Медицина

ПРЕДМЕТ, ЗАДАЧІ, ОСНОВНІ ЕТАПИ ТА СУЧАСНІ НАПРЯМИ  РОЗВИТКУ БІОХІМІЇ. МЕТА І МЕТОДИ ПРОВЕДЕННЯ БІОХІМІЧНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ, ЇХ КЛІНІКО-ДІАГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ. БУДОВА І ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ БІЛКІВ-ФЕРМЕНТІВ. КОФАКТОРИ. МЕХАНІЗМ ДІЇ ФЕРМЕНТІВ, КІНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛІЗУ. КАТАЛІТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ. РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ

ПРЕДМЕТ, ЗАДАЧІ, ОСНОВНІ ЕТАПИ ТА СУЧАСНІ НАПРЯМИ  РОЗВИТКУ БІОХІМІЇ. МЕТА І МЕТОДИ ПРОВЕДЕННЯ БІОХІМІЧНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ, ЇХ КЛІНІКО-ДІАГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ. БУДОВА І ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ БІЛКІВ-ФЕРМЕНТІВ. КОФАКТОРИ. МЕХАНІЗМ ДІЇ ФЕРМЕНТІВ, КІНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛІЗУ. КАТАЛІТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ. РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ.

ФЕРМЕНТАТИВНІ ПРОЦЕСИ ЗА ТИПОМ РЕАКЦІЙ ОСНОВНИХ КЛАСІВ ФЕРМЕНТІВ. ОДИНИЦІ ВИМІРУ КАТАЛІТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ. МЕХАНІЗМ ВИНИКНЕННЯ ЕНЗИМОПАТІЙ. ЕНЗИМОДІАГНОСТИКА, ЕНЗИМОТЕРАПІЯ

Біологічна хімія – це наука про хімію життя. Суть життя не піддається простому визначенню. Протягом багатьох століть учені вкладали в це слово різний зміст. Відомі достовірно тільки характерні риси життя: ріст, рух, обмін речовин, розмноження та пристосування. Але кожну з цих рис, окремо взяту, можна спостерігати і в неживій природі. Наприклад, кристалики солей ростуть, розмножуються, але вони не належать до живих. Біохімія вивчає хімічні та фізико-хімічні прояви життя. А що таке наука? Під цим терміном розуміють діяльність людини, спрямовану на одержанння достовірних знань про зовнішній світ. Першоджерелами будь-яких наукових відомостей є окремо проведені спостереження або експериментальні дослідження.

Щодо біологічної хімії як науки про життя, то результати її досліджень переконують, що всі живі системи підпорядковуються фізичним та хімічним законам. Це означає, що такі риси живого організму, як рух, розмноження, обмін речовин та інші явища життя, значною мірою можна пояснити на основі понять хімії та фізичної хімії. Найбільш загальною рисою живого організму є його зв’язок із навколишнім середовищем, поза цим зв’язком життя не існує. Інакше кажучи, живі організми належать до відкритих термодинамічних систем і підпорядковуються основним їх законам. Організм одержує з навколишнього середовища потрібні йому речовини і, перетворюючи їх, використовує утворені компоненти для побудови тканин власного тіла. З продуктами харчування надходить енергія, що комульована в хімічних зв’язках і використовується для всіх потреб організму. Відпрацьовані (ентроповані) кінцеві продукти обміну виводяться через органи виділення. У процесі еволюції в живих системах виробились спеціальні біологічні каталізатори – ферменти, які здійснюють перетворення всіх хімічних речовин, що забезпечує життєдіяльність організму. Кількість ферментів та їх дія регулюються на генетичному рівні й зумовлюються практичними потребами організму. Кожна біохі­мічна реакція в процесі життєдіяльності перебуває під контролем певного гена. Зміна гена (мутація) супроводжується зміною або нестачею відпо­відного ферменту і випаданням певних метаболічних реакцій. Носієм генетичної інформації, як це встановила біохімія, є ДНК, в окремих ділянках якої записана за допомогою чотирьох різних нуклеотидів інформація про структуру ферментів та інших білків.

Важлива роль у функціонуванні ферментів належить і вітамінам, які є коферментами або попередниками коферментів, тобто необхідними для роботи ферментів компонентами. З іншого боку, функція ферментів координується гормональною та нервовою системами.

Метою біохімії, в тому числі й медичної хімії, є вивчення хімічного складу, хімічної структури і властивостей складових компонентів тканин та органів, перетворення речовин і енергії в здоровому та хворому орга­нізмах. Протягом останніх 20-30 років біохімія розкрила механізми дії ферментів, енергозабезпечення, генетичної спадковості та спадкових захворювань, що сприяло віднесенню її в ряд фундаментальних медико-біологічних наук. В.І. Вернадський, перший президент АН України, вважає, що біохімія – це наука про структуру і поведінку живої речовини.

Встановлено, що всі живі організми, незалежно від ступеня складності й розвитку, є відкритими термодинамічними системами, що обмінюються з навколишнім середовищем енергією і речовинами. Призупинення цього обміну несумісне з життям. Речовини, що потрапляють із навколишнього середовища, використовуються організмом як джерело енергії і будівельний матеріал для побудови власних компонентів. При цьому використовуються як неорганічні низькомолекулярні (О2, СО2, Н2О), так і органічні високомолекулярні сполуки. Останні в процесі засвоєння спершу розкладаються до простих мономерів (амінокислоти, жирні кислоти, гліцерин, мононуклеотиди тощо), з яких синтезуються біополімери, специфічні для даного організму (власні білки, нуклеїнові кислоти, ліпіди тощо).

Спрямованість хімічних перетворень речовин диктується практичними потребами організму і регулюється за допомогою ферментів і гормонів. Дія їх здійснюється на різних рівнях організації (молекулярному, надмолекулярному, клітинному, на рівні тканин, органів і систем). На утворення власних сполук організм затрачає енергію, яка надходить з продуктами харчування, видозмінюючи й адаптуючи її до форм, зручних для використання в хімічних перетвореннях.

Енергетичні затрати підпорядковуються І і ІІ принципам термодинаміки. Але, на відміну від неживої природи, в організмі ніколи не настає термодинамічна рівновага, а тільки підтримується стаціонарний стан, тобто підтримуються сталими основні показники в тканинах (t°, рН, [С] іонів тощо). Здатність організму підтримувати на постійному рівні показники внутрішнього середовища Клод Бернар назвав гомеостазом. Організм безперервно підтримує свій гомеостаз при участі зовнішнього середовища за допомогою регуляторних систем. Таким чином, постійний обмін речовин, енергії та інформації лежить в основі всіх проявів життя. Всім живим організмам притаманна здатність самовідтворюватись, що завдяки генетичній пам’яті відбувається з високою точністю. Остання лежить в основі збереження видів і класів живих істот.

Біохімію можна розглядати як частину біології, але разом із тим вона є самостійною наукою, що відрізняється як від біології, так і від хімії. Виникла біохімія на межі ХІХ-ХХ ст. Термін «біохімія» був введений у науку в 1903 р. К. Нейбергом.

Поява нової науки, як і виникнення будь-якого явища в природі чи суспільстві, пов’язані з попереднім розвитком останніх. До появи біохімії вже існували такі науки, як хімія, фізика, органічна хімія. Останню вважали хімією природних сполук живого організму. Органічна хімія спочатку була розділом фізіології, тому її називали ще хімічною фізіологією. Але завдяки успіхам синтезу одержано багато речовин, яких немає в організмі, тому органічна хімія стала вивчати хімію вуглецевих сполук. В останні десятиліття від органічної хімії відокремилась біоорганічна хімія, яка вивчає хімічну структуру, властивості та механізми утворення зв’язків у сполуках, що містяться в живих організмах.

Але основна роль у вивченні хімічних процесів в організмі належить біологічній хімії. Виникнення біологічної хімії як науки знаменує собою значний поступ вперед у вивченні живої природи. Він зумовлений тим, що в кінці ХІХ ст. завдяки розвитку техніки, фізики, фізіології, хімії було відкрито багато фізіологічних процесів, в основі яких лежать хімічні перетворення. Пояснити ці процеси могла тільки наука, що спиралась на закони хімії та методичні підходи, характерні для живих організмів. Ні загальна, ні органічна хімія зробити це своїми методами і підходами не змогли. Отже, біологічна хімія є стиковою (суміжною) наукою, яка зародилась від схрещення хімії і біології.

Біохімія тісно пов’язана з фізіологією, від якої вона відокремилась і стала самостійною наукою. Власне, ці дві науки доповнюють одна одну: фізіологія вивчає функції здорового організму, а біохімія, спираючись на свої специфічні методи, відкриває ті хімічні компоненти та процеси, що лежать в основі цих функцій, тобто фізіолог для пояснення тієї чи іншої функції на молекулярному рівні завжди звертається до біохімії. Можна вважати, що фізіологія – це «старша сестра» біохімії.

Для медицини біохімія стала головною фундаментальною науковою дисципліною, що на молекулярному рівні пояснює всі біологічні процеси в нормі й при захворюваннях. Вона лежить в основі сучасної діагностики, встановлення прогнозу перебігу захворювання та лікування хворих. Завдяки біохімії було розкрито причини і механізми таких захворювань, як цукровий і нецукровий діабети, серповидноклітинна анемія, глікогенози, колагенози тощо (так званих молекулярних хвороб). Жоден клініцист у своїй практичній діяльності не обходиться без біохімічних обстежень хворих.

