглеводів тощо.

2) катаболічні – біохімічні перетворення, які містять реакції розщеплення сполук (гідроліз, окиснення, тощо).

Крім того, існують амфіболічні шляхи, які поєднують процеси катаболізму та анаболізму:

Амфіболізм – процес катаболізму, проміжні метаболіти якого можуть бути використані для синтезу (для анаболізму) інших сполук.

Виходячи з визначення, катаболічний шлях може бути амфіболічним (тобто виконувати амфіболічну функцію) в разі, якщо його проміжні метаболіти вилучаються або використовуються для синтезу інших молекул.

Амфіболічні шляхи надають метаболізму певної гнучкості, що дозволяє здійснювати більш точну регуляцію процесів. Крім того, гіпотетичне існування виключно процесів анаболізму та катаболізму, які мають протилежний напрям реакцій, створювало б цикли (футильні цикли), які б не мали ніякого метаболічного сенсу взагалі, що власне спостерігається при деяких патологічних станах.

Для підсилення метаболічних шляхів, що необхідно, наприклад, для утворення більшої кількості енергії, в клітинах існують анаплеротичні реакції (поповнювальні). Послідовність таких реакцій продукує метаболіт, який потім може надходити в певний метаболічний процес, робота якого стане більш ефективною, тобто процес буде підсилений. З термодинамічної точки зору, всі анаболічні процеси є ендергонічними, тобто відбуваються з поглинанням енергії (реакції синтезу та відновлення).

Відповідно катаболічні процеси – це екзергонічні, тобто супроводжуються виділенням енергії, яка акумулюється у високоенергетичних (макроергічних) сполуках (наприклад, АТФ, креатинфосфат тощо); ці сполуки в подальшому використовуються для анаболічних перетворень (рис. 2). Між катаболізмом та анаболізмом існує взаємозв’язок, який реалізується на енергетичному рівні, а також на рівні субстратів. Катаболічні перетворення постачають енергію для реакцій синтезу.

Крім того, в ході катаболізму відбувається утворення простих сполук, які можуть бути використані для синтезу більш складних.

  

Рис. 2. Поєднання ендергонічних процесів з екзергонічними

 

Катаболічні шляхи вивільняють енергію у вигляді АТФ, а також НАДН₂, НАДФН₂ і ФАДН₂. Ця енергія може використовуватись в анаболічних реакціях для синтезу клітинних макромолекул із низькомолекулярних сполук.

У свою чергу, анаболізм постачає складні речовини для катаболізму, реакції якого перетворюють їх у більш прості й проходять з виділенням енергії. Схематично взаємозв’язок анаболізму та катаболізму показано на рис. 3.

Рис. 3. Взаємозв’язок анаболізму та катаболізму на енергетичному рівні

 

http://www.youtube.com/watch?v=MrOK_zWUzpM

 

КАТАБОЛІЗМ І АНАБОЛІЗМ

 

Звичайно процеси метаболізму ділять на процеси катаболізму (від грец. kata – вниз) й анаболізму (від грец. ana – вгору). Порівняємо основні особливості цих процесів.

 

Таким чином, катаболізм і анаболізм – це пов’язані, взаємодоповнювані процеси, що поєднуються через систему АТФ-АДФ, відновлені й окиснені форми коферментів (НАДН⁺ і НАД⁺), субстрати і продукти.

Шлях катаболізму певної речовини і протилежний шлях синтезу цієї ж речовини звичайно дещо відрізняються. Наприклад, розпад глюкози до молочної кислоти в м’язах складається з 11 послідовних стадій, що каталізуються специфічними ферментами. Зворотний шлях (синтез глюкози з молочної кислоти) здійснюється в печінці й включає 8 ферментативних стадій, спільних із катаболічним шляхом, і 3 стадії, відмінні від нього.

Аналогічне спостерігається під час синтезу і розпаду жирних кислот, білків, нуклеїнових кислот. Завдяки неідентичності катаболічний і анаболічний шляхи регулюються незалежно один від одного. Протилежно спрямовані катаболічні й анаболічні шляхи відрізняються своєю локалізацією в клітині, що дає їм змогу відбуватись одночасно і використовувати енергію, яка звільняється під час розпаду речовин, для біосинтезу в інших місцях клітини. Наприклад, окиснення жирних кислот відбувається в мітохондріях, а синтез – у цитоплазмі.

Розглянемо катаболізм детальніше. У ньому можна виділити три головні стадії (рис. 4).

 

Рис. 4. Стадії катаболізму біомолекул

 

http://www.youtube.com/watch?v=XmrwRAytaMU&feature=related

 

На першій стадії макромолекули білків, жирів і вуглеводів розпадаються до своїх мономерів (гексози, пентози, жирні кислоти, гліцерин, амінокислоти). На другій стадії ці метаболіти перетворюються в один спільний продукт – ацетил-КоА. Ці дві стадії складають специфічні шляхи катаболізму, тобто різні для білків, вуглеводів і ліпідів. На третій стадії ацетил-КоА потрапляє в циклічний процес, який називається циклом лимонної кислоти, або циклом Кребса, і окиснюється до СО₂ і Н₂О. Перетворення піровиноградної кислоти в ацетил-КоА, цикл лимонної кислоти і ланцюг тканинного дихання відносять до загального шляху катаболізму, який завершує специфічні етапи розпаду вуглеводів, ліпідів і білків. Таким чином, під час катаболізму з різних вихідних речовин утворюються однакові кінцеві продукти.

Анаболізм також відбувається в декілька стадій, але є відмінності між тваринами, рослинами і бактеріями щодо тих речовин, з яких починаються анаболічні шляхи. Фотосинтезуючі організми будують вуглеводи із СО₂ і Н₂О. В організмі тварин і людини анаболізм починається з піровиноградної кислоти, ацетил-КоА, з проміжних продуктів циклу лимонної кислоти. Із порівняно невеликої кількості простих молекул-попередників утворюється широкий набір різноманітних макромолекул.

Перетворення білків, ліпідів і вуглеводів складають центральні метаболічні шляхи: потоки метаболітів на цих шляхах досить великі (сотні чи десятки грам). В організмі є ще інші метаболічні шляхи зі значно меншим потоком метаболітів (добовий синтез чи розпад вимірюється міліграмами). Ці шляхи становлять вторинний метаболізм. Роль його полягає в утворенні таких різних біологічно активних речовин, як коферменти, гормони, медіатори, пігменти.

Отже, метаболізм виконує чотири специфічні функції:

1) постачання хімічної енергії, яка отримується шляхом розщеплення багатих енергією харчових речовин, синтезу макроергічних сполук (АТФ та інших), їх використання для виконання різних видів роботи;

2) перетворення молекул харчових речовин у низькомолекулярні метаболіти (будівельні блоки), що застосовуються далі клітиною для побудови макромолекул;

3) синтез білків, ліпідів, полісахаридів, нуклеїнових кислот та інших клітинних компонентів із цих будівельних блоків із використанням енергії АТФ і НАДФН;

4) синтез і розпад низькомолекулярних, біологічно активних речовин, необхідних для виконання будь-яких специфічних функцій.

Усі метаболічні шляхи в кінцевому результаті взаємозв’язані й при порушенні будь-якого з них змін зазнають усі інші.

Організм здійснює тонку регуляцію метаболізму, забезпечуючи принцип максимальної економії. швидкість катаболізму визначається не наявністю в організмі клітинного палива (глюкози, жиру), а потребою в енергії. Білки, нуклеїнові кислоти та їх структурні компоненти синтезуються тільки тоді, коли вони потрібні, й у такій кількості, яка необхідна. Надлишок харчових речовин відкладається в організмі тварин і людини. Такими запасними речовинами є глікоген і жир, а білки і нуклеїнові кислоти в запас не відкладаються.

 

РЕГУЛЯЦІЯ ОБМІНУ РЕЧОВИН

 

Є декілька видів регуляторних механізмів:

1) регуляція швидкості надходження метаболітів у клітину;

2) регуляція синтезу ферментів шляхом індукції і репресії;

3) регуляція активності наявних ферментів шляхом алостеричної регуляції, ковалентної модифікації, активації проферментів.

В організмі людини клітини різних органів і тканин диференційовані для виконання специфічних біохімічних і фізіологічних функцій. Тому існують системи, які узгоджують і координують роботу різних органів і тканин. Таку інтегруючу роль відіграють гормональна (ендокринна) і нервова системи (рис. 5), а також судинна система, яка служить для перенесення всіх хімічних речовин в організмі. У нормі ці системи взаємодіють, доповнюючи одна одну.

Дорослий здоровий організм знаходиться в стаціонарному стані й головним фактором, який визначає баланс процесів обміну речовин, є співвідношення між споживанням їжі й витратою енергії.

Рис. 5. Регуляція обміну речовин

 

Недостатнє харчування швидко призводить до зворотної мобілізації енергії із депонованих продуктів, однак тривале голодування чи неповноцінне харчування викликає незворотний розпад тканин. Процеси катаболізму часто переважають в умовах патології. А в період одужання після захворювань, у процесі загоювання ран, у молодому організмі, який росте, та під час вагітності переважає анаболізм. Патологічно виражена перевага анабо­лізму може призвести до надмірного росту – гігантизму (рис. 6), чи ожиріння (рис. 7).

Для біохімічної діагностики захворювань використовують той факт, що регуляторні механізми підтримують концентрацію ряду важливих метаболітів у певних межах (рівень норми), а при патології концентрація їх змінюється, причому ці зміни часто бувають специфічними для тієї чи іншої хвороби. Оскільки концентрація метаболітів змінюється і внаслідок споживання їжі, переходу від спокою до фізичної роботи, то дослідження проводять звичайно натще, після нічного сну.

Рис. 6. Гіпофізарний гігантизм

http://doktorland.ru/gigantizm_nanizm.html

 

Рис. 7.  Ожиріння в дитячому віці

 

http://ua.korrespondent.net/tech/health/1399452-dityache-ozhirinnya-zbilshue-rizik-rozvitku-sercevo-sudinnih-zahvoryuvan-u-zrilomu-vici

 

ОКИСНЮВАЛЬНЕ ДЕКАРБОКСИЛЮВАННЯ ПІРОВИНОГРАДНОЇ КИСЛОТИ

 

Процес окиснювального декарбоксилювання пірувату включає реакції дегідрування і декарбоксилювання, коли карбоксильна група пірувату вивільняється у вигляді СО₂, а ацетильний залишок, тобто залишок оцтової кислоти, переноситься на коензим А:

Каталізує цю сукупність реакцій складний піруватдегідрогеназний комплекс, локалізований у мітохондріях. Тому спочатку піруват переходить із цитоплазми, де відбувається гліколіз, у матрикс мітохондрій.

Піруватдегідрогеназний комплекс складається з 3 різних ферментів: піруватдегідрогенази, дигідроліпоатацетилтрансферази і дигідроліпоатдегідрогенази. До його складу входять 5 коферментів: тіамін-дифосфат (ТДФ), коензим А (КоА), ліпоєва кислота, НАД і ФАД. ТДФ – це похідне вітаміну В₁ (тіаміну), КоА – вітаміну В₃ (пантотенової кислоти), НАД – вітаміну РР (нікотинаміду), ФАД – вітаміну В₂ (рибофлавіну), а ліпоєва кислота є вітаміноподібною сполукою. При нестачі цих вітамінів окиснювальне декарбоксилювання піровиноградної кислоти і ряду інших альфа-кетокислот гальмується; накопичення пірувату і лактату зумовлює ацидоз. У хворих із спадковою недостністю піруватдегідрогенази також може розвинутись ацидоз, особливо після навантаження глюкозою.

Кожний із ферментів піруватдегідрогеназного комплексу каталізує певний етап сумарної реакції, причому ультраструктура комплексу, компактне розміщення всіх компонентів забезпечують ефективну роботу без звільнення проміжних продуктів до завершення процесу. На рис. 8 схематично наводиться послідовність реакцій.

На 1-й стадії піруватдегідрогеназа (Е₁) каталізує декарбоксилювання пірувату з утворенням гідроксіетильного похідного, приєднаного до коферменту ТДФ. Цей проміжний продукт на 2-й стадії взаємодіє з ліпоєвою кислотою – простетичною групою другого ферменту комплексу дигідроліпоатацетилтранс­ферази (Е₂). Ліпоєва кислота може існувати в окисненій (дисульфідній), відновленій (дигідроліпоєва кислота) і відновленій ацильованій формах. Умовно їх позначають так:

При взаємодії дисульфідної форми ліпоєвої кислоти з гідроксі­етильною групою остання окиснюється до ацетильної групи і зв’язу­ється з атомом сірки відновленої ліпоєвої кислоти. Ця окисно-відновна реакція супроводжується утворенням макроергічного тіоефірного зв’язку.

Рис. 8. Стадії окиснювального декарбоксилювання піровиноградної кислоти

 

Дигідроліпоатацетилтрансфераза каталізує перенесення ацетильного залишку з ацетилліпоєвої кислоти на КоА з утворенням ацетил-КоА і дигідро­ліпоєвої кислоти (3-я стадія).

Таким чином, перші три реакції здійснюють перетворення пірувату і КоА в продукти – ацетил-КоА і СО₂.

Дві наступні стадії необхідні для отримання вихідної окисненої форми ліпоєвої кислоти. Дигідроліпоатдегідрогеназа, яка містить простетичну групу ФАД, окиснює дигідроліпоєву кислоту (4-а стадія) і далі передає 2 атоми водню з ФАДН₂ на НАД⁺ (5-а стадія).

Після завершення процесу три коферменти (ТДФ, ліпоєва кислота і ФАД), зв’язані з ферментами, знаходяться у своїй вихідній формі й можуть брати участь у наступному циклі. Два інші коферменти дисоцію­ють з комплексу. Коензим А поставляє ацетильну групу в цикл ­лимонної кислоти, а НАДН, Н⁺ передає водень на мітохондріальний дихальний ланцюг.

Процес окиснювального декарбоксилювання пірувату супроводжується значним зменшенням стандартної вільної енергії і практично незворотний. Активність піруватдегідрогеназного комплексу регулюється двома способами. По-перше, продукти реакції – ацетил‑КоА і НАДН – є алостеричними інгібіторами комплексу. І тоді, коли окиснення ацетил-КоА в циклі лимонної кислоти відстає від утворення його пірувату чи жирних кислот, активність піруватдегідрогеназного комплексу гальмується. Такий же ефект має місце при накопиченні НАДН внаслідок перевантаження дихального ланцюга. Активує комплекс фруктозо-1,6-дифосфат – проміжний продукт гліколізу. Алостеричні ефекти проявляються дуже швидко.

Другий механізм регуляції (повільніший) – це переходи між активною і неактивною формами ферменту внаслідок фосфорилювання і дефосфорилювання (рис. 9).

 

Рис. 9. Регуляція піруватдегідрогеназного комплексу

 

Фосфорильована форма піруватдегідрогенази неактивна, а нефосфорильована – активна. Реакцію фосфорилювання ферменту під дією АТФ каталізує кіназа піруватдегідрогенази, яка активується при високому рівні НАДН і АТФ.

Отже, в таких умовах піруватдегідрогеназний комплес виключається. Протилежний процес активації піруватдегідрогенази шляхом дефосфорилювання каталізує фосфатаза, яка активується іонами Са⁺². Рівень їх у клітині завжди зростає при збільшенні потреби в АТФ. Кіназа і фосфатаза входять до складу піруватдегідрогеназного мультиферментного комплексу.

 

Цикл лимонної кислоти

 

В аеробних умовах вуглеводи окиснюються повністю до СО₂ і Н₂О. Гліколіз становить першу стадію окиснення вуглеводів і закінчується утворенням піровиноградної кислоти, яка не відновлюється до молочної кислоти, як в анаеробних умовах, а окиснюється до ацетил-КоА і СО₂. Далі двовуглецеві ацетильні групи (з ацетил-КоА) окиснюються до СО₂ і Н₂О в ході циклічної послідовності реакцій, що називаються циклом лимонної кислоти, і реакцій тканинного дихання.

При окисненні глюкози до СО₂ і Н₂О вивільнюється значно більше енергії, ніж при гліколізі (максимально 38 моль АТФ на 1 моль глюкози проти 2 моль АТФ при анаеробному гліколізі). АТФ утворюється головним чином шляхом окиснювального фосфорилювання, поєднаного з тканинним диханням.

http://www.youtube.com/watch?v=A1DjTM1qnPM&feature=related

Реакції циклу лимонної кислоти

Цикл лимонної кислоти називають також циклом Кребса (на честь Г. Кребса – лауреата Нобелівської премії 1953 р., який відкрив його у 1937 р.) та циклом трикарбоновних кислот, оскільки ряд проміжних продуктів циклу є трикарбоновими кислотами.

 

КРЕБС Ханс Адольф, сер (Krebs, Sir Hans Adolf; 1900, Хільдесхайм, Німеччина, – 1981, Оксфорд, Великобританія), англійський біохімік. У 1925 р. закінчив Гамбурзький університет. До 1930 р. працював у О.Г. Варбурга в Берліні, потім у медичному інституті міста Фрайбург. У 1933 р., після приходу до влади нацистів, емігрував до Англії, вів наукову роботу в Кембріджському університеті, де в 1934р. отримав ступінь магістра, а потім у ряді англійських університетів, займався дослідженням циклічних реакцій метаболізму клітини (в роки Другої світової війни вивчав також проблеми авітамінозу). З 1947 р.  Кребс – член Лондонського королівського товариства, в 1958 р. зведений у дворянство. З 1967 р. він був професором Королівської лікарні в Оксфорді.

Кребсу належить одне з найважливіших біохімічних відкриттів 20 ст. – встановлення послідовності окисних перетворень лимонної та інших три- та дикарбонових кислот у живих організмах (цикл Кребса). Він описав також орнітиновий цикл синтезу сечовини в печінці тварин. Його наукові досягнення були відзначені Нобелівською премією (1953 р.).

http://www.youtube.com/watch?v=hw5nWB0xN0Y&feature=related

 

Цикл Кребса виконує такі функції:

1) інтегративну  – поєднує шляхи метаболічних перетворень ліпідів, вуглеводів, білків: вказані паливні молекули можуть розщеплюватися до інтермедіатів циклу і синтезуватися з них;

2) енергетичну – в циклі Кребса є одна реакція субстратного фосфорилювання, в якій утворюється 1 молекула ГТФ; потім ГТФ бере участь в утворенні 1 молекули АТФ (тобто енергетичний баланс самого циклу, без подальших перетворень відновних еквівалентів, становить 1 АТФ);

3) воденьгенеруючу – цикл є головним генератором Н⁺ для роботи дихального ланцюга, тому що в циклі Кребса відбувається відновлення НАД⁺ до НАДН^.Н⁺ та ФАД до ФАДН₂; далі НАДН^.Н⁺ та ФАДН₂ окиснюються в дихальному ланцюзі, робо-та якого приводить до синтезу АТФ (тому сумарний енергетичний баланс одного циклу більше ніж 1 АТФ і становить 12 молекул АТФ – розрахунок буде наведений нижче);

4) амфіболічну – інтермедіати цього катаболічного процесу можуть бути використані для синтезу інших сполук. Виведення проміжних метаболітів з циклу повинно бути пов’язане з високою катаболічною активністю циклу Кребса для продукції АТФ.

Під час виведення інтермедіатів циклу лимонної кислоти для синтетичних процесів їх концентрація не повинна суттєво знижуватися, тому що це може нашкодити процесу генерації енергії. Тому в клітині існують «запобіжні клапани», які допомагають підтримувати концентрацію проміжних метаболітів циклу на необхідному рівні – це анаплеротичні реакції.

До таких реакцій належить:

- піруваткарбоксилазна реакція, яка каталізує утворення оксалоацетату з пірувату (одна з основних анаплеротичних реакцій);

- аспартат-амінотрансферазна реакція, яка каталізує утворення оксалоацетату з аспартату;

- глутаматдегідрогеназна реакція, яка каталізує утворення α-кетоглутарату з глутамату;

- утворення сукциніл-КоА з пропіоніл-КоА, який, у свою чергу, утворюється при катаболізмі амінокислот з розгалуженим ланцюгом (Вал, Іле) та жирних кислот з непарним числом атомів вуглецю (один з основних анаплеротичних процесів);

- утворення фумарату при катаболізмі ароматичних амінокислот (Фен, Тир);

- γ-амінобутиратний шунт – процес, який відбувається в мозку і пов’язаний з утворенням ГАМК (гамма-аміномасляної кислоти) – важливого нейромедіатора гальмування, та  її катаболізмом до сукциніл-КоА.

10% глюкози мозку використовується для функціонування цього процесу, тобто він є вкрай важливим для нормальної роботи мозку.

Таким чином, на рівні циклу Кребса відбувається ефективна координація катаболічних та анаболічних процесів, що можливо завдяки існуванню численних високоточних регуляторних механізмів.

Цикл лимонної кислоти включає послідовно 8 реакцій, у результаті яких ацетильна група (СН₃СО^-) ацетил-КоА розпадається з утворенням СО₂ і атомів водню, які передаються на окиснені форми коферментів НАД і ФАД. Послідовність не лінійна, а циклічна, оскільки починається з конденсації двовуглецевої ацетильної групи з щавлевооцтовою кислотою (з чотирма атомами вуглецю). В результаті виникає лимонна кислота (з шістьма атомами вуглецю), далі в реакції декарбоксилювання виділяються 2 молекули СО₂ і в останній реакції циклу знову утворюється щавлево­оцтова кислота (рис. 10).

web-local.rudn.ru/web-local/kaf/rj/index.php?id=8&mod=video

Рис. 10. Схема циклу лимонної кислоти

1.    Проміжні продукти циклу можна назвати як кислоти і як аніони кислот.

2.    Цифрами вказано число атомів вуглецю у сполуках (в ацетил-КоА і сукциніл-КоА – без вуглецевих атомів коензиму А).

 

Ацетил-КоА утворюється не тільки з пірувату, а й із жирних кислот, амінокислот, тому цикл лимонної кислоти розглядається як загальний, кінцевий шлях катаболізму вуглеводів, жирів і амінокислот. Усі реакції циклу відбуваються в мітохондріях. Відновлені НАДН і ФАДН₂, які утворюються у реакціях дегідрування циклу, окиснюються шляхом переносу протонів і електронів по дихальному ланцюгу внутрішньої мембрани мітохондрій на кисень.

http://www.youtube.com/watch?NR=1&v=-_8aYKcQZ_Q

1.     Реакцію конденсації ацетил-КоА з оксалоацетатом з утворенням цитрату каталізує цитрат-синтаза.

Реакція не вимагає затрати АТФ, а необхідна енергія забезпечується гідролізом тіоефірного зв’язку ацетил-КоА. Цитрат-синтаза – регуляторний фермент циклу, активність його гальмується АТФ, НАДН і проміжним продуктом циклу – сукциніл-КоА.

2. Цитрат ізомеризується в ізоцитрат двохетапною реакцією під дією аконітази. При відщепленні молекули води утворюється цис-аконітова кислота, яка, не відділяючись від активного центру ферменту, приєднує ту ж молекулу води іншим способом. Реакція зворотна:

3. Ізоцитрат окиснюється шляхом дегідрування й одночасно декарбоксилюється під дією ізоцитратдегідрогенази:

Для дії ферменту потрібні іони Мg²⁺ чи Мn²⁺. Алостеричні активатори ізоцитратдегідрогенази – АДФ і НАД⁺, інгібітори – АТФ і НАДН. У цитоплазмі клітин відкрита НАДФ-залежна ізоцитратдегідрогеназа.

4. Окиснювальне декарбоксилювання альфа-кетоглутарату до сукциніл-КоА каталізує альфа-кетоглутаратдегідрогеназний комплекс, що, як і піруват­дегідрогеназний комплекс, включає 3 ферменти і 5 коферментів – ТДФ, ліпоєву кислоту, КоА, ФАД і НАД⁺. Механізм реакції також аналогічний до окиснювального декарбоксилювання пірувату. Частина енергії, що вивільняється в реакції окиснення, зберігається в макроергічному тіоефір­ному зв’язку сукциніл-КоА. Активність альфа-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу гальмують АТФ і продукти реакції – НАДН і сукциніл-КоА.

5. У наступній реакції розрив макроергічного зв’язку сукциніл-КоА при перетворенні у вільний сукцинат поєднаний з утворенням гуанозинтрифосфату, так що енергія макроергічного зв’язку зберігається:

Отже, ця реакція субстратного фосфорилювання аналогічна реакціям синтезу АТФ у процесі гліколізу. Каталізує її сукциніл-тіокіназа. Синтезований ГТФ може передати свою кінцеву фосфатну групу на АДФ з утворенням АТФ при дії нуклеозиддифосфаткінази:

6. Сукцинат окиснюється до фумарату. Сукцинатдегідрогеназа, яка каталізує цю реакцію, містить простетичну групу ФАД, що відновлюється до ФАДН₂, і залізо-сірчані центри:

Конкурентним інігібітором сукцинатдегідрогенази є малонова кислота. Серед ферментів циклу лимонної кислоти тільки сукцинатдегідрогеназа локалізована на внутрішній мембрані мітохондрій, а інші знаходяться в їх матриксі.

7. Стереоспецифічний фермент фумараза (фумаратгідратаза) ката­лізує гідратацію фумарової кислоти в L-яблучну (малат):

8. Малат окиснюється НАД-залежною малатдегідрогеназою до оксалоацетату:

Молекула оксалоацетату може з’єднуватись із новою молекулою ацетил-КоА і починати новий оберт циклу.

На рис. 11 показана послідовність реакцій циклу Кребса. Аналіз послідовності дозволяє зробити ряд висновків:

1. У цикл входить двовуглецева ацетильна група (в складі ацетил-КоА), а виходять 2 молекули СО₂.

2. У чотирьох реакціях дегідрування від проміжних продуктів циклу відриваються 4 пари атомів водню. Із них 3 пари використовуються на відновлення НАД⁺, а одна пара – ФАД.