Студенту-медику біохімія не тільки допомагає зрозуміти молекулярні основи і механізми фізіологічних та патологічних процесів, але і сприяє формуванню клінічного мислення, виробленню наукового світогляду, демонструючи на конкретних прикладах, що в основі біологічних процесів здорового і хворого організмів лежать зміни молекулярних структур або хімічних чи енергетичних перетворень.

На сьогоднішній день діють кафедри біохімії при університетах, медичних, педагогічних і сільськогосподарських академіях та інститутах, у біохімічних лабораторіях та спеціалізованих закладах, де опрацьовують сучасні біотехнології. Видаються біохімічні журнали, працюють біохімічні товариства та об’єднання, зокрема Міжнародна біохімічна асоціація, Європейське біохімічне об’єднання, які керують розвитком біохімії в країнах, організовують конференції, конгреси тощо.

Об’єктом біохімії стало широке коло питань, що стосуються різних проявів життя. Тому розрізняють біохімію людини, тварин, рослин, вірусів, мікроорганізмів, технічну, радіаційну тощо. У сучасній біохімії виділяють три розділи (етапи), які часто слідують не послідовно один за одним, а паралельно:

1. Статична біохімія.

2. Динамічна біохімія.

3. Функціональна біохімія.

Статична біохімія вивчає склад і хімічну структуру тканин та органів. Це найнижчий ступінь пізнання живого на молекулярному рівні. Перетворення в організмі речовин, виявлених методом статичної біохімії, досліджує динамічна біохімія. Функціональна біохімія на підставі даних статичної і динамічної біохімій вивчає зв’язки хімічних перетворень в органах і тканинах з їх фізіологічними функціями.

На ранніх стадіях розвитку біохімії вивчали тільки хімічний склад тканин і органів. Перетворення речовин та зміни їх залежно від функцій організму (сон, травлення, м’язове скорочення, збудження тощо) досліджували на наступних етапах.

Протягом останніх десятиліть інтенсивно вивчають зміни біохімічних компонентів і процесів за умов різних патологічних станів та розробляють способи ліквідації цих порушень за допомогою різних чинників. Ці питання розробляє біохімія людини.

У кінці ХХ на початку ХХІ ст. перед біохімією, в тому числі перед медициною, стоїть ряд завдань, що мають як пізнавально-наукове, так і практичне значення. Серед них можна виділити такі:

1. Дослідити обмін речовин і енергії при різних захворюваннях за умов впливу нових лікувальних середників.

2. На основі комплексного дослідження крові, сечі й інших біологічних рідин та біоптатів покращити діагностику захворювань на ранніх стадіях, а також оцінку ефективності та прогнозу захворювань.

3. На основі сучасних біохімічних технологій розробити методи виготовлення лікарських речовин і препаратів, а також харчових продуктів із нетрадиційної сировини (рослинної, тваринної, мікробної).

4. Обґрунтувати на молекулярному та клітинному рівнях особливості спадкових захворювань і розробити способи їх лікування.

5. Розробити нові способи і засоби, основані на принципах генетичної інженерії, для попередження і лікування таких захворювань, як серцево-судинні, злоякісні, алергічні та імунні хвороби.

6. Вивчити механізми пам’яті та способи її підсилення.

7. Розробити способи та засоби захисту довкілля від шкідливих антропогенних впливів за допомогою біологічних чинників.

8. Вивчити умови приживлення пересаджених тканин із метою використання за життєвими показанням трансплантації клітин, тканин і органів.

 

ФЕРМЕНТИ – БІОЛОГІЧНІ КАТАЛІЗАТОРИ

 

Одна з основних відмінностей між живим і неживим світом полягає в тому, що постійність неживого грунтується на його хімічній незмінності, тоді як стабільність і збереження живого базується на безперервних хімічних змінах, що відбуваються в ньому.

Хімічні процеси в організмі каталізуються особливими речовинами (біокаталізаторами), що називаються ферментами, або ензимами. Білкову природу ферментів беззаперечно довів Джеймс Самнер (1926), який отримав перші кристалічні  препарати ферменту уреази.  Вчення про ферменти – одна з найважливіших проблем сучасної біології і біохімії. Саме тому ХХ ст. називають ще століттям ферментів, бо вчення про них – це дітище цього століття.

Зараз встановлено, що немає жодного процесу в організмі, який би відбувався без участі ферментів. Травлення, енергозабезпечення, побудова структурних компонентів клітин і тканин, ріст, розмноження, м’язове скорочення, згортання крові пов’язані з роботою ферментів.

http://www.youtube.com/watch?v=AFbPHlhI13g&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=AEsQxzeAry8&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=KED6BHVM97s&feature=related

Ферментативні процеси людина використовувала ще в глибокій давнині. Протягом тисячоліть люди випікали хліб, виготовляли сир, вина, чай, барвники, дубили шкіри. Але застосовування тут ферментативних технологій мало суто емпіричний характер. Термін «фермент» уперше був запропонований голландським ученим ХVІІ ст. Ван-Гельмонтом для речовин, що стимулюють перетворення виноградного соку у вино. При цьому відбувається виділення міхурців газу, що нагадує кипіння (з лат. fermentatio – кипіння, бродіння). Цей процес назвали ферментацією, а речовини, що його викликають – ферментами. Дещо пізніше був запропонований ще один термін – ензими (від грец. en zyme – в дріжджах).

Зараз обидва ці терміни вживаються як синоніми. Учення про ферменти виділилось у самостійну науку – ензимологію або ферментологію. У 30-х роках минулого століття ферменти вперше були отримані в кристалічному вигляді (Джеймс Самнер). Зараз нараховується понад 2000 ферментів, встановлена їх природа, для деяких і структура, для багатьох – існування різних молекулярних форм – ізоферментів. Усі ферменти мають свої особливості функціонування, але можна виділити загальні властивості для всіх них:

1) каталізують лише енергетично можливі реакції;

2)  прискорюють як пряму, так і зворотну реакцію, але не зміщують напрямку хімічної  рівноваги;

3)  у ході реакції не змінюються та не входять до складу кінцевого продукту;

4) мають високу специфічність дії (здатність каталізувати перетворення однієї або групи подібних молекул);

5) значно більш ефективні, ніж звичайні небіологічні каталізатори – кожна молекула ферменту може виконувати від декількох тисяч до мільйонів «операцій» за секунду та прискорювати реакції у мільйони і мільярди разів;

6) діють у відносно м'яких умовах (фізіологічних значеннях рН, температури, нормальному атмосферному тиску);

7)  вони є каталізаторами, активність яких може бути регульована, тобто збільшена або зменшена.

 

Будова  ферментів

За хімічною природою ферменти – це білки, що проявляють каталітичні властивості, тобто вони прискорюють перебіг різних хімічних процесів, які відбуваються в живому організмі. Ферментам притаманні всі фізико-хімічні властивості білків: висока молекулярна маса, розщеплення до амінокислот під час гідролізу, утворення колоїдоподібних розчинів; вони не стійкі до впливу високих температур та солей важких металів, проявляють антигенні властивості, піддаються фракціонуванню. Як і білки, ферменти поділяються на прості й складні. Прості, або однокомпонентні, ферменти містять у своєму складі тільки амінокислоти. Наприклад, пепсин, уреаза, РНКаза та інші. Більшість ферментів є двокомпонентними, тобто складаються з білкової і небілкової (простетичної) частин. Їх називають ще голоферментами, а їх складові, відповідно, апоферментами (білкова частина) і простетичною групою, або коферментом (небілкова частина ферменту) (рис. 1):

Рис. 1. Схема будови складного (двокомпонентного ферменту)

 

Простетична група міцно і постійно зв’язана з апоферментом. Якщо небілкова частина ферменту зв’язана з апоферментом непостійно, тобто знаходиться в дисоційованому стані й приєднується до апоферменту тільки під час каталітичного процесу, то її називають коферментом, іноді – кофактором.

Усе ж термін кофактор більше вживається в тих випадках, коли небілкова частина ферменту представлена якимось мікроелементом (металом), якому притаманна ще й функція активатора. Загалом, небілкова частина складного ферменту – низькомолекулярна і термостабільна, тоді як білкова – високомолекулярна і термолабільна. Важливо, що апофермент і кофермент проявляють ферментативні властивості тільки при їх поєднанні.

Апофермент у складному ферменті вказує на тип перетворень, відповідає за так звану специфічність дії ферменту. Небілкова частина голоферменту сприяє зв’язуванню ферменту з речовиною, на яку він діє (субстратом), здійснює передачу електронів, атомів, іонів з однієї речовини в іншу. Важливо, що одна і та ж небілкова речовина в одних ферментах може бути зв’язана з білковою міцно (як простетична), а в інших – слабо, і то лише під час реакції (кофермент). Наприклад, ФАД легко відщеплюється від білкової частини оксидази Dамінокислот, а з ферментами тканинного дихання він утворює міцний зв’язок.

КОФЕРМЕНТИ, АБО КОЕНЗИМИ

 

Кофермент, або коензим, бере участь у перетворенні субстрату, тоді як апофермент вказує на тип реакції. Коферментом можуть виступати різні за природою низькомолекулярні органічні, а також неорганічні речовини (метали), що здатні зв’язуватись із субстратом і видозмінювати його.