3. Частина атомів кисню, необхідних для утворення СО₂, і атомів водню – для відновлення коферментів, постачаються молекулами води, які застосовуються в реакціях циклу.

 

Рис. 11. Цикл Кребса

4. Молекула оксалоацетату, що потрапляє в цикл, у результаті ­одного оберту циклу регенерується. Таким чином, оксалоацетат у циклі не витрачається і наново не утворюється (як і інші проміжні продукти циклу).

5. Один раз у циклі має місце реакція субстратного фосфорилювання, коли за рахунок макроергічного зв’язку субстрату утворюється молекула ГТФ (АТФ).

http://www.youtube.com/watch?v=3OmMOcbTqE4&feature=related

Сумарне рівняння циклу лимонної кислоти має вигляд:

Для нових обертів циклу відновлені коферменти повинні окиснитись, що відбувається шляхом переносу електронів і протонів по дихальному ланцюгу внутрішньої мембрани мітохондрій на молекулярний кисень з утворенням молекул води. Саме тому цикл лимонної кислоти є аеробним киснезалежним шляхом, хоч у жодній реакції циклу молекулярний кисень не використовується. За рахунок окиснювального фосфорилювання, поєднаного з переносом електронів і протонів по дихальному ланцюгу, забезпечується синтез основної кількості АТФ. Враховуючи, що окиснення однієї молекули НАДН призводить до утворення 3 молекул АТФ, окиснення однієї молекули ФАДН₂ – 2 АТФ, загальний вихід АТФ при окисненні однієї молекули ацетил-КоА складає:

Участь вітамінів у роботі циклі лимонної кислоти

Для роботи циклу потрібні п’ять вітамінів:

1) В₁ (тіамін) у вигляді тіаміндифосфату (ТДФ) є коферментом α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу;

2) В₂ (рибофлавін), коферментна форма якого – ФАД, є складовою α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу та сукцинатдегідрогенази;

3) РР (ніацин) у вигляді НАД входить до складу трьох дегідрогеназ ЦЛК (ізоцитратдегідрогенази, α-кетоглута-ратдегідрогеназного комплексу, малатдегідрогенази);

4) В₅ (пантотенова кислота) входить до складу коферменту А (КоА), який бере участь в активації ацильних залишків і утворює ацетил-КоА та сукциніл-КоА;

5) ліпоєва кислота – дві молекули цієї кислоти у вигляді аміду входять до складу α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу (другого ферменту комплексу Е₂ ).

Тобто у складі α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу функціонують  В₁, В₂, РР, ліпоєва кислота.

 

Роль циклу лимонної кислоти в анаболізмі

Як розглянуто вище, цикл лимонної кислоти служить для окиснення до СО₂ і Н₂О ацетил-КоА і, таким чином, є заключним етапом катаболізму вуглеводів, жирних кислот і амінокислот. Але, крім того, цикл відіграє значну роль і в біосинтезі основних класів біомолекул. Так, субстрат і проміжні продукти можуть виходити з циклу і використовуватись як попередники для біосинтезу різних сполук. Зокрема, альфа-кетоглутарат, оксалоацетат, а також тісно зв’язаний із циклом лимонної кислоти піруват використовуються для синтезу амінокислот. Оксалоацетат є проміжним продуктом глюконеогенезу – процесу синтезу глюкози з невуглеводних попередників (лактату і пірувату, амінокислот).

Таким чином, будь-який проміжний продукт циклу лимонної кислоти, переходячи в оксалоацетат, може застосовуватись для синтезу глюкози і глікогену. Ацетил-КоА є вихідною речовиною для синтезу жирних кислот, який здійснюється в цитоплазмі. І оскільки ацетил-КоА утворюється в мітохондріях, а через мітохондріальну мембрану прямо не переноситься, транспортною системою є сама лимонна кислота. Тобто в умовах, які сприяють використанню ацетил-КоА для синтезу жирних кислот, мітохондріальна цитрат-синтаза каталізує утворення лимонної кислоти, яка не починає цикл, а виходить у цитоплазму, де під дією ферменту цитратліази розпадається на ацетил-КоА й оксалоацетат. Ще один проміжний продукт циклу лимонної кислоти – сукциніл-КоА – використовується для синтезу гему.

При застосуванні проміжних продуктів циклу лимонної кислоти (від цитрату до оксалоацетату) для біосинтезу різних речовин у клітині знижується вміст оксалоацетату і в результаті активність циклу повинна би зменшуватись аж до зупинки його. Така вірогідність запобігається реак­ціями, які покривають втрати проміжних продуктів циклу. Основною з них є перетворення в мітохондріях пірувату в оксалоацетат під дією піруваткарбоксилази:

У піруваткарбоксилазі коферментом виступає вітамін Н (біотин). За рахунок розщеплення АТФ утворюється проміжний комплекс – фермент-біотин-СОО, з якого карбоксильна група переноситься на піруват. Активатором піруваткарбоксилази є ацетил-КоА. Таким чином, при на­явності ацетил-КоА і недостачі оксалоацетату стимулюється піруваткарбоксилазна реакція, в результаті утворюється більше оксалоацетату, що забезпечує синтез лимонної кислоти і функціонування циклу. Використання проміжних продуктів циклу лимонної кислоти з біосинтетичною метою повинно супроводжуватись катаболічною активністю циклу для утворення АТФ, який необхідний для здійснення реакцій анаболізму. Таким чином, цикл повинен одночасно виконувати обидві функції. Зазначимо, що окиснення ацетил-КоА в циклі, тобто катаболічна функція, не вимагає одночасного застосування проміжних продуктів для синтезу біомолекул.

Отже, цикл лимонної кислоти разом із тканинним диханням і окиснювальним фосфорилюванням забезпечує утворення основної кількості АТФ у клітині, об’єднує процеси метаболізму всіх основних класів біомолекул, зв’язує процеси катаболізму й анаболізму.

 

Регуляція циклу лимонної кислоти

Цикл лимонної кислоти регулюється рядом факторів. По-перше, концентрацією субстратів – ацетил-КоА і оксалоацетату. Ацетил-КоА утворюється при катаболізмі вуглеводів і жирних кислот, його рівень визначається активністю піруватдегідрогеназної реакції і ­окисненням жирних кислот. Концентрація в мітохондріях оксалоацетату, який утворюється в піруваткарбоксилазній реакції, а також з аспарагінової кислоти, досить низька і залежить від метаболічних умов. Використовується оксалоацетат у різних метаболічних шляхах:

1) у циклі лимонної кислоти;

2) для глюконеогенезу;

3) для утворення аспарагінової кислоти, яка застосовується для синтезу пуринів, піримідинів, аргініну і сечовини;

4) для компенсації втрат із циклу лимонної кислоти інших проміжних продуктів (цитрату, альфа-кетоглутарату, сукциніл-КоА).

У нормальних умовах баланс між кількістю ацетил-КоА й оксалоацетату досягається завдяки активації ацетил-коензимом А піруваткарбоксилазної реакції. Баланс порушується під час голодування, коли внаслідок окиснення тканинного жиру в печінці накопичується надлишок ацетил-КоА, і при цукровому діабеті, коли порушується катаболізм глюкози і внаслідок недостачі пірувату не утворюється достатня кількість оксалоацетату. У цих випадках відносна нестача оксалоацетату, порівняно з рівнем ацетил-КоА, гальмує цикл лимонної кислоти, зумовлює підвищений синтез з ацетил-КоА кетонових тіл і розвиток кетозу.

Крім цитратсинтази, регуляторними ферментами циклу лимонної кислоти є ізоцитратдегідрогеназа й альфа-кетоглутаратдегідрогеназа. Усі вони чутливі до співвідношення концентрацій у клітині АТФ/АДФ, НАДН/НАД⁺ (табл. 3).

Таблиця 3. Активатори й інгібітори регуляторних ферментів

циклу Кребса

 

При високих значеннях цих відношень активність регуляторних ферментів циклу пригнічується. Таким чином, коли в клітині є високий рівень АТФ, робота циклу припиняється, а при використанні АТФ і зростанні рівня АДФ – стимулюється. Інгібітором цитратсинтази й альфа-кето­глутаратдегідрогенази служить також сукциніл-КоА – проміжний продукт циклу.

 

БІОЕНЕРГЕТИЧНІ ПРОЦЕСИ: БІОЛОГІЧНЕ ОКИСНЕННЯ, ТКАНИННЕ ДИХАННЯ. МОЛЕКУЛЯРНА ОРГАНІЗАЦІЯ МІТОХОНДРІАЛЬНОГО ДИХАЛЬНОГО ЛАНЦЮГА. ХЕМІОСМОТИЧНА ТЕОРІЯ ОКИСНОГО ФОСФОРИЛЮВАННЯ. ІНГІБІТОРИ І РОЗ’ЄДНУВАЧІ ОКИСНОГО ФОСФОРИЛЮВАННЯ

 

Розділ біохімії, що займається питаннями перетворення і використання енергії у живих системах, називається біоенергетикою. Біоенергетика грунтується на процесах окиснення органічних речовин.

Початки вивчення енергетичних процесів у живих організмах були закладені французьким ученим Лавуазьє ще в XVIII ст. Він уперше звернув увагу на подібність згорання органічних речовин поза організмом з процесом дихання в тварин. Оскільки при згоранні речовин утворюються СО₂ і Н₂О, а під час дихання виділяються такі ж речовини і певна кількість тепла, то Лавуазьє цілком логічно вважав, що дихання організму – процес з'єднання кисню повітря з вуглецем і воднем органічних речовин всередині тіла. Експерименти Лавуазьє, а також його висновки послужили основою для ствердження, що живі організми підпорядковуються першому принципу термодинаміки. Це означає, що спалювання цукру поза організмом (in vitro) і окиснення його в організмі (in vivo) можна зобразити у вигляді хімічної реакції:

С₆Н₁₂O₆ + 6О₂ ® 6СО₂ + 6 Н₂О + тепло

Всі хімічні реакції в живих клітинах підпорядковуються законам термодінамики.

Перший  закон: енергія не створюється з нічого та не зникає, вона лише перетворюється в еквівалентних кількостях з одного виду в інший, тобто внутрішня енергія системи залишається постійною. Самовільно хімічні процеси можуть проходити лише в одному напрямку – досягнення рівноваги,  тобто максимальної ентропії. Ентропія – це міра хаосу, неупорядкованості.

Другий закон: ентропія  при самовільних процесах  зростає. Самовільно неупорядкована  система ніколи не перетвориться в упорядковану. Для цього перетворення треба витратити додаткову енергію. Напрямок перебігу реакцій можна визначити на практиці за допомогою вільної енергії системи, котру можна виміряти. Енергетичний стан будь-якої системи виражається цією формулою:          

D G = D Н - T D S

D G  -   це та частина енергії системи, котру  можна використовувати для виконання роботи; Т D S  - зв’язана енергія, котра не може бути використана на роботу; DН  -  ентальпія – внутрішня енергія системи (може бути вимірена  експериментально). - якщо  DG < 0, то реакція екзергонічна, тобто перебігає самовільно з вивільненням енергії  (ці  реакції постачають клітинам енергію); - якщо  DG > 0, то реакція ендергонічна, тобто відбувається з використанням зовнішньої енергії; - якщо  DG = 0, - це стан рівноваги.

 

Екзергонічні і ендергонічні процеси

Життєво необхідні процеси – реакції синтезу, скорочення м’язів, проведення нервових імпульсів, активний транспорт – отримують енергію шляхом хімічного поєднання з  окисними реакціями, тобто існує поєднання екзергонічних реакцій з ендергонічними.

До екзергонічних реакцій  належать  катаболічні реакції  - реакції розщеплення або окиснення  “паливних” молекул (енерговмісних нутрієнтів), котрі надходять в організм у складі харчових продуктів.

До ендергонічних реакцій належать  анаболічні реакції - реакції синтезу складних біоорганічних сполук – клітинних макромолекул.

Сукупність усіх біохімічних перетворень хімічних речовин у живому організмі – це метаболізм. Для поєднання цих процесів необхідний посередник. У процесі екзергонічних реакцій синтезуються сполуки з високим енергетичним потенціалом ~ Е, котрі вже далі використовуються в ендергонічних реакціях. Таким шляхом відбувається передача хімічної енергії від екзергонічного до ендергонічного процесу. Сполуки з високим енергетичним потенціалом, макроергічні сполуки (~Е), – це біомолекули з високою стандартною вільною енергією  перенесення кінцевої фосфатної групи.

В біології міцно закріпилось уявлення, що дихання в організмі (окиснення) за своєю суттю є процесом “горіння”, яке відбувається дуже повільно. Отже, поживні речовини, що потрапили в організм з їжею, є “паливом”, яке згорає в організмі шляхом приєднання кисню повітря. Разом з тим, було звернуто увагу на той факт, що повільне “горіння” органічних речовин в організмі істотно відрізняється від такого, що проходить поза організмом: по-перше, воно відбувається при низькій температурі, по-друге, – при відсутності полум'я і, по-третє, – за наявності води, вміст якої в тканинах досить високий.

Для пояснення перебігу окисних процесів в організмі (повільне горіння) були запропоновані гіпотези активації кисню в клітинах. Першу спробу пояснити механізм активації кисню в організмі здійснив німецький хімік Христіан Фредерік Шенбайн (1860 р.), котрий спершу відкрив активний кисень – озон, що має здатність окиснювати речовини і при звичайній температурі. На цій підставі Шенбайн припустив, що в організмі під впливом легкоокиснювальних речовин відбувається розщеплення молекули кисню на два атоми озону, які легко окиснюють інші речовини. Одначе гіпотеза Шенбайна не була підтверджена експериментально. Значення праць Шенбайна тільки в тому, що вони стали початком наступних теорій активації кисню в організмі.

У 1897 р. була обгрунтована перша гіпотеза біологічного окиснення, названа гіпотезою перекисного (пероксидного) окиснення. Її запропонували одночасно російсько-український учений О.М. Бах та німецький ­Енглер. Ці автори вважали, що молекула кисню в тілі живого активується легкоокиснювальними речовинами, але за іншими механізмами, ніж це передбачав Шенбайн.

Припускалось, що в процесі активації кисню відбувається розрив не обох зв'язків, а тільки одного, і в подальшому окиснення відбувається шляхом приєднання до речовини всієї молекули кисню з утворенням молекули пероксиду:

    

Кисень у цій реакції приєднується до органічної речовини (позначеної буквою А), що має здатність до автоокиснення – оксигенази. Далі утворений пероксид віддає активований кисень субстратові окиснення за допомогою ферменту пероксидази. Таким чином, у процесі окиснення, за пероксидною гіпотезою, необхідно два ферменти – оксигеназа, яка активує кисень з утворенням пероксиду, та пероксидаза, яка окиснює речовину за допомогою пероксиду. Але пізніше було показано, що цей механізм є не головним, а тільки окремим випадком біологічного окиснення, і не має відношення до енергозабезпечення тканин. Такий тип окиснення органічних речовин має місце в ендоплазматичному ретикулумі печінки, і його призначення – зне­шкоджувати шляхом окиснення токсичні речовини.

Ідею про активацію кисню в процесі біологічного окиснення продовжив і значно розвинув знаменитий німецький учений О. Варбург. Він розробив вчення, згідно з яким активація кисню є ключовою ланкою в біологічному окисненні, результатом якого є з'єднання кисню і водню з утворенням води. Варбургу належить також відкриття гем­вмісного ферменту – цитохромоксидази, що активує кисень у процесі біологічного окиснення, він же вперше сконструював апарат для вивчення тканинного дихання, названий його іменем.

Треба зазначити, що одночасно з відкриттям цитохромоксидази були відкриті ферменти дегідрогенази, які здатні відщеплювати від субстратів атоми водню і цим самим окиснювати їх.

Була запропонована нова гіпотеза біологічного окиснення, згідно з якою визначальна роль відводилась процесам дегідрування субстратів (відщеплення атомів водню). Цю ідею відстоювали Паладін, Віланд, Тунберг та ін. Тільки з відкриттям у 1933 р. Кейліним цитохромів, які виявились проміжними переносниками електронів від водню до кисню, були узгоджені оксидазна концепція Варбурга з дегідрогеназною Паладіна, Віланда. 

Це означало, що як активація атомів водню в субстраті за допомогою дегідрогеназ, так і активація кисню за участю цитохромоксидази є необхід­ними складовими ланками біологічного окиснення, яке відбувається в тканинах організму. Таким чином, теорія біологічного окиснення, вперше запропонована у XVIII ст. Лавуазьє як процес повільного горіння, що призводить до утворення СО₂, Н₂О і енергії, була завершена тільки в XX ст. В опрацюванні її брали участь також Кейлін, Кребс, Мітчел, Ленінджер, Чанс, Рекер, Беліцер, Енгельгардт та ін. Цими ж авторами було доведено, що окиснення субстратів до СО₂ і Н₂О з виділенням енергії відбувається в різних тканинах організму, тому біологічне окиснення називають ще тканинним або клітинним диханням. Основним місцем у клітині, де завершується окиснення субстратів та виділяється енергія, є мітохондрії, тому їх назвали енергетичними станціями клітини. В мітохондріях відбувається не тільки окиснення субстратів шляхом відщеплення атомів водню і перенесення останніх на кисень, але й одночасне перетворення та запасання енергії у хімічній формі в так званих макроергічних зв'язках аденозинтрифосфату (АТФ).

Біологічне окиснення – це сума всіх окисно-відновних процесів, включаючи анаеробні, що відбуваються в клітинах організму (цитоплазмі, мітохондріях, ендоплазматичному ретикулумі). Основними субстратами біологічного окиснення є вуглеводи та ліпіди, саме їх катаболізм дає найбільшу кількість хімічної енергії, що акумулюється у високоенергетичних зв’язках макроергів.

Функції біологічного окиснення:

1.     Забезпечення клітин енергією;

2.     Забезпечення клітин пластичним матеріалом для відтворення структур організму;

3.     Знешкодження токсичних речовин.

Тканинне дихання – це окиснення речовин з допомогою кисню, що відбувається на внутрішній мембрані мітохондрій, супроводжується утворенням Н2О і АТФ.

Дихальний ланцюг або дихальний ансамбль – це система ферментів і коферментів, з допомогою яких відбувається транспорт електронів і протонів водню від субстрату до кисню з утворенням Н₂О і АТФ.  Його складові вбудовані у внутрішню мембрану мітохондрій: від 5 до 20 тисяч ансамблів в одній мітохондрії.

Енергетичний обмін – це перетворення енергії харчових речовин в інші форми хімічної енергії (АТФ, НАДН, ФАДН2) і використання цих форм енергії для виконання роботи.

Біологічне окиснення каталізується ферментами  і може відбуватися такими шляхами:

1) приєднання кисню до субстрату окиснення;

2) відщеплення водню від субстрату (дегідрування);

3) відщеплення електронів.

Біоенергетика включає 3 вузлові питання:

1) джерела енергії;

2) способи перетворення і нагромадження енергії;

3) шляхи використання енергії.

 

Типи реакцій біологічного окиснення: дегідрогеназні, оксигеназні, оксидазні, пероксидазні, вільнорадикальні, їх суть і біологічне призначення

 

Існують різні типи реакцій окиснення органічних субстратів, в котрих використовується кисень :

1. Дегідрогеназні реакції. У результаті цих реакцій відбувається перенесення водню з субстрату (S) на акцептор (А):             

SH₂ + A → S + AH₂.

Ферменти, що каталізують реакції цього класу, мають назву дегідрогенази.

Залежно від типу акцептора водню реакції дегідрування поділяють на два підкласи:

- реакції, які каталізують анаеробні дегідрогенази, акцептором (А) є сполука, яка відмінна від кисню (НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, убіхінон, глутатіон, ліпоєва кислота тощо);                                                    

- реакції, які каталізують аеробні дегідрогенази (оксидази), акцептором (А) в цих реакціях є кисень (О₂):                    

SH₂ + 1/2O2  → S + H₂O

(цитохромоксидаза)

Оксидазні реакції  (80-90%  споживання кисню). Продукти – окиснений субстрат, вода та енергія. Реалізується у мітохондріях у дихальному ланцюзі.

2. Оксигеназні реакції (8-12%  споживання кисню). Реакції цього класу каталізують ферменти оксигенази, які приєднують до субстрату окиснення один або два атоми кисню. Тому залежно від кількості атомів кисню, що приєднуються, ферменти поділяють на:

-  монооксигенази (відповідно реакції – монооксигеназні):

SH + 1/2О₂ → S-ОН

До монооксигеназ належить цитохром Р₄₅₀, що каталізує гідроксилювання ендогенних та екзогенних субстратів;

- диокисгенази (відповідно реакції – диоксигеназні):

S + О₂ → SО₂.

- за допомогою монооксигеназ: один атом кисню включається у субстрат, другий – у  молекулу води;  за допомогою диоксигеназ:  обидва атоми кисню включаються у  субстрат.

3. Пероксидазні реакції: це шлях відновлення кисню до пероксиду водню за  допомогою пероксидутворюючих ферментів – флавопротеїнів.

SH₂ + О2 → S + H₂О₂

(ксантиноксидаза, аміноксидаза, глюкозоксидаза)

За цим шляхом окиснюються біогенні аміни, амінокислоти. Перекис водню – це токсична речовина, але у фагоцитуючих клітинах, наприклад, лейкоцитах, її утворення необхідне для знешкодження патогенних бактерій.

4. Вільнорадикальні реакції  відбувається під дією активних форм кисню (АФК), що утворюються шляхом одноелектронного відновлення кисню. До АФК належать:

        - супероксид-аніон;

        - перекис водню;

        - гідроксильний  радикал;

        - синглетний кисень.

 

МАКРОЕРГІЧНІ СПОЛУКИ

 

АТФ відноситься до сполук, що містять макроергічні зв’язки, тобто багаті енергією. Зазначимо відмінність поняття «багатий енергією зв’язок» у біохімії від поняття «енергія зв’язку» у хімії. Під останнім поняттям у хімії розуміють енергію, необхідну для розриву зв’язку між двома атомами в молекулі (для розриву макроергічних зв’язків також потрібно затратити енергію). Розглядаючи в біохімії високоенергетичні та низькоенергетичні зв’язки і сполуки, енергію зв’язку визначають як вільну енергію, що виділяється при гідролітичному розпаді даної сполуки.

У реакції АТФ + Н₂О ® АДФ + Ф_н зміна вільної енергії дорівнює 34,5 кДж/моль. Зміни для інших реакцій гідролізу АТФ, АДФ і АМФ складають:

Зв’язок вважається високоенергетичним, якщо при гідролізі його звільняється більше 21 кДж (за іншими джерелами – 30 кДж/моль). Таким чином, у молекулі АТФ є два макроергічних зв’язки, які характеризуються величиною вільної енергії 28-37 кДж/моль. Макроергічний зв’язок містить і АДФ, але при його гідролізі до АМФ і Ф_н енергія вилучається у вигляді тепла.

Зазначимо, що в різних джерелах наводяться різні значення ΔG гідролізу АТФ. Це пояснюється тим, що реальне значення вільної енергії гідролізу АТФ (та інших сполук) залежить від концентрації АТФ, АДФ, АМФ, Фн, іонів Мg²⁺, величин рН і температури. При стандартних умовах (рН 7,0; температура 25 °С; концентрація АТФ, АДФ і Ф_н рівні 1 М; надлишок іонів Мg²⁺) G дорівнює 34,5 кДж/моль. Але у клітинах концентрації АТФ, АДФ, Ф_н набагато менші 1М, не однакові між собою та різні для різних клітин. Крім того, рН також якоюсь мірою відрізняється від стандартного 7,0. Тому справжнє значення зміни вільної енергії при гідролізі АТФ у фізіологічних умовах перевищує зміну стандартної вільної енергії (34,5 кДж/моль) і коливається у межах 40-60 кДж/моль (у середньому 50 кДж/моль).

Величини ∆G для гідролізу ряду інших сполук, зокрема ангідридів фосфорної кислоти, наведені у табл. 4.

Таблиця 4. Стандартна вільна енергія гідролізу (AG) деяких високоенергетичних та низькоенергетичних сполук

 

Зазначимо, що ряд високоенергетичних сполук мають більшу вільну енергію гідролізу, ніж АТФ. Наприклад, фосфоенолпіруват або 1,3-дифосфогліцерат, що утворюються при розщепленні глюкози до лактату. Але ці сполуки (надвисокоенергетичні) під дією специфічних кіназ можуть передавати свої фосфатні групи тільки на АДФ, що призводить до утворення АТФ, і не можуть служити джерелом енергії для інших сполук. Проміжне значення ∆G для АТФ дуже важливе для забезпечення функції її як посередника «біохімічної енергетичної валюти». Рівноцінні з АТФ інші нуклеозидтрифосфати (ГТФ, УТФ, ЦТФ, ТТФ).

Чому при гідролізі АТФ та інших макроергічних сполук виділяється значно більше енергії, ніж, наприклад, при гідролізі глюкозофосфатів? Це зумовлено властивостями всієї структури макроергічної сполуки, а не тільки зв’язком, при гідролітичному розриві якого виділяється вільна енергія. Існує ряд факторів, які вносять свій вклад у процес звільнення великої кількості вільної енергії при гідролізі макроергічних зв’язків:

1) електростатичне відштовхування. При рН 7,0 у молекулі АТФ всі чотири групи ОН зв’язані з фосфором і несуть негативні заряди (АТФ^4‑). Відштовхування однойменних зарядів призводить до електростатичної напруги у всій молекулі, особливо зв’язку Р-О-Р. Коли зв’язок розривається, електростатична напруга знімається за рахунок просторового роз’єднання негативно заряджених продуктів гідролізу АДФ^3- і НРО₄^2-;

2) фактор конкурентного резонансу. Два продукти гідролізу, АДФ^3- і НРО₄^2-, є резонансними гібридами, тобто такими структурними формами, що мають підвищену стійкість, бо частина їх електронів перебуває в конфігураціях з нижчими енергетичними рівнями, порівняно з АТФ;

3) виділення протонів. Сумарне рівняння гідролізу АТФ має такий вигляд:

АТФ ^4- + Н₂О ® АДФ^3- + НРО₄^2- + Н⁺

Зв’язування цього протона з буферним середовищем (рН 7,0) ­зсуває реакцію вправо, що вносить вклад у зміну вільної енергії.