 

Вітаміни як коферменти

Найчастіше коферментами виступають вітаміни та їх похідні. Наприклад, пірофосфорний ефір вітаміну В1 – ТПФ – є коферментом піруватдегідрогенази, альфа-кетоглутаратдегідрогенази та транскетолази; похідні вітаміну В2 – ФМН, ФАД входять до складу оксидно-відновних ферментів. Сюди ж належать і похідні вітаміну В5 – НАД і НАДФ (рис. 2).

 

Рис. 2. Коферменти дегідрогеназ

 

Коферментом переамінування та декарбоксилювання амінокислот є похідні вітаміну В6 – піридоксальфосфат. Вітамін В3 є основою для утворення коферменту А (кофермент ацилювання) та пантотеїнфосфату – коферменту ацилпереносного білка синтезу жирних кислот. 

Вітамін В10 в організмі перетворюється на кофермент ТГФК, що бере участь у перенесенні одновуглецевих фрагментів. Із вітаміну В12 утворюється два коферменти – метилкобаламін та дезоксиаденозил-кобаламін, які разом із ТГФК переносять і видозмінюють одновуглецеві фрагменти під час синтезу нуклеїнових кислот у кровотворних органах.

Вітамін Н (біотин) утворює активний кофермент – карбоксибіотин, що бере участь у процесах карбоксилювання. Роль коферментів можуть відігравати і вітаміноподібні речовини – ліпоєва кислота, убіхінон, карнітин та інші. Перша з них входить до складу піруватдегідрогеназного комплексу і бере участь в оксидно-відновному перетворенні альфа-кетокислот. Убіхінон служить проміжним переносником електронів і Н+ в дихальному ланцюзі, а карнітин входить як кофермент до складу трансфераз, що переносять залишки жирних кислот через мітохондріальну мембрану.

 

Порфіринові коферменти

Ці коферменти за своєю структурою подібні або навіть тотожні гему в гемоглобіні. Вони містять іони металів, зокрема заліза, які можуть змінювати свою валентність (Fe+2  → Fe+3) і за рахунок цього брати участь у перенесенні електронів під час окисно-відновних процесів. Порфіринові коферменти входять до складу таких ферментів, як цитохроми (b, с, а1, а3), каталаза, пероксидаза та ін.

Рис. 3. Модель третинної структури цитохрому С.

Червоним в центрі молекули показаний активний центр — комплекс заліза з органічною сполукою порфірином. Іон заліза, переходячи з двох- у трьохвалентний стан і навпаки, може віддавати і отримувати електрони.

 

Нуклеотидні коферменти

Найчастіше коферментами виступають нуклеозиддифосфати, рідше – нуклеозидмонофосфати. У складі коферментів нуклеозиддифосфати зв’язуються з вуглеводами, ліпідами, амінокислотами тощо. Реакції, в яких беруть участь нуклеотидні коферменти, зводяться до перетворення субстрату в молекулі коферменту. Наприклад, перетворення УДФ-глюкози в УДФ-галактозу (стереоізомеризація). Нуклеотидні коферменти можуть також виступати в ролі донорів субстратів у реакціях переносу груп. Так, УДФ-глюкоза є донором глюкози для біосинтезу глікогену, УДФ-глюкуронова кислота – донор залишку глюкуронової кислоти в реакціях кон’югації (наприклад, білірубіну). ЦДФ-холін може служити донором холіну під час біосинтезу холінфосфатидів.

 

Коферменти-метали або металовмісні комплекси

Значна кількість ферментів для своєї дії потребує наявності металів. У таких ферментах метали беруть участь в окисно-відновних процесах або відповідають за утворення зв’язку між ферментом і субстратом. Іноді важко з’ясувати, чи даний метал або його іон входить до складу ферменту, чи виконує тільки роль активатора ферменту. В останньому випадку фермент може каталізувати реакцію і без металу. Ферменти, що містять у своєму складі метали, без них не будуть проявляти хімічної активності. Зараз встановлено, що більш ніж 30 % із відомих ферментів є металовмісними або металозалежними. Металоферменти зустрічаються в різних класах ферментів.

Іон металу може входити в активний центр ферменту або бути зв’язаним із залишками амінокислот апоферменту, що розміщені на певній відстані від активного центру. Крім участі в окисно-відновних процесах, про що сказано вище, метали сприяють формуванню вищих структур апоферменту, які також є необхідними для функціонування ферменту. Ці структури стабілізуються шляхом утворення сольових містків між іонами металів і карбоксильними групами амінокислот. Такі функції здебільшого виконують метали постійної валентності.

Наприклад, іони кальцію стабілізують альфа-амілазу, іони цинку– алкогольдегідрогеназу (при відсутності цинку остання дисоціює на субодиниці й втрачає активність). В табл. 1 наведено приклади ферментів, що містять як коферменти метали:

 

Таблиця 1. Металоферменти та відповідні метали як коферменти

Металоферменти

Метали

алкогольдегідрогеназа

цинк

аргіназа, амінопептидаза

марганець

аскорбатоксидаза

мідь

цитохромоксидаза

мідь, залізо

ксантиноксидаза

молібден

фосфатаза

магній

супероксиддисмутаза

мідь, цинк

 

Коферменти-фосфати вуглеводів

Коферментами можуть бути і деякі фосфати вуглеводів. Наприклад, 2,3-дифосфогліцерат є коферментом фосфогліцеромутази, що перетворює під час гліколізу 3-фосфогліцерат на 2-фосфогліцерат. Для деяких ферментів роль коферменту можуть виконувати пептиди. Зокрема, трипептид глутатіон (глутамілцистеїнілгліцин), що може знаходитись у відновленій або окисненій формі (HS-SH- або -S-S-), виконує функцію коферменту для багатьох оксидоредуктаз, наприклад глутатіонпероксидази.

 

СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ ОСОБЛИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ

 

Більшість ферментів має чотири рівні структурної організації (первинну, вторинну, третинну і четвертинну), тобто є олігомерними білками, що складаються із протомерів. Кожна із субодиниць або окремі їх частини відіграють певну роль у процесі функціонування ферменту. Прості (однокомпонентні) ферменти здійснюють ферментативне перетворення субстрату з участю власне білкової молекули. Безпосередню участь у реакції бере не весь поліпептидний ланцюг ферменту, а тільки незначна його частина, що близько прилягає до субстрату. У ферментативну реакцію включається тільки декілька залишків амінокислот. Ці залишки можуть розташовуватися в поліпептидному ланцюзі як поруч, так і далеко один від одного, але просторово вони повинні бути досить зближені.

Наприклад, фермент рибонуклеаза, що розщеплює РНК, має структуру, яка скріплюється чотирма дисульфідними зв’язками (на рисунку заштриховано). В каталітичному центрі ферменту у 12 і 119 положенні поліпептидного ланцюга знаходяться два залишки гістидину, але вони просторово зближені й можуть викликати розрив молекули РНК. На близькій відстані від залишків гістидину знаходиться ще 5 залишків основних амінокислот, які, очевидно, можуть фіксувати РНК під час реакції (рис. 4).

Рис. 4. Схема структури рибонуклеази – ферменту, що гідролізує РНК (за Ж. Крю).

 

Та частина молекули ферменту, яка з’єднується із субстратом, називається активним центром ферменту. Активний центр відповідає за специфічну спорідненість ферменту із субстратом, утворення ферментосубстратного комплексу і каталітичне перетворення субстрату. В активному центрі ферменту умовно розрізняють так звану каталітичну ділянку, де відбувається каталітичне перетворення субстрату, і контактну, або якірну ділянку, що зв’язує фермент із субстратом. Схема розташування складових компонентів активного центру показана на рис. 5.

За утворення активного центру ферменту, як і за його каталітичну дію, відповідає третинна структура білко­вої молекули. Отже, при порушенні третинної структури (денатурація) роз’єднуються просторово поєднані амінокислотні залишки і, як наслідок, фермент втрачає активність. У складі активного центру простого ферменту знаходиться приблизно 15 залишків амінокислот. Активний центр утво­рюють залишки таких амінокислот, як серин, цистеїн, гістидин, тирозин, лізин та деякі інші, що надають ферменту як просторової, так і електричної спорідненості із субстратом. В утворенні тимчасового комплексу між ферментом і субстратом важлива роль належить дисульфідним, іонним, а також слабким зв’язкам (водневі зв’язки, гідрофобна взаємодія).

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: http://studentus.net/pictures/books/11901.files/image076.jpg

Рис. 5. Схема функціональної організації молекули ферменту:

а простий фермент; б двокомпонентний фермент; в алостеричний фермент; А активний центр;

S субстрат; R регуляторний, або алостеричний, центр; 1 каталітична ділянка; 2 контактна ділянка; 3 кофактор.

 

Активний центр складних (двокомпонентних) ферментів містить у своєму складі як кофермент, так і ту частину апоферменту, що просторово прилягає до нього. Кофермент при цьому може відповідати за утворення зв’язку із субстратом, формування третинної або четвертинної структури апоферменту і каталітичне перетворення субстрату. Ферменти можуть мати 1, 2, 3 і більше активних центрів, що залежить від кількості протомерів (субодиниць), які входять у його структуру.