 

Інтенсивність оновлення АТФ в організмі

Яка кількість АТФ синтезується і розпадається за добу? Доросла здорова людина масою 70 кг при сидячій роботі повинна споживати за день їжі калорійністю близько 12 000 кДж. Харчові продукти роз­щеплю­ються у процесі метаболізму, а вільна енергія, що звільняється при цьому, використовується для синтезу АТФ, який далі витрачається на виконання хімічної, механічної, осмотичної й електричної робіт. Ефектив­ність перетворення енергії харчових продуктів у енергію АТФ дорівнює приблизно 50 %. Враховуючи, що при гідролізі АТФ у фізіологічних умовах звільняється 50 кДж/моль вільної енергії, можна визна­чити кількість АТФ, яка утилізується за добу.

В організмі людини міститься всього близько 50 г АТФ, тому ця кількість АТФ характеризує не загальну масу АТФ, а швидкість обороту АТФ-АДФ. Розраховано, що кожна молекула АТФ розпадається і знову регенерується 2,5 тисячі разів за добу, так що середня трива­лість її життя менша 1 хв. Синтез АТФ із АДФ і Ф_н здійснюється двома шляхами – окиснювальним фосфорилюванням і субстратним фосфорилюванням. У більшості клітин головним процесом є окиснювальне фосфорилювання.

 

Шляхи синтезу АТФ в клітинах: субстратне та окисне

фосфорилювання, їх відмінності

 

Синтез АТФ із АДФ і фосфату (фосфорилювання АДФ) відбувається в організмі за двома шляхами, котрі відрізняються  один від іншого джерелом енергії  для утворення макроергічного зв’язку :

Окисне фосфорилювання (головний шлях синтезу):  здійснюється за рахунок енергії окиснення електронів і протонів водню, відщеплених від різноманітних сполук (метаболітів або  субстратів окиснення), який відбувається за участю дихального ланцюга мітохондрій за рахунок електрохімічного потенціалу внутрішньої мембрани. Реакції цього процесу відбуваються виключно в аеробних умовах. Основна кількість АТФ в організмі  утворюється саме в реакціях окисного фосфорилювання.

Субстратне фосфорилювання – процес синтезу АТФ, який відбувається як результат окиснення субстратів без участі дихального ланцюга мітохондрій. У цьому разі перетворення субстрату в продукт супроводжується фосфорилюванням АДФ з утворенням АТФ. В організмі є три реакції субстратного фосфорилювання (дві – в гліколізі, одна – в ЦТК). Кожна з цих реакцій супроводжується утворенням лише одної молекули АТФ. Цей процес можливий як в аеробних, так і анаеробних умовах і відбувається в цитоплазмі і матриксі мітохондрій.

Найбільш потужними процесами продукування енергії в клітинах є аеробні. Використання клітинами кисню необхідне для окиснення субстратів, кінцевими продуктами якого є Н₂О, СО₂, АТФ. Крім того, виділяється аміак, який у подальшому зазнає знешкодження. Таким чином, клітини, тканини «дихають» і виробляють енергію, яка необхідна для життєдіяльності.

http://www.youtube.com/watch?v=XmrwRAytaMU&feature=related

Хімічна енергія органічних речовин їжі (вуглеводів, жирів, білків) перетворюється в енергію макроергічних зв'язків АТФ у процесі тканинного (клітинного) дихання. Суть його зводиться до окиснювального розщеплення молекул органічних речовин, що супроводжується спожи­ванням О₂ з виділенням Н₂О і СО₂ і звільненням енергії. На першому і другому етапах катаболізму вуглеводів, жирів і білків звільняється невелика кількість енергії, відповідно близько 1 і 10 %, причому на першому етапі вона розсіюється у вигляді тепла, а на другому частково використовується для синтезу АТФ (у процесі субстратного фосфорилювання під час гліколізу). Основна маса енергії звільняється на третьому етапі окиснення поживних речовин, що реалізується у мітохондріях і включає реакції циклу лимонної кислоти (циклу Кребса) та ланцюг перенесення електронів і протонів на кисень (дихальний ланцюг). У циклі лимонної кислоти вуглецеві атоми субстратів окиснюються і звільняються у вигляді СО₂.

Окиснення вуглецю відбувається за рахунок кисню самих субстратів і кисню води. Атоми водню (електрони і прото­ни) відриваються від субстратів і переносяться компонентами дихального ланцюга на молекулярний кисень, відновлюючи його до води. Вільна енергія, що звільняється в дихальному ланцюгу під час електрон­ного перенесення, використовується для синтезу АТФ із АДФ і Ф_н шляхом окиснювального фосфорилювання.

http://www.youtube.com/watch?v=9p6bDf3lu6s&feature=related

Отже, процес біологічного окиснення субстратів – проміжних продуктів метаболізму вуглеводів, жирів і амінокислот – відбувається не за рахунок приєднання атомів кисню до молекули речовини, а шляхом відщеплення атомів водню (дегідрування) і багатоетапного перенесення електронів і протонів на молекулярний кисень.

Як сказано вище, в організмі мають місце і реакції окиснення субстратів, коли атоми кисню включаються у молекулу субстрату або коли субстрат реагує безпосередньо з О₂. Але при таких реакціях неможливий синтез АТФ. Енергія окиснення при цьому використовується для знешкодження токсичних або біосинтезу нових речовин.

Ферменти біологічного окиснення в мітохондріях: піридинзалежні, флавінзалежні дегідрогенази, цитохроми, їх будова і функції

 

Ферменти, які каталізують окиснення субстратів шляхом дегідрування, називаються дегідрогеназами. Розрізняють дві групи дегідрогеназ: нікотинаміддинуклеотидні (піридинові) і флавінові. Окиснення більшості субстратів каталізують ферменти першої групи.

1. Піридинзалежні дегідрогенази – дегідрогенази, які містять нікотинамідні коферменти (НАД⁺ або НАДФ⁺) (нікотинамід, що входить до складу цих коферментів, належить до похідного піридину). Піридинзалежні дегідрогенази – це аеробні і  анаеробні дегідрогенази, що каталізують різноманітні реакції в нашому організмі.

Схематично реакції, що каталізують ці ферменти, мають такий вигляд:

SH₂ + НАД⁺→S + НАДН + Н⁺;   та   SH₂ + НАДФ⁺→S + НАДФН + Н⁺.

НАД-залежні дегідрогенази – це ферменти окисно-відновних реакцій процесів катаболізму, таких як гліколіз, цикл Кребса, β-окиснення жирних кислот, дихальний ланцюг мітохондрій тощо.

НАДФ-залежні дегідрогенази – це ферменти процесів відновного синтезу: синтезу жирних кислот, холестеролу, стероїдних гормонів, жовчних кислот тощо.

НАД і НАДФ – це коферментні фор­ми вітаміну РР-нікотинаміду. Будова НАД і НАДФ показана на  (рис. 12).

 

Рис. 12.  Будова НАД і НАДФ

 

Два нуклеотиди з'єднані залишками фосфорної кислоти, на відміну від міжнуклеотидного зв'язку в нуклеїнових кислотах (3^I,5^I-фосфодіефір­ного). Азотною основою в одному нуклеотиді є аденін, а в другому – ніко­тин­амід. НАДФ містить додаткову фосфатну групу при С2 рибозного залишку, зв'язаного з аденіном.

Нікотинаміддинуклеотидні дегідрогенази каталізують зворотні реакції, які в загальному вигляді можуть бути записані так:

НАД⁺ і НАДФ⁺ – це окиснені форми коферментів, в яких позитивний заряд несе атом азоту піридинового кільця нікотинаміду. НАДН і НАДФН – відновлені форми. Піридинове кільце нікотинаміду є тією частиною НАД (Ф), яка бере участь у переносі водню:

Як видно зі схеми, субстрат втрачає два атоми водню, тобто 2 протони, 2 електрони, але на кофермент переносяться 2 електрони і 1 протон, а другий протон переходить у середовище. Таким чином, кофермент отримує два відновні еквіваленти: один із них у формі атома водню приєднується до четвертого вуглецевого атома нікотинамідного кільця, а другий у формі електрона передається азоту цього кільця. В результаті відновлена форма коферменту втрачає позитивний заряд. Зазначимо, що, хоч у дійсності на кофермент переносяться гідрид-іон Н^- (протон і 2 електрони), НАД⁺ (НАДФ⁺) називають частіше акцептором електронів, а іноді й акцептором  водню.

Нікотинаміддинуклеотиди знаходяться у дисоційованій формі і зв'язуються з апоферментом тільки в ході реакції. Відновлені коферменти, відділившись від дегідрогеназ, знову окиснюються шляхом перенесення електронів до акцептора, зв'язаного з іншим ферментом. При цьому НАДН і НАДФН по-різному використовуються у метаболізмі.

Більша частина клітинних дегідрогеназ переносить водневі атоми від субстра­тів на НАД⁺, а відновлений НАДН передає електрони на дихальний ­ланцюг. Енергія, що звільняється при передачі електронів у дихальному ланцюгу, запасається у формі АТФ. Компоненти дихального ланцюга вмонтовані у внутрішній мембрані мітохондрій, і більшість НАД-залеж­них дегідрогеназ локалізовані у матриксі мітохондрій. НАДФ-залежні дегідрогенази знаходяться у цитоплазмі і мітохондріях, але НАДФН не від­дає електрони на дихальний ланцюг, а використовується як відновник у процесах синтезу багатьох сполук, зокрема жирних кислот, стероїдів.

Флавінзалежні дегідрогенази – дегідрогенази, які містять похідні вітаміну В₂ – ФАД, ФМН. У більшості дегідрогеназ  ці коферменти мають високу спорідненість до білкової частини і не відщеплюються від неї.

Схематично реакції, що каталізують ці ферменти, мають такий вигляд:

SH₂ + ФАД→S + ФАДН₂;   та      SH₂ + ФМН→S + ФМН-Н₂.

Флавінзалежні дегідрогенази можуть бути як анаеробними, так і аеробними дегідрогеназами.

До флавінзалежних дегідрогеназ належать: сукцинатдегідрогеназа (фермент циклу Кребса), НАДН-дегідрогеназа дихального ланцюга мітохондрій, гліцерол-3-фосфатдегідрогеназа (фермент окиснення гліцеролу), ацил-КоА-дегідрогеназа (фермент β-окиснення жирних кислот), оксидази L- та D-амінокислот, ксантиноксидаза (фермент катаболізму пуринових нуклеотидів), глюкозоксидаза (рослинний фермент, який використовується для визначення концентрації глюкози в крові).

За структурою ця група ферментів є складними білками, флаво­протеїнами.

 

R – залишок рибітолфосфату у ФМН, у ФАД він зв’язується з адені­ловою кислотою.

На противагу нікотинамідним коферментам, ФМН і ФАД міцно зв'язані з білком.

Флавінові дегідрогенази каталізують реакцію дегідрування субстратів. Приєднання двох атомів водню перетворює окиснену форму коферментів (ФМН чи ФАД) у відновлену (ФМНН₂ чи ФАДН₂) (рис.13). Активною частиною флавінових коферментів є ізоалоксазинова циклічна система. Обидва атоми водню (тобто 2 електрони і 2 протони) приєднуються до атомів азоту ізоалоксазинового кільця.

 

Рис. 13.  Перетворення окисненої форми ФМН чи ФАД у відновлену ФМНН₂ чи ФАДH₂

Таким чином, флавінові коферменти зв'язують обидва протони, тоді як нікотинамідні коферменти, як розглянуто вище, зв'язують 1 протон, а другий залишається у середовищі.

ФМН служить простетичною групою ферменту НАДН-дегідрогенази. Цей фермент, що знаходиться у внутрішній мембрані мітохондрій, окиснює НАДН:

Флавінові ферменти з простетичною групою ФАД каталізують відрив атомів водню від молекул субстратів, тобто є первинними ­дегідрогеназами:

        

До них відносяться сукцинатдегідрогеназа, яка каталізує окиснення бурштинової кислоти у фумарову, ацил-КоА-дегідрогеназа та ряд інших ферментів.

Кофермент Q (убіхінон, кофермент Q₁₀) – жиророзчинний кофермент, який знаходиться у мітохондріях еукаріотичних клітин. Ф. Крейн та К. Фолкерс у 1957-1958 встановили хімічну формулу цієї сполуки. Кількість ізопренових одиниць буває різною залежно від виду живих організмів. У клітинах організму людини знаходиться убіхінон тільки з 10 ізопреновими одиницями. В організмі людини цей кофермент синтезується з мевалонової кислоти та похідних фенілаланіну та тирозину (рис. 14).

Рис.14.  Хімічна формула убіхінону

Вміст убіхінону в тканинах залежить від інтенсивності енергетичного обміну. Найбільша кількість коферменту Q у серцевому  м’язі.

Убіхінон – це ліпофільна сполука, тому цей кофермент розчинений у ліпідній частині внутрішньої мембрани мітохондрій, і, оскільки він не зв’язаний з білком, може вільно рухатися в мембрані в різних напрямках.

Цей кофермент здатний приєднувати та віддавати протони й електрони. Схема окисно-відновної реакції за участі убіхінону наведена (рис. 15).

Рис.15. Реакція окиснення-відновлення убіхінону

 

  У дихальному ланцюзі коензим Q є колектором електронів від НАД- та ФАД(ФМН)-залежних дегідрогеназ.

Цитохроми – складні білки еммпротеїни, простетичною групою яких є гем. До складу гему цих білків входить метал зі змінною валентністю (переважно залізо, може бути також мідь). На сьогодні відомо приблизно 30 видів цитохромів.

Цитохроми вперше були описані Мак-Манном (Шотландія) у 1886 році й отримали назву «гістогематини», але їх роль залишалася невідомою. У 1925 році англійський біохімік Дейвід Кейлін почав активно вивчати ці білки.  Насамперед було з’ясовано, що цитохроми знаходяться у мембранах (мітохондріальних та ЕПР) всіх еукаріотичних клітин (рис. 16).

Рис. 16.  Структура гему у складі цитохрому b

 

Деякі цитохроми позначають цифровим індексом (наприклад, b₅), який може бути наданий тільки добре вивченим білкам.

У цитохромі с порфіринова площина, ковалентно зв’язана з білковою частиною через два залишки цистеїну. В цитохромах b та а емм ковалентно не зв’язаний з білком.

У цитохромах аа₃  замість протопорфірину міститься порфірин А, який має певні структурні особливості. Усі цитохроми мають різні фізико-хімічні властивості та величини стандартного окисно-відновного потенціалу (редокс-потенціалу), що забезпечує напрямок руху електронів від субстратів на кисень. Вони розташовані згідно з величинами їхніх окисно-відновних потенціалів наступним чином:  цитохром b, цитохром с1, цитохром с, цитохроми а, а3.

Цитохром аа3, або цитохромоксидаза, - це термінальный фермент, котрий переносить електрони безпосередньо  на кисень (аеробний фермент). Він складається з  6 субодиниць та, крім  гемінового заліза, містить іони міді.

Fe³⁺ ↔ Fe²⁺

У перенесенні електронів спочатку беруть участь іони заліза  цитохромів а й  а3, а далі -  іон міді цитохрому а3.

Cu²⁺ ↔ Cu⁺

Унікальна особливість цитохрому аа₃ полягає в тому, що цей комплекс безпосередньо реагує з молекулярним киснем. Тому його також називають цитохромоксидазою. Молекула О₂ зв'язується з атомом залі­за цитохрому а₃, після чого обидва атоми кисню приймають по два електрони і, взаємодіючи з протонами, що надходять із середовища, утворюють дві молекули води. Таким чином, цитохромоксидаза каталізує чотирьох­електронне відновлення молекули О₂ до води.

Залізо-сірчані білки (FeS – білки)

Залізосірчані білки (FeS-білки) - це білки з невеликою молекулярною масою (приблизно 10 кДа). Залізо, яке вони містять не входить до складу гему, а зв’язане з атомами сірки (рис. 17). Відомо, що вони беруть участь у транспорті електронів у дихальному ланцюзі, але детально механізм окиснення-відновлення атомів заліза невідомий.

Рис. 17. Схема комплексу заліза і сірки в молекулі

залізо-сірчаного білка дихального ланцюга

 

Ці білки локалізовані в ліпідному шарі мембран. Вони можуть зворотньо окиснюватися та відновлюватися, тобто переносити електрони. Подібні окисно-відновні системи стабільні лише у складі білків. Вони можуть мати від  2 до 6 іонів заліза, котрі утворюють  комплекси  різного складу з  неорганічним сульфідом і SH-групами залишків цистеїну білкових молекул.

 

Основні компоненти дихального ланцюга

  Мітохондрії – органели клітини, функціонування яких для будь-якої обізнаної людини чітко асоціюється з продукуванням енергії. Дійсно в матриксі мітохондрій локалізовані різноманітні ферменти, що необхідні для окиснення субстратів. Крім того, внутрішня мембрана мітохондрій містить систему білків-переносників електронів, які забезпечують термінальний етап окиснення субстратів і створюють умови для синтезу АТФ (рис. 18).

 

 

Рис. 18. Структура  мітохондрії

 

http://www.youtube.com/watch?v=-_8aYKcQZ_Q&feature=related

 

Рис. 19. Молекулярна організація ланцюга перенесення електронів

 

http://www.youtube.com/watch?v=StXlo1W3Gvg&feature=related

Саме така послідовність компонентів не є випадковою, а зумовлена величинами їх окисно-відновного потенціалу (Е_о). Ця константа кількісно характеризує здатність окисно-відновної пари, тобто здатність окисненої і відновленої форм певної сполуки зворотно віддавати електрон. Чим нижча (негативніша) величина ОВП пари, тим вища її можливість віддавати електрони, тобто окиснюватися. І навпаки, пара з більш високим (позитивним) значенням Е_о буде приймати електрони і відновлюватись (табл. 5). Таким чином, електрони переходять від однієї ОВ пари до іншої в напрямку більш позитивного Е_о. Таке перенесення елек­тронів супроводжується зменшенням вільної енергії. Для ОВ реакцій зміну стандартної вільної енергії визначають за рівнянням

де – зміна стандартної вільної енергії реакції;

n – кількість перенесених електронів (або атомів водню);

F – константа Фарадея (тепловий еквівалент роботи, рівний 95 кДж);

∆Е_о – різниця ОВ потенціалів між двома парами.

Чим більша різниця ∆Е_о двох окисно-відновних пар, тим більше виділяється вільної енергії при перенесенні електронів.

 

Таблиця 5. Окисно-відновні потенціали компонентів дихального ланцюга

Значення Е_о в послідовності від НАД⁺ до О₂ поступово зро­стає. При повному переході двох електронів від ОВ пари ­НАДН/НАД⁺ (Е_о=‑0,32 В) до ОВ пари Н₂О/¹/₂О₂ (Е_о =+0,82 В) зміна вільної енергії дорівнює 220 кДж (52,6 ккал). Кожний акт переходу електронів між ­проміжними компонентами дихального ланцюга супроводжу­ється виді­лен­­ням певної порції вільної енергії  (рис. 20).

 

Рис. 20.  Вивільнення енергії в ланцюгу біологічного окиснення

Таким чином, завдя­ки на­­яв­нос­ті в ланцюгу перенесення електронів від субстратів до О₂ великої кіль­кості проміжних переносників енергія виділяється порціями і може бути використана для синтезу декількох молекул АТФ. Синтез АТФ із АДФ і Фн у стандартних умовах потребує 34,5 кДж/моль (8,3 ккал/моль), а в умовах живої клітини – приблизно 50 кДж/моль (12 ккал/моль). Перепад енергії між НАДН/НАД⁺ і Н₂О / ¹/₂О₂ (220 кДж/моль) достатній для синтезу не менше 4 молекул АТФ. Але експериментальні дослідження показали, що синтезується максимум 3 молекули АТФ. Саме на 3 ділянках дихального ланцюга перенесення електронів від одного компонента до наступного супроводжується перепадом вільної енергії, достатнім для синтезу АТФ.

Усі учасники ланцюга перенесення електронів структурово об’єднані в чотири окисно-відновні системи – мультиферменті комплекси I – IV.

Процес окиснення починається з перенесення протонів і електронів з субстрату, що окиснюється, на  НАД+  або  ФАД. Це залежить від природи субстрату. Кожен із комплексів здатний каталізувати певну частину повної послідовності реакцій ланцюга (рис. 21).

Рис. 21. Структура дихального ланцюга

 

http://www.youtube.com/watch?v=3rO26W1xG9U&feature=related

Ці комплекси є частиною внутрішньої мембрани мітохондрій.

http://www.youtube.com/watch?v=eizHVQfeMwo&feature=related

 

Комплекс I – НАДН-дегідрогеназа – флавопротеїн, що містить ФМН. Цей фермент окиснює  НАДН і передає два атоми водню (2Н+ 2е-) на коензим Q. Комплекс також містить FeS-білки. Комплекс II – сукцинатдегідрогеназа – флавопротеїн, що містить ФАД. Цей фермент окиснює сукцинат і транспортує  два атоми водню (2Н+ 2е-) на коензим Q. У складі  комплекса присутні  FeS-белки. У матриксі мітохондрій також містяться й інші  ФАД-залежні  дегідрогенази, котрі окиснюють відповідні  субстрати (гліцерол-3-фосфат, ацил-КоА) та далі передають атоми  водню на коензим Q. Потоки атомів водню об’єднуються  на стадії утворення відновленого КоQН2 .

Коензим Q є останнім компонентом ланцюгу, котрий здатний транспортувати не тільки   протони, але й електрони (2Н+ 2е-). Далі протони (2Н+) переходять із внутрішньої поверхні мембрани мітохондрії на зовнішню, а електрони  (2е-) крізь ланцюг   цитохромів переносяться на кисень.

Комплекс III – убіхінондегідрогеназа – це ферментний комплекс, котрий включає цитохром b, FeS-білок і цитохром с1. Цей комплекс транспортує електрони 2е- від відновленого убіхінону КоQН2 на цитохром с (невеликий за розмірами водорозчинний білок, що міститься на зовнішній стороні  внутрішньої мембрани).

Комплекс IV – цитохром с-оксидаза – ферментний комплекс, що складається з цитохромів а й а3. Ці ферменти здійснюють останню стадію біологічного окиснення – відновлення електронами ( 2е- ) молекулярного кисню:

2е + 1/2О₂ = О^2-

Відновлений кисень  О2- реагує з вільними  протонами (2Н+ )   матриксу. В результаті реакції утворюється ендогенна, або метаболічна вода (рис. 22):

 

Рис. 22. Утворення метаболічної води в результаті реакції відновленого кисню О₂, який реагує з вільними протонами 2Н₊ матриксу

 

Напрямок перенесення протонів і електронів визначають окисно-відновні потенціали. Для забезпечення  спонтанного перенесення компоненти окисно-відновного ряду повинні розташовуватися згідно зі збільшенням величин потенціалів.

При проходженні по дихальному ланцюгу пари електронів вивільняється енергія, більша частина  котрої (60%) розсіюється у вигляді тепла, а інша акумулюється у макроергічниз зв’язках АТФ,  а саме поглинається в реакції синтезу АТФ-окисному  фосфорилюванні (рис. 23) .

 

Рис. 23. Вивільнення енергії при проходженні по дихальному ланцюгу пари електронів

 

Це фосфорилювання називається окисним, тому що енергія, що необхідна  для утворення макроергічного зв’язку, генерується у процесі окиснення, тобто руху протонів і електронів по мітохондріальному ланцюгу транспорту електронів

Перша така ділянка – це НАД ®ФМН, друга – цитохром b ®ци­то­­хром с₁, третя – цитохром аа₃ ® кисень. Ці ділянки називають пунк­тами фосфорилювання. Термін “пункт фосфорилювання” чи “ділянка фос­форилювання” не треба розуміти як конкретну стадію, на якій без­посередньо відбувається утворення АТФ. Ідеться про те, що потік електронів через ці три ділянки ланцюга якимось чином поєднаний з утворенням АТФ (перепад ОВП тут достатній для синтезу 1 моле­кули АТФ).

При окисненні субстратів ФАД-залежними дегідрогеназами (наприклад, сукцинату сукцинатдегідрогеназою) потік електронів від ФАДН₂ до кисню не проходить через перший пункт фосфорилювання. У цих випадках синтезується на 1 молекулу АТФ менше, тобто дві.

Механізм поєднання перенесення електронів і

окиснювального фосфорилювання

 

Синтез АТФ із АДФ і Фн за рахунок енергії, що звільнюється при перенесенні електронів по дихальному ланцюгу, називається окиснювальним фосфорилюванням (ОФ). Існує декілька доказів поєднання цих процесів. По-перше, окиснення НАДН чи ФАДН₂ у мітохондріях дійсно су­проводжується одночасним синтезом АТФ. По-друге, при наявності інгібіторів дихального ланцюга утворення АТФ зменшується. По-третє, відкриті хімічні речовини, які роз'єднують процеси переносу електронів і синтезу АТФ, не порушуючи перенесенні електронів по дихальному ланцюгу.

Тканинне дихання й ОФ поєднані не тільки енергетично, а і просторово на внутрішній мембрані мітохондрій. У ній локалізовані компоненти дихального ланцюга і ферменти, які каталізують реакцію синтезу АТФ. Через зовнішню мембрану мітохондрій легко проникають майже всі молекули й іони невеликих розмірів, тоді як внутрішня мембрана для більшості іонів невеликого розміру є непроникною. У ній є спеціальні транспортні системи, які переносять із цитоплазми в матрикс мітохондрій піруват та інше клітинне паливо, а також АДФ і неорганічний фосфат, а з мітохондрій у цитоплазму – АТФ. Матрикс містить піруватдегідрогеназну систему, ферменти циклу лимонної кислоти (циклу Кребса), ферменти окиснення жирних кислот тощо. Саме НАД- та ФАД-залежні ­дегідрогенази цих метаболічних шляхів переносять атоми водню на ­дихальний ланцюг. Компоненти дихального ланцюга утворюють у внутрішній мембрані високоупорядкований ансамбль. Точна локалізація всіх компонентів поки що не вивчена, але встановлено, що деякі білки розміщені на одному боці внутрішньої мембрани, а інші – на протилежному. Крім того, деякі білки дихального ланцюга пронизують мембрану наскрізь. Фермент, який каталізує синтез АТФ (АТФ-синтаза або ­Н⁺‑АТФаза), складається з двох компонентів: F_о і F₁ (рис.24).