Крім активних центрів, у ферментах можуть бути ще так звані алостеричні центри (від грец. алос – інший, другий; стереос – просторовий, структурний). Алостеричні центри служать місцем впливу на фермент різних регуляторних чинників, тому їх ще називають регуляторними центрами, а речовини, що взаємодіють з алостеричним центром, отримали назву ефекторів. Приєднання до алостеричного центру ефектора призводить до певних структурних змін в активному центрі та, як наслідок, пригнічення або підвищення активності ферменту. Ефекторами можуть служити продукти ферментативних реакцій, гормони, медіатори нервової системи, метали. Алостеричних центрів (як і активних) фермент може мати декілька, відповідно до кількості протомерів. Важливо зазначити, що алостеричні й активні центри у ферментах просторово відокремлені, тобто знаходяться один від одного на певній відстані.

 

Ізоферменти (ізоензими)

Ферменти, як і всі інші білки, характеризуються молекулярною гетерогенністю. Зокрема, ті з них, що побудовані з декількох субодиниць, можуть існувати в різних молекулярних формах, утворюючи цілі сімейства ферментів. Такі форми зустрічаються в різних тканинах організму і навіть усередині однієї клітини. Уперше це було встановлено на екстрактах із різних тканин, які піддавались електрофорезу в крохмальному гелі з наступним фарбуванням барвниками, специфічними для якогось певного ферменту. Так було виявлено, що на електрофореграмі ферменти дають по декілька забарвлених смуг, кількість яких залежить від виду тканини. Наприклад, лактатдегідрогеназа (ЛДГ) утворювала від однієї до п’яти забарвлених смуг, залежно від виду тканини. Отже, в різних тканинах є по декілька молекулярних форм ЛДГ, які діють на один і той самий субстрат, але відрізняються між собою електрофоретичною рухомістю. Такі ферменти, що каталізують однакову реакцію і знаходяться в різних тканинах, але відрізняються між собою деякими фізико-хімічними властивостями, наприклад електрофоретичною рухомістю, молекулярною активністю, стабільністю, називаються ізоферментами, або ізоензимами. В основі цих відмінностей знаходиться генетично зумовлена різниця їх первинної структури.

Але форми ферментів, що утворилися внаслідок модифікації первинної структури після завершення синтезу білка, не відносять до ізоферментів. Ізоферменти є характерними для більшості ферментів, які складаються з декількох субодиниць. Відносно добре вивчені ізоферменти лактатдегідрогенази, малатдегідрогенази, креатинкінази, лужної фосфатази, амінотрансфераз та ін. Розглянемо множинні ізоформи лактатдегідрогенази (ЛДГ), яка каталізує зворотну реакцію перетворення піровиноградної кислоти в молочну з участю коферменту НАД. На електрофореграмі ЛДГ виявляється 5 ізоформ, кожна з яких містить по 4 субодиниці, але двох різних типів, які умовно позначають «Н»-тип (від heart – серце) і «М»-тип (від muscle – м’яз).

На рис. 6 показано розділення і відносну кількість ізоферментів ЛДГ в різних органах. Екстракти нанесені на лінію, відмічену надписом «Старт».

Оскільки Н-субодиниці несуть більш виражений від’ємний заряд за умов електрофорезу (рН=8,4), ніж субодиниці М, вони з більшою швидкістю рухаються до анода і на фореграмі розташовуються найдалі від лінії старту. З аналогічної причини ізоферменти, що містять переважно М-протомери, рухаються з малою швидкістю в електричному полі й знаходяться біля катода. Усі інші ізоферменти, що складаються з М- і Н‑субодиниць, займають проміжні місця. Таким чином, ЛДГ має 5 ізо­форм, кожна з яких складається з таких протомерів:

ЛДГ14, ЛДГ2=МН3, ЛДГ32Н2, ЛДГ43Н, ЛДГ54.

Характерно, що кожна тканина в нормі має своє співвідношення форм, свій ізоферментний спектр ЛДГ. За типом ізоферментного спектра ЛДГ біологічні об’єкти діляться на 3 групи:

1. Із переважним вмістом у спектрі анодних, "швидких" форм (ЛДГ1 і ЛДГ2). Сюди відносять: серце, мозок, нирки, підшлункову залозу, еритроцити.

2. Тканини з переважанням ЛДГ3 (легені, селезінка, лімфовузли).

3. Тканини, в яких переважають катодні, "повільні" ізоформи (печінка, скелетні м’язи).

Отже, міокард характеризується високим вмістом ЛДГ1 і ЛДГ2 і дуже малим вмістом «повільних» компонентів. Печінка і м’язи, навпаки, містять більше «повільних» ізоформ і зовсім мало «швидких». Вивчення ізоферментного спектра широко використовується в клініці для диференціальної діагностики органічних і функціональних уражень органів і тканин, а також встановлення топографії патологічного процесу. Ізоферменти відіграють важливу роль у регуляції ферментативної активності, а також у процесі розвитку і диференціації клітин.

Припускають, що не тільки ферменти, але і багато інших білків можуть існувати в клітинах у вигляді численних форм, які являють собою суміш різних субодиниць, закодованих різними генами. Величина сумарної активності ферменту в тканинах завжди визначається співвідношенням і сумою окремих ізоформ і залежить від стану організму, вікових особливостей і сторонніх чинників, що діють на організм.

Рис. 6. Ізоформи лактатдегідрогенази.

А - будова різних ізоформ ЛДГ; Б - розподіл на електрофореграмме і відносні кількості ізоформ ЛДГ в різних органах;

В - вміст ізоформ ЛДГ у плазмі крові в нормі і при патології (Електрофореграми - зліва і фотометричне сканування - праворуч).

 

Питання біосинтезу ізоферментів з’ясовано недостатньо. Наявні дані дозволяють припустити, що він змінюється залежно від рівня метаболізму при різних станах організму. Внутрішньоклітинний синтез ізоферментів порушується при недостачі білків, що потрапляють в організм, а також вітамінів, коферментів, наявності інгібіторів тощо.

За рахунок ізоферментів обмін речовин у тканинах і органах може пристосуватися до дії мінливих внутрішніх і зовнішніх чинників. Кожна тканина має індивідуальний набір ізоферментів, який характеризує специфічність метаболізму в ній і забезпечує функціонування всіх її складових компонентів.

 

Функціональні ферментні системи

У функціональному відношенні ферменти взаємодоповнюють дію одні одних. Хімічні сполуки іноді під час перетворень переходять через довгі ланцюги реакцій, в яких беруть участь багато ферментів. Нерідко в таких численних перетвореннях продукти першої реакції служать субстратом для наступної. Сукупність таких реакцій створює поняття про так звані метаболічні шляхи, що характеризують перетворення вуглеводів, жирних кислот, кетокислот тощо.

Ферменти, що функціонально пов’язані між собою при перетворенні певних субстратів і які розміщені в одних і тих самих органелах клітини, об’єднуються під поняттям функціональні ферментні системи, або надмолекулярні ферментні асоціації. Прикладом таких систем можуть бути ферменти, що беруть участь у розщепленні глюкози до піровиноградної або молочної кислоти. Сюди відносять і ферменти, що окиснюють жирні кислоти в так званому циклі Кноопа до ацетил-КоА. Кожна ланка в цих ланцюгах перетворень каталізується певним ферментом, а зв’язок між сусідніми реакціями реалізується через проміжні метаболіти.

Окремі ферментні системи асоційовані між собою не тільки функціонально, але і структурно. До них можна віднести, наприклад, поліферментний комплекс піруватдегідрогенази, що включає в себе декілька ферментів, які через декілька стадій здійснюють окиснення піровиноградної кислоти. Подібною є і система синтезу жирних кислот, до якої входять сім структурно об’єднаних ферментів, що виконують спіль­ну функцію – синтез жирних кислот.

Деякі структурно-функціональні асоціації ферментів закріплюються на мембрані й утворюють своєрідні ланцюги, або конвеєри, ферментів, через які із метою вилучення енергії передаються "е" і "Н+". Можна вважати, що поліферментні структурно-функціональні системи в клітинах досить поширені, вони виконують біологічно важливі функції і мають переваги над неасоційованими ферментами: скорочуються відстані, на які повинні переноситися метаболіти в ізольованих ферментних реакціях, вони менш енергоємні, більш чутливі до регуляторних впливів.

 

ВЛАСТИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ ЯК КАТАЛІЗАТОРІВ

Ферменти мають ряд властивостей, подібних до небіологічних каталізаторів, але одночасно і відрізняються від них. Спільними для всіх видів каталізаторів є:

1. Вони пришвидшують тільки ті реакції, які можливі з точки зору термодинаміки, тобто ті процеси, що йдуть у напрямку термодинамічної рівноваги, але з малою швидкістю.

2. Вони не змінюють напрямку реакції.

3. Каталізатори збільшують швидкість наближення системи до термодинамічної рівноваги, не змінюючи при цьому точки рівноваги.

4. Відносно не змінюються після реакції, тобто вивільняються і знову можуть реагувати з наступними молекулами субстрату.

5. Усі каталізатори діють у відносно малих концентраціях.

Разом із тим, ферменти як білкові структури мають властивості, від­мінні від властивостей каталізаторів неорганічних. Що це за властивості? Для ферментів характерні: специфічність, чутливість до дії сторонніх чин­ників, залежність дії від рН і t°, ферментам, на противагу іншим каталі­заторам, притаманна значно вища каталітична активність. Розглянемо ці властивості.