 

Рис. 24. Схема окисного фосфорилювання за хеміосмотичною теорією

 

http://www.youtube.com/watch?v=YndC0gS3t6M&feature=related

Компонент F₁ нагадує шапочку гриба і повернений у бік матрикса мітохондрій. За допомогою ніжки він прикріплений до компонента F_o, який фіксується у мембрані й пронизує її наскрізь.

Існують три основні гіпотези про механізм поєднання (спряження) дихання й ОФ: хімічна, хеміосмотична і конформаційна. Згідно з хімічною гіпотезою, енергія, що виділяється при перенесенні електронів по дихальному ланцюгу, використовується для утворення високоенергетичного проміжного комплексу. Далі цей проміжний продукт розщеплюється і передає енергію на утворення АТФ. Але всі спроби відкрити проміжний ­висо­коенергетичний комплекс не дали результату.

Гіпотеза конформаційного поєднання припускає, що виділення енергії при транспорті електронів зумовлює зміни конформації білкових компонентів внутрішньої мембрани мітохондрій. Зміни конформації передаються на АТФ-синтазу, що призводить до її активації.

 

Хеміосмотична теорія Мітчелла (теорія окисного фосфорилювання)

П. Мітчелл

 

Пояснення механізмів спряження роботи дихального ланцюга та синтезу АТФ було запропоноване англійським біохіміком Пітером Мітчеллом у 1961 році, яке потім знайшло експериментальне підтвердження у роботах багатьох дослідників. За винайдення механізмів окисного фосфорилювання П. Мітчелл у 1978 році отримав Нобелівську премії в галузі хімії («За внесок у розуміння процесу перенесення біологічної енергії, який зроблений завдяки створенню хеміосмотичної теорії»).

Основні постулати теорії Мітчелла:

1)    внутрішня мембрана мітохондрій непроникна для іонів та малих молекул (за винятком молекул води);

2)    дихальний ланцюг працює як «помпа», що викачує протони з матриксу в міжмембранний простір – рух 2 електронів від субстрату на кисень призводить до перенесення 8-10 Н⁺ (протони транспортуються через I, III та IV комплекси) через мембрану;

3)    робота дихального ланцюга створює електрохімічний градієнт протонів (∆μН⁺), оскільки вони вільно через внутрішню мітохондріальну мембрану повернутися в матрикс не можуть і будуть накопичуватись у міжмембранному просторі; ∆μН⁺ - це проміжна форма зберігання енергії окиснення субстратів;

4)    енергію протонного градієнта використовує Н⁺-АТФ- синтаза (V комплекс) для синтезу АТФ, коли через одну з її субодиниць протони повертаються в матрикс;

5)    існують сполуки - роз’єднувачі окисного фосфорилювання, які порушують електрохімічний градієнт протонів і знижують ефективність роботи Н⁺-АТФ-синтази.

На рис. 25 наведена структура протонної АТФ-синтази (Н⁺-АТФ-синтази, Н⁺-АТФ-аза), яка безпосередньо використовує енергію протонного градієнта, що був створений дихальним ланцюгом, для синтезу АТФ.

 

Рис. 25. Структура Н⁺-АТФ-синтази

 

Протонна АТФ-синтаза – це олігомерний білок, який вмонтований у внутрішню мембрану мітохондрії і за будовою нагадує гриб. Вона містить дві субодиниці:

Fo – протонний канал (о - від «олігоміцин»); лише через цей канал протони можуть повернутися в матрикс;

F₁ – фермент, який використовує енергію, що вивільняється при транспорті протонів через Fo  для синтезу АТФ з АДФ та Фн.

П. Мітчелл у своїй теорії теоретично віддав функцію спряження окиснення та фосфорилювання саме Н⁺-АТФ-азі (рис. 26).

Рис. 26. Спряження роботи дихального ланцюга  із синтезом АТФ (за теорією П.Мітчелла)

 

На сьогодні відомо, що при транспорті протонів через Fo-субодиницю відбуваються конфірмаційні зміни в активному центрі F₁-субодиниці, які призводять до її активації і відповідно до синтезу АТФ та її вивільнення. Молекули АТФ, що синтезуються, транспортуються у цитозоль за допомогою транслокази.

Для синтезу молекули АТФ, її вивільнення та транспорту у цитозоль потрібна енергія 4 протонів (40% цієї енергії іде на синтез АТФ, 60% виділяється у вигляді тепла). Кількість молекул неорганічного фосфату, яке перейшло у зв’язану форму (тобто у АТФ) у перерахунку на один атом кисню має назву коефіцієнт окисного фосфорилювання і позначається Р/O (коефіцієнт фосфорилювання).

Коефіцієнт Р/O чисельно дорівнює кількості молекул АТФ, що синтезувалися в результаті транспорту 2 ē на один атом кисню. Тому для субстратів, що окислюються під дією НАД-залежних дегідрогеназ Р/O=3 (наприклад, для пірувату, α-кетоглутарату, ізоцитрату, малату). Для субстратів, які окислюються за допомогою ФАД-залежних дегідрогеназ, цей коефіцієнт дорівнює 2 (наприклад, для сукцинату, ацил-КоА, гліцерил-3-фосфату).

Згідно з цією теорі­єю, перенесення електронів по дихальному ланцюгу супроводжується викачуванням протонів із матриксу через внутрішню мембрану у водне середовище міжмембранного простору (рис. 27).

 

Рис. 27. Схема орієнтованого розташування оксидно-відновних петель, які забезпечують

перекачування протонів із матриксу в міжмембранний простір в дихальному ланцюгу

 

Припускають, що асиметрично розміщені в мембрані компоненти дихального ланцюга утво­­­рюють три петлі, які пере­носять через мембрану протони, тобто служать протонними пом­­пами. З кожною парою елек­тронів, що передаються від субстрату до кисню, ці три петлі транспортують із матриксу мітохондрій шість протонів (за новими даними, не менше 9). Таким чином, енергія, яка виділяється при перенесенні електронів, затрача­ється на перекачування іонів Н⁺ проти градієнта концентрації. Внаслідок викачування іонів Н⁺ із матриксу внутріш­ній бік внутрішньої мембрани мітохондрій стає електронегативним, а зовнішній – елек­тропозитивним, тобто вини­кає градієнт концентрації іонів водню: їх менше в матриксі й більше – в зовнішній водній фазі. Сумарний електрохімічний протонний потенціал позначається ∆μН⁺. Він складається із 2-х компонентів: ∆μН=∆рН і ∆V (рис. 28).

Рис. 28.  Дві складові електрохімічного протонного градієнта, що виникають

на внутрішній мітохондріальній мембрані

 

Внутрішня мембрана мітохондрій непроникна для іонів Н⁺, а також іонів ОН^-, К⁺, Nа⁺, СI^-, але мембранний білок F_o АТФази утворює канал, по якому іони Н⁺ повертаються в матрикс за градієнтом концентрації, вільна енергія, яка при цьому виділяється, використовується F₁-компонентом АТФази для синтезу АТФ з АДФ і Фн.

http://www.youtube.com/watch?v=UL3M06aaMHM&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=StXlo1W3Gvg&feature=related

Таким чином, згідно з хемі­осмотичною ­теорією, перенесення електронів по дихальному ланцюгу створює градієнт концентраціїї іонів Н⁺, який служить рушійною силою синтезу АТФ. Специфічний білок-переносник, аденіннуклеотид-транслоказа переносить новосинтезований АТФ із матриксу в цитоплазму в обмін на АДФ. Ця сама транспортна система переносить у матрикс мітохондрій фосфат.

Але найпереконливішим підтвердженням гіпотези Мітчела став експеримент американського науковця Рекера: так званий дослід із “химерою”. Назва “химера” запозичена зі старогрецької міфології про чудовисько з пащею лева, тулубом кози і хвостом дракона.

За аналогією Рекер зібрав композицію з трьох різних частинок. Спочатку він сконструював мембрану з фосфоліпідів сої, в яку вмонтував бактеріальний білок родопсин, що має здатність у відповідь на ос­вітлення переносити протони проти градієнта концентрації (протонна помпа). Третім компонентом мембранної композиції був фермент АТФ-синтетаза, одержаний із міокарда бика. Таким чином, композиція мала всі компоненти, необхідні для утворення АТФ. І справді, під впливом пучка світла "химера" ожила, вона почала виробляти АТФ, незважаючи на всю неодно­рідність складових частин. Із цього часу хеміосмотична гіпотеза перетворилася на струнку теорію, за яку Мітчелу в 1978 році було присуджено Нобелівську ­премію.

Шляхи використання АТФ в організмі:

Енергія гідролізу АТФ використовується клітинами для виконання всіх відомих ендергонічних процесів (рис. 29):

 1) реакцій синтезу вуглеводів, ліпідів, білків, нуклеїнових кислот;

 2) механічної роботи, наприклад скорочення м'язів, руху хромосом при мітозі;

 3) активного перенесення речовин через мембрани проти градієнта концентрації;

 4) забезпечення точної передачі генетичної інформації;

 5) електричної роботи – проведення нервового імпульсу.

Рис. 29.  Шляхи використання енергії АТФ

 

Отже, АТФ виступає як переносник хімічної енергії, який зв'язує клітинні процеси, що супроводжуються виділенням енергії, з тими головними видами клітинної активності, в яких енергія споживається.

 

Регуляція тканинного дихання та окисного фосфорилювання

Швидкість окиснення субстратів клітинного палива і транспорту електронів до кисню по дихальному ланцюгу залежить від наявності АДФ і Фн та виражається рівнянням:

НАДН + Н⁺ + 1/2 О₂ + 3 АДФ + 3 Фн ® НАД⁺ + 3 АТФ +4 Н₂О

Концентрація АДФ у клітині значно менша, ніж концентрація неорганічного фосфату, тому рівень АДФ є основним у регуляторному механізмі. Якщо в клітині інтенсивно здійснюються процеси з використанням енергії АТФ, то це призводить до зниження концентрації АТФ і зростання концентрації АДФ, а наявність АДФ автоматично підвищує швидкість перенесення електронів та поєднаного з ним окиснювального фосфорилювання. Після вичерпання запасів АДФ швидкість споживання мітохондріями кисню і фосфорилювання АДФ неодмінно зменшуються, повертаючись до рівня, що відповідає стану спокою. Залежність дихання мітохондрій від концентрації АДФ називають дихальним контролем. Таким чином, тісне поєднання дихання з фосфорилюванням у мітохондріях створює умови, коли швидкість окиснення клітинного палива регулю­ється енергетичними потребами клітини. Величина відношення ­АТФ/АДФ•Фн служить показником енергетичного стану клітин.

Запропонований ще один показник – енергетичний заряд, який відображає вміст високоенергетичних аденілових нуклеотидів у загальному їх пулі:

АТФ + 1/2 АДФ

енергетичний заряд =    —————————

АТФ + АДФ + АМФ

Більшість клітин підтримують значення енергетичного заряду у вузькому інтервалі близько 0,8-0,9. АТФ, АДФ і АМФ відіграють роль позитивних або негативних алостеричних ефекторів регуляторних ферментів метаболізму вуглеводів, жирів, амінокислот. При високій концентрації АТФ і відповідно низьких концентраціях АДФ і АМФ процеси катабо­лізму й окиснювального фосфорилювання мінімальні. З іншого боку, підвищення рівня АДФ і АМФ є сигналом, який збільшує швидкість катаболізму і зменшує швидкість анаболізму.

При збільшенні  в клітині споживання АТФ поідвищується швидкість надходження  АДФ в мітохондрії, що означає зростання швидкості синтезу АТФ. Це призводить до збільшення швидкості транспорту протонів: зростає швидкість дихання. Така кореляція, а саме пришвидшення окисного фосфорилювання та дихання при підвищенні концентрації АДФ називається дихальним контролем. 

 

Дихальний  контроль – це співвідношення АТФ/АДФ:  При його зменшенні підвищується інтенсивність дихання. Процес синтезу АТФ залежить від енергетичного статусу клітини, який, у свою чергу знаходить своє вираження у кількісному співвідношенні АТФ/АДФ. При зростанні потреб клітини в енергії підвищується концентрація АДФ і значення цього співвідношеня знижується. Це супроводжується активацією тканинного дихання і, відповідно, окисного фосфорилювання.