 

Специфічність дії ферментів

Специфічність є характерною рисою, що відрізняє ферменти від усіх інших небіологічних каталізаторів. Так, дрібно розпушені платина, залізо чи нікель можуть виступати каталізаторами розкладу перекису водню на воду і кисень. Серед ферментів таку дію проявляє в основному каталаза. Таким чином, ферментам притаманна виражена специфічність дії. Кожен фермент діє на певний субстрат або на певну групу близьких за структурою субстратів чи на певний тип зв’язку в молекулі.

Висока специфічність дії ферментів зумовлена конформаційною й електростатичною комплементарністю між молекулами субстрату і ферменту, а також особливістю структури активного центру ферменту, що забезпечує високу спорідненість із субстратом і вибірковість перебігу однієї якоїсь реакції серед багатьох інших, які здійснюються в клітині. В активному центрі є функціональні групи для зв’язування відповідного специфічного субстрату, а також компоненти, що перетворюють субстрат на продукт реакції. Таку властивість називають субстратною специфічністю ферменту. Завдяки специфічності ферменти не тільки пришвидшують перетворення субстратів, але і визначають напрямок метаболічного процесу.

Ферменти можуть проявляти відносну (групову), абсолютну та просторову, або стереоспецифічність.

Ферментами з відносною специфічністю можуть служити фосфатази, ліпази, протеази та ін. Так, фосфатази здатні гідролізувати різні фосфороорганічні сполуки, наприклад бета-гліцерофосфат, глюкозо-6-фосфат, холінфосфат; ліпаза розщеплює різні жири тваринного і рослинного походження; протеази (пепсин, трипсин та ін.) також гідролітично розщеплюють пептидні зв’язки в білкових молекулах.

Відносна специфічність властива переважно ферментам травної системи, що має важливе біологічне значення, бо економить засоби впливу на субстрати. Спільним для розглянутих вище ферментів є їх дія на однакові зв’язки певної групи субстратів.

Велика кількість ферментів характеризується абсолютною специфічністю, тобто здатністю перетворювати тільки якийсь один субстрат. Прикладом таких ферментів може служити фермент уреаза, що каталізує перетворення сечовини, але не впливає на метилсечовину; фермент аргіназа перетворює аргінін, але не діє на метиларгінін; сукцинатдегідрогеназа окиснює сукцинат, але не діє на малеат.

Усій групі ферментів притаманна стереоспецифічність, тобто здатність впливати на один якийсь із стереоізомерів, наприклад на D- або L-ізомер. Так, ферменти, що каталізують перетворення вуглеводів, діють тільки на D-ізомери, але не впливають на L-ізомери; фермент фумараза каталізує перетворення фумарової кислоти, яка є транс-ізомером, але не діє на цис-ізомер – малеїнову кислоту.

 

Залежність швидкості ферментативної реакції від температури

Підвищення температури завжди збільшує швидкість хімічних реакцій, зокрема ферментативних. Як показник зростання швидкості реакції використовують температурний коефіцієнт Ван-Гофа Q10, що вказує на зростання швидкості реакції при підвищенні температури на 10 °С. Для хімічних процесів, каталізованих небіологічними каталізаторами, величина цього коефіцієнта дорівнює 2, що означає збільшення швидкості реакції вдвічі при зростанні температури на 10 °С. Однак для ферментативних процесів така закономірність існує тільки в діапазоні низьких температур – до 50-60 °С. Вище цих температур відбувається денатурація ферменту та, як наслідок, зниження активності. Оптимальні значення температури для більшості ферментів знаходяться в межах 20-40 °С.

Сумарна швидкість ферментативної реакції при зміні температури середовища являє собою результуючу від складання двох швидкостей – зростання швидкості у відповідь на підвищення температури і зниження швидкості як функції денатурації білка-ферменту. Сумація цих двох швидкостей для більшості ферментів теплокровних істот дає найбільше значення швидкості при температурі 37-40 С.

Рис. 7. Вплив температури на швидкість реакції, яка каталізується ферментом:

 а - підвищення швидкості реакції як функція температури;

б - зниження швидкості реакції як функція денатурації білка-ферменту; стрілка вказує на оптимум температури

 

Температура, при якій швидкість ферментативної реак­ції максимальна, називається тем­пературним оптимумом. Треба мати на увазі, що його величина буде зале­жати і від тривалості дії температури на фермент. Так, фермент може переносити високу температуру протягом короткого часу і в цей період активність його значно підвищиться. Але тривале перебування ферменту при високій температурі призводить до його денатурації і зниження активності.

Низькі температури також впливають на активність ферментів, але на противагу високим температурам, вони інгібують їх дію, не руйнуючи структури. Перенесення ферментів із низьких температур в оптимальні повністю (в більшості випадків) відновлює їх активність. Цю властивість застосовують у біології і медицині. Охолодження біологічних рідин, тканин, органів використовують для пригнічення в них мета­болічних процесів і попередження автокаталітичного розщеплення.

Температурний оптимум 37-40 °С для більшості ферментів тепло­кровних тварин і людини, очевидно, створює найкращі умови для існування структурної й електростатичної спорідненості між активним центром ферменту та субстратом, необхідним для їх взаємодії. Однак зустрічаються ферменти, що не руйнуються при значно вищих температурах і зберігають ферментативну активність. Так, лужна фосфатаза печінки стабільна при температурі 50 °С, а фермент м’язів міокіназа витримує навіть +100 °С. На активність ферментів впливають ще такі чинники, як концентрація субстрату, рН середовища тощо.

 

Залежність активності ферментів від рН середовища

Якщо активність ферментів визначати при різних значення рН, то графік залежності матиме вигляд куполоподібної кривої (рис. ), крива може бути симетрична, з однаковим підйомом і спуском у кислому і лужному середовищах, або йти на зниження в якійсь одній ділянці.

Рис. 8. Вплив рН на швидкість реакції, яка каталізується ферментом (стрілка вказує оптимум рН)

 

Значення рН, при якому активність ферменту найвища, називається рН-оптимумом ферменту. Звичайно ферменти найактивніші в межах вузької зони рН, яка для більшості з них знаходиться в межах рН 6‑8. Ряд внутрішньоклітинних ферментів найкраще функціонує у нейтральному середовищі. Разом із тим, для ферментів шлунково-кишкового тракту рН-оптимум може знаходитись у зоні від нейтрального до сильно кислого і лужного сере­довищ. Так, пепсин має оптимум рН 1,5‑2,5, трипсин – рН 8,0-9,0. Для виявлення залежності активності ферменту від концентрації водневих іонів експерименти проводять при оптимальній температурі, достатньо високих концентраціях субстрату, але при різних значеннях рН.

Чутливість активності ферментів до зміни рН середовища, очевидно, пов’язана з тим, що фермент, залежно від середовища, може знаходитись в іонізованій або неіонізованій формі, що буде обов’язково відображатися на третинній структурі білка, зокрема при формуванні активного центру та утворенні фермент-субстратного комплексу. Безумовно, різне значення рН буде по-різному впливати і на стан іонізації кофакторів та субстратів.

Можна стверджувати, що саме при рН-оптимумі між субстратом і ферментом існує найкраща просторова та електростатична комплементарність, яка забезпечує їх зв’язування, утво­рення фермент-субстратного комплексу і подальше перетворення його. На рис. показана графічна залежність активності ферментів від рН сере­довища.

 

МЕХАНІЗМИ ТА ОСОБЛИВОСТІ ПЕРЕБІГУ ФЕРМЕНТАТИВНИХ РЕАКЦІЙ

 

Енергетичні особливості ферментативних реакцій

Чому під впливом ферментів зростає швидкість реакцій?

Для того, щоб відбувалася реакція, реагуючі молекули повинні мати певний запас енергії.

Ферменти, як і інші каталізатори, прискорюють тільки ті реакції, які термодинамічно можливі, тобто ті, що відбуваються самовільно, але з малою швидкістю. Можливість перебігу хімічної реакції визначається різницею між вільною енергією початкових речовин і продуктів реакції. Якщо вільна енергія продуктів реакції менша, ніж початкових речовин, тобто відбувалося розсіювання енергії, то реакція перебігає самовільно – вона термодинамічно можлива. У випадку переважання вільної енергії продуктів реакції над вихідними речовинами реакція енергетично стає неможливою (це так звана ендергонічна реакція). Вона може здійснюватись тільки за умов надходження зовніш­ньої енергії в кількості, більшій за енергію утворюваних продуктів.

Швидкість будь-якої реакції залежить від величини енергетичного бар’єру, який необхідно подолати реагуючим молекулам, але для різних реакцій величина цього бар’єру неоднакова. У зви­чайних умовах (при відсутності каталізатора, ферменту або при низьких температурах) є дуже мала кількість молекул, здатних перемагати цей бар’єр і вступати в реакцію. Отже, без каталізаторів та при низьких тем­пературах швидкість реакцій буде низькою.

Здатність молекул вступати в хімічну реакцію визначається енергією активації, яка затрачається на перемагання сил відштовхування, що виникають між електронними хмаринками взаємодіючих молекул. Інакше кажучи, енергія активації витрачається на утворення проміжного комплексу між реагуючими молекулами.

 

Механізм ферментативних реакцій

За всю історію вчення про ферменти було запропоновано багато гіпотез, що пояснювали механізм їх дії. Більшість із них має суто історичний характер і не витримала випробувань у світлі нових даних про структуру ферментів та їх активного й алостеричного центрів. Заслуговує уваги гіпотеза, запропонована на початку ХХ ст. Варбургом і Бейлісом. Її значення полягає в тому, що вона пов’язувала механізм дії ферментів із дією неорганічних каталізаторів. Ця гіпотеза пояснювала, що поверхня ферменту служить місцем для адсорбції реагентів. За цих умов різко зростає кількість молекул субстрату, що припадає на одиницю площі ферменту, а отже, за законом діючих мас зростає і швидкість реакції. Також припускалось, що в результаті зв’язування субстрату з активним центром ферменту відбуваються механічні зміни молекул субстрату, що призводить до більшої реакційної здатності. Але адсорбційна гіпотеза не могла пояснити специфічності дії ферментів, тому вона не використовується.

Для пояснення специфічності дії ферментів у 1894 р. Е. Фішер запропонував гіпотезу, яку ще й досі називають гіпотезою «ключа і замка» або гіпотезою «шаблону».

В основі специфічності, за цією гіпотезою, лежить жорстка просторова відповідність субстрату і активного центру ферменту. За Е. Фішером, реакція можлива тільки в тому випадку, якщо просторово субстрат підходить до ферменту, як ключ до замка. Якщо субстрат (ключ) просторово відрізняється від структури активного центру ферменту (замок), то реакція не відбувається.

Але і ця гіпотеза (її ще називають гіпотезою відповідності) не може пояснити різні види специфічності, бо важко уявити собі ситуацію, коли декілька ключів (субстратів) підходить до одного замка (ферменту). Тому ця гіпотеза була замінена і доповнена гіпотезою вимушеної співвідповідності (гіпотеза індукованої адаптації ферменту до субстрату). Згідно з цією гіпотезою, конфігурація ферменту і його активного центру є гнучкою й еластичною, що змінюється під впливом субстрату, тобто субстрат індукує у ферменті зміни конфігурації молекул відповідно до власної структури. Іншими словами, «замкова щілина», за Кошландом, виготовлена з еластичного матеріалу і тому набуває форми «ключа» при контакті з ними. Але приєднання субстрату до ферменту може викликати зміни активного центру, при яких він утворює із субстратом неактивний комплекс, і тоді реакція не відбувається. На рис. представлені зміни структури активного центру ферменту, що можуть викликатись субстратом (за Кошландом):

Гіпотеза Кошланда про індуковану відповідність

 

Значну роль у вивченні механізму взаємодії ферменту і субстрату відіграли класичні праці Міхаеліса і Ментен, опубліковані в 1913 р., про так звані ферментосубстратні комплекси. Згідно з гіпотезою Міхаеліса-Ментен, ферментативна реакція завжди супроводжується утворенням проміжної короткоіснуючої сполуки – ферментосубстратного комплексу. Процес утворення комплексу описується рівнянням і перебігає у декілька стадій, кожна з яких має свої особливості:

1 стадія – зв’язування субстрату з активним центром ферменту, тобто утворення ферментосубстратного комплексу (ES);

2 стадія – перетворення первинного ферментосубстратного комплексу в один або декілька активних ферментосубстратних комплексів (ЕSx i ESxx);

3 стадія – відокремлення продуктів реакції від активного центру ферменту і вивільнення ферменту та продукту (Е і Р).

1-а стадія за тривалістю найкоротша: вона проходить майже миттєво. За цей час субстрат орієнтується навколо активного центру й утворює з ним короткоіснуючу, неміцну проміжну сполуку. На 2-й стадії, яка перебігає найповільніше, відбуваються розхитування зв’язків у молекулі субстрату, розрив їх та утворення нових із каталітичним центром ферменту. Зни­жується енергія активації субстрату, що зумовлює зростання швидкості його перетворення. 3-я стадія за тривалістю наближається до 1‑ї, і швидкість її перебігу залежить від дифузії продукту в середовище.

http://www.youtube.com/watch?v=PILzvT3spCQ&playnext=1&list=PL07049A3A666B58A5

 

Достовірність утворення ферментосубстратного комплексу, постульованого вперше Міхаелісом, зараз доведена експериментально, математично методами ЕПР і ЯМР. Перші докази існування ферментосубстратного комплексу були одержані в лабораторії Кейліна і Чанса. Сучасні методи дослідження дозволяють визначити для ряду ферментативних реакцій константи швидкості утворення ферментосубстратних комплексів та їх дисоціації на фермент і продукти.

Встановлено, що в утворенні ферментосубстратних комплексів беруть участь водневі зв’язки, електростатичні та гідрофобні взаємодії. Досліджуючи рівняння Міхаеліса-Ментен, можна також вивчити кінетику ферментативних реакцій, встановити порядок реакції та стежити за впли­вом різних чинників на перебіг ферментативного процесу. В за­гальному, прискорення хімічних реакцій відбувається завдяки тому, що ферменти забезпечують правильну орієнтацію молекули субстрату біля каталітичного центру, надають для каталізу протон-донорні і протон-акцепторні групи, утворюють за допомогою ковалентних зв’язків нестабільні проміжні сполуки із субстратом і викликають напруження в молекулі субстрату або її деформацію.

http://www.youtube.com/watch?v=cXLpxe6sPwI&feature=related

 

КІНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНИХ РЕАКЦІЙ

 Основи кінетики ферментативних процесів були закладені у працях Міхаеліса і Ментен, зокрема в рівнянні ферментосубстратного комплексу.

Під кінетикою ферментативних процесів розуміють розділ науки про ферменти, що вивчає залежність швидкості ферментативної реакції від хімічної природи субстрату, умов середовища, а також сторонніх чинників, які впливають на перебіг реакції.

Коли концентрація субстрату досить велика, то вона вже не впливає на швидкість, бо остання стала максимальною (свідчення того, що весь фермент зв’язаний із субстратом). Графічно залежність швидкості реакції від концентрації субстрату описується гіперболою, яку називають кривою Міхаеліса.

Рис. 9. Крива насичення хімічної реакції, яка ілюструє співвідношення між концентрацією субстрату [S] та швидкістю реакції v

 

Форма кривої показує, що із збільшенням концентрації субстрату всі активні центри ферменту насичуються. Це досягається при максимальнїй концентрації ферменту і відповідає максимально можливій швидкості реакції. Як видно з графіка, при низьких кон­центраціях субстрату ферментативна реакція відбувається за першим порядком, тобто швидкість зростання її залежить від концентрації однієї речовини – субстрату. В умовах високої концентрації субстрату реакція перебігає за нульовим порядком, тобто зміна концентрації не впливає на перебіг процесу, швидкість реакції за цих умов максимальна, оскільки всі активні центри ферменту зв’язані із субстратом.

Дослідження активності ферментів проводять при великих концентраціях субстратів (нульовий порядок реакції). У цих умовах усі зміни швидкості реакції будуть залежати тільки від кількості ферменту. Але в живих клітинах концентрації субстрату, як правило, далекі від насичення ферментів. Це означає, що ферменти в клітинах використовують не всю свою потужність.

 

Залежність швидкості ферментативної реакції від кількості ферменту

Якщо субстрат знаходиться в надлишку, що практично має місце в експериментальних умовах, то швидкість реакції пропорційна кількості ферменту. Але, якщо кількість ферменту збільшити настільки, щоб субстрат перестав бути в надлишку, то така пропорційність порушиться, що показано на рис.

Як видно з рисунка, швидкість ферментативної реакції лінійно зростає із збільшенням вмісту ферменту (прямий відрізок кривої). Але надмірне зростання концентрації ферменту призводить до того, що субстрату стає менше, ніж ферменту і це проявляється зменшенням наростання швидкості реакції (на рисунку полога частина лінії).

Дія на ферменти модуляторів

Активність ферментів може змінюватись не тільки за зміною кількості субстрату, ферменту, рН середовища, але і під впливом різних хімічних речовин. Речовини, що впливають на хід ферментативних реакцій, називаються їх модуляторами, або ефекторами. Вони поді­ляються на активатори та інгібітори, тобто під їх впливом реакція може при­скорюватись або сповільнюватись. Вивчення дії модуляторів фер­ментів має практичне значення, бо дозволяє глибше зрозуміти природу дії ферментів. Деякі з них відіграють роль природних регуляторів метаболізму. Існує багато типів модуляторів активності ферментів, що відрізняються між собою за будовою та механізмом дії.

 

Активатори ферментів

Роль активаторів можуть відігравати як органічні (жовчні кислоти, ферменти й ін.), так і неорганічні речовини (іони металів, аніони). Нерідко зустрічаються випадки, коли одна і та ж речовина стосовно одного ферменту є активатором, а відносно іншого – інгібітором. Іони металів бувають досить специфічними активаторами для певних ферментів. Вони можуть сприяти приєднанню субстрату до ферменту, брати участь у формуванні третинної структури ферменту або бути складником активного центру. Іони багатьох металів (натрію, калію, кальцію, магнію, заліза, міді та ін.) є обов’язковими компонентами, що необхідні для нормального функціонування багатьох ферментів. Іноді для деяких ферментів потрібно декілька різних іонів. Наприклад, для Nа+, К+-АТФази, що здійснює транспорт іонів через плазматичну мембрану, потрібні для нормального функціонування іони калію, натрію та магнію.

Метали можуть входити до складу простетичних груп ферментів. Наприклад, залізо в складі порфіринових сполук є необхідним компонентом ферментів цитохромної системи, каталази і пероксидази; кобальт входить до простетичної групи гомоцистеїнтрансметилази і метилмалонілізомерази ферментів; мідь – до аскорбатоксидази; марганець є активатором ізоцитратдегідрогенази.