Процес залежності дихання клітин від вмісту аденілових нуклеотидів був вивчений in vitro. Результати дослідження показали, що за наявності в середовищі всіх компонентів, за винятком АДФ, поглинання кисню клітиною не відбувається. Внесення в інкубаційну суміш АДФ стимулює дихання, активність якого знижується при зростанні концентрації АТФ. Швидкість дихання знижується до нуля, коли вся АДФ перетворюється в АТФ. Тому залежність роботи дихального ланцюга від  співвідношення АТФ/АДФ отримала назву дихальний контроль. Механізм дихального контролю відрізняється високою точністю і швидко реагує навіть на невеликі зміни концентрацій АТФ та АДФ. Незначне підвищення концентрації АДФ призводить до активації дихання та фосфорилювання.  Зниження синтезу АТФ призводить до розвитку гіпоенергетичного стану в організмі.

Синтез АТФ знижується при:

1)    гіпоксії;

2)    голодуванні, дефіциті деяких вітамінів (В₁, В₂, РР) та мінералів (Fe, Cu);

3)    наявності інгібіторів дихального ланцюга та інгібіторів окисного фосфорилювання;

4)    наявності роз’єднувачів окиснення та фосфорилювання.

 

Інгібітори та роз’єднувачі окисного фосфорилювання

 

  Робота протонної АТФ-синтази може бути порушена за наявності в клітині сполук – роз’єднувачів окисного фосфорилювання. Так, наприклад, олігоміцин пригнічує роботу Fo субодиниці і, таким чином, робить неможливим використання енергії протонного градієнта для синтезу АТФ.

Роз»єднувачі – це сполуки ліпофільні, легко дифундують через внутрішню мембрану мітохондрій, можуть зв’язувати протони та переносити їх у матрикс за градієнтом концентрацій Н⁺ (тому вони належать до сполук протонофорів).

У разі наявності в клітині роз’єднувача окиснення субстратів відбувається дуже активно, дихальний ланцюг мітохондрій працює і намагається створити електрохімічний градієнт протонів, але цього не відбувається. Пояснення в тому, що молекули роз’єднувача захоплюють протони з міжмембранного простору і транспортують їх у матрикс. За таких умов окиснення субстратів не приводить до створення протонного градієнта і, відповідно, до синтезу АТФ. Енергія окиснення перетворюється в теплову енергію, тобто коефіцієнт окисного фосфорилювання знижується і спостерігається виділення тепла (пірогенна дія).

Прикладом роз’єднувача служить 2,4-динітрофенол. Механізм токсичної дії 2,4-динітрофенолу полягає у блокуванні окиснювального фосфорилювання, що викликає утворення енергії шляхом гліколізу з використанням значної кількості кисню. Оскільки вказана енергія не накопичується в макроенергічних сполуках фосфору, вона виділяється у вигляді тепла, викликаючи гіпертермію.

Крім 2,4-динітрофенолу до синтетичних роз’єднувачів потрібно віднести деякі похідні вітаміну К, анестетики, антибіотики валіноміцин та граміцидин, ацетилсаліцилову кислоту, гербіциди. До природних роз’єднувачів належать продукти перикисного окиснення ліпідів, довголанцюгові жирні кислоти, великі дози териоїдних гормонів.

Саме тому в людей, які хворіють на гіпертиреоз спостерігається підвищення температури тіла, активне окиснення субстратів і тому, незважаючи на підвищений апетит, вони втрачають вагу. Відомо також, що в разі купання у холодній воді в організмі людей-моржів спостерігається підсилена секреція тиреоїдних гормонів, що, у свою чергу, дозволяє підсилити термопродукцію і покращити терморегуляцію.

Прикладом природного роз’єднання також може бути робота білка термогеніну, який знаходиться у внутрішній мембрані мітохондрій бурої жирової тканини.

Цей білок є протонним каналом, через який транспортуються протони у матрикс і тому робота дихального ланцюга не може створити необхідний електрохімічний градієнт протонів для синтезу АТФ (рис. 30). Тому активне окиснення субстратів бурою жировою тканиною призводить до генерації теплової енергії.

 

 

Рис. 30. Механізм дії природного роз’єднувача термогеніну

Велика кількість речовин, у тому числі й лікарські засоби, можуть змінювати енергетику клітин, впливаючи на утворення енергії в ході перетворення поживних речовин і на рівень окислювального фосфорилювання (утворення АТФ). Їх можна розділити на активатори й інгібітори енергетичного обміну.

До активаторів відносяться: глюкоза, фруктоза, амінокислоти, кислоти циклу Кребса (лимонна, яблучна, янтарна), різні поживні суміші, наприклад препарати гідролізатів білків (гідролізат казеїну). Вони поліпшують енергетичний обмін у тканинах організму, залучаючись до окиснювально-відновних реакцій мітохондрій, і тому знайшли застосування в медичній практиці.

Інгібітори знайшли застосування в наукових дослідженнях під час вивчення окремих етапів обміну речовин та енергії.За механізмом дії речовини, які впливають на енергетичний обмін у клітинах, можна поділити на чотири групи.

Інгібітори дегідрогеназ - гальмують процес дегідрування окремих субстратів, знижуючи надходження атомів водню (протонів і електронів) у дихальний ланцюг. До них належать, наприклад, протитуберкульозні препарати фтивазид, ізоніазид (ГІНК) та інші, які є похідними ізонікотинової кислоти:

Препарати ізоніазид, фтивазид, салюзид та інші, як похідні ізонікотинової кислоти, є структурно подібними до аміду нікотинової кислоти й тому виступають конкурентними інгібіторами нікотинамідних дегідрогеназ (НАД-залежних), які містять у складі своїх коферментів амід нікотинової кислоти. Тому має місце їх конкурентне заміщення, яке призводить до пригнічення дії НАД-залежних дегідрогеназ, і механізм клітинного дихання в мікроорганізмів пригнічується, що веде до їх загибелі.

Малонова кислота (Н00С-СН₂-С00Н) - нормальний проміжний продукт обміну - є конкурентним інгібітором ФАД-залежної дегідрогенази (сукцинатдегідрогенази), яка відщеплює атоми водню від янтарної кислоти (Н00С-СН₂-СН₂-С00Н) - одного із субстратів циклу Кребса, у зв'язку з чим швидкість цього циклу знижується. Суміш інгібіторів НАД- і ФАД-залежних дегідрогеназ може значно пригнічувати тканинне дихання, не впливаючи на утворення протонного потенціалу, оскільки надходження іонів Н⁺ з матриксу назовні забезпечує убіхінон.

Інгібітори тканинного дихання на етапах фосфорилювання блокують одну з трьох ланок утворення АТФ, перепиняючи потік електронів на певних ділянках дихального ланцюга. Перша група препаратів (снотворні препарати барбітурового ряду - амітал та ін., прогестерон - жіночий статевий гормон) припиняє надходження водню на дихальний ланцюг від субстратів, які окиснюються внаслідок дії піридинзалежних дегідрогеназ, але не заважають використанню субстратів, які окиснюються через ФАД (наприклад, янтарної кислоти).

На рівні другої ланки дихальний ланцюг блокується протигрибковим антибіотиком антиміцином А (блокується перенос електронів між цитохромами b і с,). Дихання можливе тільки в разі надходження електронів і протонів на ділянку ланцюга після блоку. Наприклад, аскорбінова кислота (вітамін C) може окиснюватися в цитохромом с. Тому в її присутності дихання в мітохондріях продовжується, незважаючи на те, що дихальний ланцюг гальмується антиміцином А.

Третя група інгібіторів дихання (ціаніди (NaCN, KCN), азиди (NaN3), оксид вуглецю (II) та ін.) блокують цитохромоксидазу й унеможливлюють сам процес дихання. Ці речовини викликають кисневе голодування для дихального ланцюга мітохондрій, хоча кисень наявний у великій кількості (блокується процес перекидання електронів на кисень). Тому вимикається утворення протонного потенціалу й поєднане з ним фосфорилювання - припиняється життєдіяльність клітин. Перелічені інгібітори цитохромоксидази є найсильнішими отрутами, отруєння якими викликає швидку загибель організму.

Іонофори (переносники іонів). До них належать речовини, здатні зв'язувати певні іони (К+, та ін.) і переносити їх через мембрани, порушуючи їхній ізолюючий бар'єр. Від роз'єднуючих агентів вони відрізняються тим, що переносять через мембрану не іони Н+, а будь-які інші катіони. Наприклад, токсичний антибіотик валіноміцин утворює жиророзчинний комплекс з іонами К+, який легко проходить через внутрішню мембрану мітохондрій, тоді як за відсутності валіноміцину іони К+ проникають крізь неї з великими труднощами.

 Антибіотики-іонофори вирівнюють іонні градієнти на будь-якій, а не лише на мітохондріальній мембрані, тому, припиняючи вироблення енергії й вирівнюючи іонні градієнти між внутрішнім і позаклітинним середовищем, вони призводять до швидкої загибелі мікроорганізмів. Іонофор граміцидин є антибіотиком з бактеріостатичною й бактерицидною дією. Він полегшує проникнення крізь мембрану К+ і Na+, причому діє на клітини як мікроорганізмів, так і хворого, тому його необхідно застосовувати тільки у вигляді мазей і паст для лікування гнійних ран, остеомієлітів та у вигляді промивань і полоскань при запальних захворюваннях вуха, горла тощо.

Кількісне визначення  піровиноградної  кислоти в сечі за допомогою  колориметричного  методу.

Піровиноградна кислота (ПВК) – один із центральних метаболітів вуглеводного обміну. Вона утворюється внаслідок аеробного окиснення глюкози, перетворення деяких амінокислот, декарбоксилюванні щавлевооцтової кислоти. Значна кількість ПВК використовується в процесі глюконеогенезу, синтезу кето- та амінокислот. У разі анаеробного та аеробного розщеплення вуглеводів ПВК може перетворюватися трьома шляхами:

-     відновлення з утворенням молочної кислоти (анаеробне перетворення вуглеводів);

-     окиснювальне декарбоксилювання з утворенням ацетил-КоА, який вступає в цикл Кребса. Реакцію каталізує піруватдегідрогеназний комплекс, коферментами якого є: тіамінпірофосфат, ліпоєва кислота, коензим А-SН, НАД, ФАД (аеробне перетворення вуглеводів);

-     декарбоксилювання з утворенням оцтового альдегіду, який потім відновлюється з утворенням етилового спирту (спиртове бродіння).

Норма ПВК (за динітрофенілгідразиновим методом) у дорослих становить: у крові – 34,1-102,2 мкмоль/л; у сечі – 45-111 мкмоль/л, 113,7-283,9 мкмоль/добу (10-25 мг/добу). 

Принцип  методу. Піровиноградна кислота, взаємодіючи з 2,4‑динітрофенілгідразином у лужному середовищі, утворює 2,4‑динітрофенілгідразон піровиноградної кислоти коричнево- червоного забарвлення, інтенсивність якого пропорційна концентрації ПВК і визначається фотометрично.

Клініко-діагностичне значення. Підвищена концентрація ПВК у крові і сечі спостерігається під час інтенсивної фізичної праці, при тетанії, епілепсії, В₁-вітамінній недостатності, цукровому діабеті, серцевій декомпенсації, гестозі, тяжких захворюваннях печінки, уремії, отруєннях, гіпоксіях різного походження. У спинномозковій рідині рівень ПВК підвищується при травмах черепа, запальних процесах (менінгіт, абсцес мозку).

 

Дослідження сукцинатдегідрогенази  м’язів.

Сукцинатдегідрогеназа  (СДГ) м’язів  – це залізофлавопротеїн, що каталізує окиснення (дегідрування) бурштинової кислоти у фумарову. Коферментом сукцинатдегідрогенази служить флавінаденіндинуклеотид (ФАД). Активність ферменту залежить від наявності в ньому вільних сульфгідрильних груп та атомів заліза.

Як джерело ферменту використовується відмита м’язова тканина. Дію цього ферменту можна виявити при додаванні до бурштинової кислоти метиленової синьки або 2,6-дихлорфеноліндофенолу (синього кольору), які виступають в якості акцептора водню і, відновлюючись, перетворюються у безбарвну форму:

Принцип методу. Метод ґрунтується на виявленні знебарвлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу в реакції з бурштиновою кислотою при наявності м’язів як джерела ферменту сукцинатдегідрогенази. Конкурентне гальмування активності цього ферменту викликає малонова кислота НООС-СН₂-СООН, яка є структурним аналогом бурштинової кислоти. Час знебарвлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу при наявності бурштинової  кислоти характеризує активність сукцинатдегідрогенази.

 

Відновлення цитохрому С.

Цитохроми – це окисно-відновні ферменти, які беруть участь у транспортуванні електронів у процесах клітинного дихання. Вони відносяться до залізопорфіринових ферментів, простетична група яких містить різні похідні гему. Атом заліза в гемі може міняти валентність, приєднуючи або віддаючи електрон:

+е відновлення

Fе³⁺ ============ Fе²⁺

-е   окиснення

В мітохондріях клітин локалізовані цитохроми  в, с₁, с, а, а₃.

Принцип методу грунтується на реакції відновлення цитохрому с за допомогою водню, що виділяється в реакції між металічним цинком та хлоридною кислотою. Після відновлення червоний колір цитохрому с блідне.