Металоферменти, що містять у своєму складі переважно дво- і тривалентні іони, утворюють із залишками функціональних груп амінокислот та відповідними іонами клешнеподібні хелатні сполуки. У таких сполуках іони надають ферментам певної просторової структури і сприяють утворенню ферментосубстратних комплексів. Деякі ферменти при відсутності металів просто не проявляють ферментативної дії. Наприклад, вугільна ангідраза без цинку не має властивостей ферменту і дію цинку не можна замінити жодним іншим іоном.

Аніони, порівняно з катіонами, рідше є активаторами ферментів. Прикладами активуючої дії аніонів можуть бути аніони хлору відносно пепсину та амілази слини; аніони галогенів – аденілатциклази; жовчні кислоти – панкреатичної ліпази. Деякі ферменти проявляють активуючу дію стосовно своїх неактивних форм (автокаталіз). Наприклад, пепсин відносно пепсиногену, трипсин – трипсиногену тощо. Деякі ферменти активують зовсім інші ферменти. Так, ентерокіназа шляхом відщеплення інгібітора перетворює неактивний трипсиноген в активний трипсин, а останній перетворює хімотрипсиноген у хімотрипсин. Активаторами можуть бути такі органічні сполуки, як цистеїн, відновлений глутатіон та інші, що мають вільну SH-групу. Ці сполуки здатні відновлювати дисульфідні зв’язки неактивних ферментів до сульфгідрильних груп і цим самим перетворювати ферменти в активні. Таким чином речовини з вільними SH-групами захищають ферменти від агресивних хімічних впливів, наприклад від окиснення, і тому виступають активаторами ферментів.

Існує група ферментів, що активуються за допомогою циклічного АМФ.

Такі ферменти називаються протеїнкіназами. Механізм їх активації такий. Протеїнкіназа складається з двох субодиниць: ката­літичної, що містить активний центр, і регуляторної, в якій розміщений центр зв’язування циклічного АМФ. Фермент неактивний, бо його активний центр закритий. Він звільняється тільки при взаємодії ц‑АМФ і регуляторного центру ферменту.

Активація ряду ферментів залежить від процесів фосфорилювання і дефосфорилювання. Так, фосфорилаза, що відщеплює від глікогену одну молекулу глюкози, проявляє свою дію тільки у фосфорильованому стані (фосфорилаза А), в нефосфорильованому стані (фосфорилаза В) вона неактивна. Аналогічно ліпаза жирової тканини активність свою проявляє значно інтенсивніше у фосфорильованому стані. Фосфорилювання цих ферментів здійснюється за рахунок АТФ при участі протеїнкіназ.

Дефосфорилювання фосфорильованої ліпази здійснюється під впливом фосфопротеїнфосфатази.

Деякі ферменти проявляють каталітичну дію тільки в нефосфо­рильованому стані, а фосфорилювання призводить до втрати їх активності. Прикладом може служити фермент глікогенсинтаза. Таким чином, за допомогою поєднаної дії ферментів протеїнкіназ і фосфатаз певні ферменти можуть переходити з неактивного стану в активний і навпаки, що має важливе значення в регуляції метаболічних процесів. В основі активації ферментів, як було показано вище, лежать різні механізми. Серед них можна назвати такі:

1 – активація за допомогою впливу на активний центр;

2 – активація шляхом відщеплення від ферменту частини пептидного ланцюга або якоїсь неорганічної сполуки, що закривала активний центр;

3 – активація шляхом приєднання до ферменту якоїсь модифікуючої сполуки;

4 – активація шляхом дисоціації неактивного комплексу ферменту на субодиниці, одна з яких проявляє властивості ферменту.

 

Інгібітори ферментів

Подібно до активаторів, інгібуючу дію на ферменти можуть проявляти різні за будовою і за механізмом дії речовини. Вивчення різних інгібіторів відкриває великі можливості для розуміння механізмів дії ферментів. Інгібітори (від лат. інгібіціо – затримка, гальмування) – речовини, що, на відміну від активаторів, послаблюють або цілком призупиняють дію ферментів. Деякі інгібітори ферментів є отрутами для живих організмів (наприклад, ціаніди, сірководень, монооксид вуглецю). Ряд лікарських засобів також має виражені інгібуючі властивості щодо певних ферментних систем. Тому інгібітори широко застосовують в експериментальній медицині для з’ясування механізму дії лікарських середників.

 

http://www.youtube.com/watch?v=0pJOFze055Y

 

За механізмом дії інгібітори поділяються на дві групи:

1. Інгібітори, що вступають із ферментами у зворотну реакцію.

2. Інгібітори, що реагують із ферментами незворотно.

Незворотний інгібітор утворює з ферментом міцну сполуку за рахунок ковалентних зв’язків. Ці зв’язки виникають між різними функціональними групами, що поєднуються з активним центром ферменту. Такий комплекс не розпадається і не дисоціює на вихідні речовини, наприклад, ціанідна кислота і її похідні, фосфороорганічні, тіолові отрути та ін.

Деякі незворотні інгібітори руйнують структуру молекули ферменту, тому їх ще називають денатурантами. Вони є неспецифічними інгібіторами для всіх ферментів. Сюди відносяться солі важких металів (свинець, ртуть, срібло). Зворотні інгібітори пригнічують реакцію, але не викликають значних змін у структурі молекули ферменту. Розрізняють три типи зворотного інгібування ферментів: конкурентне, неконкурентне і безконкурентне.

 

Конкурентне інгібування

Конкурентні інгібітори здатні зворотно зв’язуватись з активним центром ферменту і конкурувати із субстратом за активний центр. Такі інгібітори часто є структурними аналогами субстрату і тому комплементарні активному центрові ферменту.

 

http://www.youtube.com/watch?v=duN73LFWNlo&feature=related

 

Якщо активний центр ферменту зв’язується з інгібітором, то він не зможе вступати в реакцію із субстратом. При наявності субстрату (S) й інгібітора (І) одночасно відбуваються дві реакції:

Е + S Þ ЕS Þ Е + Р

Е + І Þ ЕІ

Та сполука, концентрація молекул якої більша, буде переважно спо­лучатися з активним центром і визначати напрямок реакції. Зняти гальмівний вплив інгібітора можна надлишком субстрату, який витіснить інгібітор активних центрів молекул ферменту. Конкурентне інгібування називають ще ізостеричним. Воно викликається речовинами, які за своєю структурою близькі до субстратів. Прикладом конкурентного гальмування є пригнічення малонатом активності сукцинатдегідрогенази – ферменту, що окиснює сукцинат, який при цьому перетворюється у фумарат:

Якщо в середовище, де відбувається окиснення сукцинату, внести малонову кислоту (інгібітор сукцинатдегідрогенази), яка за структурою дуже подібна до сукцинату і відрізняється від неї тільки тим, що містить одну групу СН2, то утвориться фермент-інгібіторний комплекс, який не здатний окиснюватись, тобто два атоми водню не відщеплюються. У результаті приєднання малонату до ферменту реакція окиснення сукцинату загальмовується. Отже, сукцинат і малонат, як близькі за структурою речовини, конкурують за зв’язування з активним центром ферменту. Тому напрямок реакції буде визначатися співвідношенням концентрацій субстрату й інгібітора. Інакше кажучи, якщо в середовищі одночасно наявні субстрат та інгібітор, то у випадку переважання концентрації інгібітора реакція загальмується і, щоб зупинити його гальмівну дію, потрібно внести надлишок субстрату. Останній за законом діючих мас витіснить із комплексу інгібітор, і реакція відновиться. Таку ж конкурентну дію на сукцинатдегідрогенезу проявляє і оксалоацетат, який також близький за структурою до сукцинату.

На рисунку зображена трьохмірна структура протеази вирусу имунодефіциту людини (ВІЛ), завдання котрої - розчепити синтезуючий загальний білок ВІЛ на оокремі працездатні білки. Якщо цю протеазу інгібувати - блокується складання нових вірусних частинок.

Конкурентне інгібування широко застосовується в медичній практиці для боротьби з інфекціями, в сільському господарстві – для знищення шкідників, а також у військовій справі.

Конкурентними інгібіторами (ізостеричними) можуть виступати про­міжні продукти обміну – метаболіти, накопичення яких регулює активність ферментів. Дія багатьох лікарських середників відбувається за принципом конкурентного інгібування. Наприклад, сульфаніламіди, що широко застосовуються для лікування інфекційних захворювань, структурно подібні до параамінобензойної кислоти (ПАБК), яку бактерії використовують для синтезу фолієвої кислоти. Остання входить до складу ферментів, необхідних для їх росту. Сульфаніламіди витісняють ПАБК із комплексу з ферментом, що призводить до гальмування росту бактерій.

Конкурентну дію проявляють також деякі аналоги вітамінів. На­приклад, дезоксипіридоксин – аналог вітаміну В5 або аміноптерин – аналог фолієвої кислоти. Ці аналоги вітамінів називаються ще антивітамінами. Вони можуть утворювати так звані антикоферменти, що проявляють властивості конкурентних інгібіторів. Антикоферменти або їх попередники антивітаміни застосовуються в біохімічних дослідженнях або в медичній практиці як ефективні лікувальні засоби. Наприклад, аміноптерин використовують для лікування лейкозу і пухлинних захворювань; ізоніазид (аналог вітаміну В5) – туберкульозу; кумарини, що є антивітамінами нафтохінонів (вітаміни К), застосовують в лікуванні й в профілактиці тромбозів.

 

Неконкурентне інгібування

Неконкурентне інгібування викликається речовинами, які не мають структурної спорідненості (подібності) із субстратом і зв’язуються з каталітичними групами активного центру та ділянками, що розташовані поза активним центром. Таке приєднання інгібітора до ферменту змінює конфігурацію активного центру, що пригнічує його взаємодію із субстратом. У цьому випадку утворюється потрійний комплекс: фермент-субстрат-інгібітор:

Е+S+І Þ ESІ.

Цей комплекс не здатний перетворюватися в продукт, тому реакція зупиняється.

До неконкурентних інгібіторів належить багато різних речовин, наприклад солі важких металів (срібла, ртуті, свинцю, кадмію, міді), сполуки арсенію, фосфороорганічні речовини, алкілувальні речовини, йодацетат, ціаніди, окис вуглецю, сірководень. Конкретні механізми дії кожного з названих інгібіторів будуть різними. Так, в основі інгібуючої дії солей важких металів лежить здатність їх блокувати SH-групи каталітичного центру ферментів; ціаніди міцно з’єднуються з Fe3+ каталітичного центру гемінового ферменту цитохромоксидази, що завершує процес біологічного окиснення з утворенням води. Таке інгібування виключає дихальний ланцюг і клітина гине. Йодацетат як інгібітор взаємодіє із SH‑групами ферменту, утворюючи з ним ковалентну сполуку, що при­зводить до виключення ферменту. Окис вуглецю СО є інгібітором переважно тих ферментів, у складі яких є залізо або мідь. Високу інгібуючу активність проявляють так звані фосфороорганічні речовини. Серед них зустрічаються такі, що застосовуються в практичній медицині, сільському господарстві для боротьби із шкідниками, а деякі – як бойові отруйні речовини (табун, зарин). Ці інгібітори утворюють із ферментами комплекси, які не мають каталітичної дії. Фосфороорганічні інгібітори гальмують дію протеаз (трипсину, хімотрипсину), естераз, зокрема ацетилхолінестерази, що каталізує розпад ацетилхоліну. Як наслідок дії фосфороорганічних інгібіторів буде нагромаджуватись ацетилхолін, що проявляється порушенням функції нервової системи.

Конкурентні та багато неконкурентних інгібіторів відносяться до так званих зворотних чинників, оскільки вони утворюють із ферментами нестійкий комплекс, тобто гальмують реакції без значних змін у структурі ферменту. Ті інгібітори, що вступають у реакції з ферментами і утворюють із ними міцні сполуки за рахунок ковалентних зв’язків, викликають незворотне гальмування. Важливе місце серед неконкурентних зворотних інгібіторів посідають проміжні продукти метаболізму. Вони здатні зворотно зв’язуватися із специфічними ділянками на поверхні деяких алостеричних ферментів і змінювати активність їх каталітичного центру.

 

Інгібування продуктами реакції

Продукт реакції нерідко за своєю структурою подібний до суб­страту. Тому, нагромаджуючись, такий продукт може поводити себе як конкурентний інгібітор ферменту. Цей процес може виконувати регуляторну функцію, бо нагромадження надлишку утвореного продукту призводить до гальмування його утворення. Наприклад, глюкоза є конкурентним інгібітором ферменту глюкозо-6-фосфатази:

Інгібування надлишком субстрату

Наявність в інкубаційному середовищі надмірно високих кон­центрацій субстрату викликає гальмування реакції. За цих умов крива Міхаеліса проявляє тенденцію до зниження. Зрозуміти таке інгібування можна, припустивши, що молекули субстрату через взаємні перешкоди здатні займати неправильні положення в активному центрі ферменту, що перешкоджає нормальному перебігові реакції.

 

Генетичне інгібування

Генетичне інгібування здійснюється шляхом пригнічення утворення ферменту на генетичному рівні. Генетичне гальмування настає тоді, коли зникає потреба в певному ферментові. Наприклад, у процесі еволюції в людини зникли ферменти, які синтезують речовини, що містяться в достатній кількості в продуктах харчування: деякі амінокислоти, вітаміни С, В1, В2  тощо.

 

ВЛАСТИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ

Основними властивостями ферментів як біологічних каталізаторів є їх висока  активність, специфічність  дії, термолабільність, залежність від рН середовища, присутності активаторів та інгібіторів. Перераховані властивості зумовлені білковою природою ферментів. Швидкість реакції залежить від співвідношення концентрації ферменту і субстрату.

Вплив температури на активність амілази слини. Однією з характерних властивостей ферментів є їх термолабільність, тобто чутливість до змін температури. Температура, при якій спостерігається максимальна швидкість ферментативної реакції, називається оптимальною. Для більшості ферментів її значення знаходиться в межах 35-400 С. Із підвищенням температури білкова частина ферменту може денатуруватися і він втрачає каталітичні властивості. При зниженні температури активність різко загальмовується.

Принцип методу. Про залежність активності амілази слини від температури чвідчить розщеплення крохмалю при наявності слини в різних температурних умовах. Ступінь розщеплення крохмалю виявляють йодокрохмальною реакцією або реакцією Фелінга.

 

Специфічність дії амілази слини та сахарази дріжджів. Специфічністю називається здатність ферментів каталізувати певні хімічні реакції. Розрізняють абсолютну, відносну, стереохімічну специфічність. Специфічність зумовлена білковою частиною ферментів, а також будовою їх активного центру. Тільки деякі чітко визначені функціональні групи ферментів можуть брати участь в утворенні фермент-субстратних комплексів. Амілаза прискорює гідроліз тільки полісахаридів (крохмалю, глікогену) і не діє на олігосахариди. Мальтаза гідролізує розщеплення мальтози, але не діє на сахарозу.

Принцип методу. Про специфічність амілази і сахарази свідчить їх вибіркова дія на субстрати. Продукти гідролізу субстратів визначаються реакціями Тромера або Фелінга.

 

Вплив рН середовища на активність амілази слини. Фермент проявляє максимальну активність при оптимальному значенні рН. Кожен фермент має своє оптимальне значення рН: пепсин – 1,5-2,5, аргіназа – 9,5, амілаза – 6,8-7,0. Із зміною рН змінюється ступінь дисоціації іоногенних груп, фермент змінює свою конфігурацію, в тому числі активного центру, що зумовлює зниження або втрату його каталітичних властивостей.

Принцип методу. Оптимальне значення рН для амілази слини можна встановити за розщепленням крохмалю при різних значеннях рН середовища. Ступінь гідролізу крохмалю оцінюється за результатом реакції з йодом. При оптимальному значенні рН розщеплення крохмалю відбувається повністю (забарвлення з йодом відсутнє). По мірі віддалення від оптимального значення рН в кислу  або лужну сторону, розщеплення крохмалю відбувається частково, до стадії декстринів (фіолетове або червоно-буре забарвлення), або крохмаль взагалі не розщеплюється (синє забарвлення).

 

Вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази слини. Речовини, які підвищують активність ферментів, називаються активаторами, а ті, що пригнічують – інгібіторами. Приклади активаторів деяких ферментів: для амілази – хлорид натрію, для ліпази – жовчні кислоти, для пепсину – соляна кислота. Неактивні форми деяких ферментів називаються проферментами. В організмі має місце аутоактивація – перетворення проферменту у фермент за допомогою того ж активного ферменту.

Наприклад, активний пепсин викликає аутокаталіз пепсиногену. Активатори та  інгібітори (ефектори) можуть впливати безпосередньо на активний центр ферменту, а також можуть взаємодіяти з алостеричними (регуляторними) центрами і тим самим змінювати каталітичну активність ферменту. Інгібіторами можуть бути солі важких металів, ціаніди, фосфорорганічні сполуки, деякі продукти метаболізму, денатуруючі агенти та ін.

Принцип методу. Активуючий вплив хлориду натрію та інгібуючий вплив сірчанокислої міді на активність амілази визначають за ступенем розщеплення крохмалю, про що свідчать результати реакції з йодом.

 

ФЕРМЕНТАТИВНІ ПРОЦЕСИ ЗА ТИПОМ РЕАКЦІЙ ОСНОВНИХ КЛАСІВ ФЕРМЕНТІВ. ОДИНИЦІ ВИМІРУ КАТАЛІТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ. МЕХАНІЗМ ВИНИКНЕННЯ ЕНЗИМОПАТІЙ. ЕНЗИМОДІАГНОСТИКА, ЕНЗИМОТЕРАПІЯ

КЛАСИФІКАЦІЯ І НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТІВ

 

Існує два типи назв ферментів: тривіальна (робоча) і систематична.

Робоча назва ферменту складається з назви субстрату, назви типу каталітичної реакції і закінчення аза. Наприклад:

лактат + дегідрогенізація – лактатдегідрогеназа. Це фермент окиснення (дегідрогенізації) лактату.

За систематичною номенклатурою назва ферменту складається з назви субстрату, на який діє фермент, назви типу хімічної реакції і закінчення – аза. За цією номенклатурою назва лактатдегідрогенази пишеться так:

лактат : НАД – оксидоредуктаза (суб. І : суб. ІІ – тип хім. реакції)

Поряд із цим, зберігаються також назви давно відомих ферментів (історична назва), наприклад пепсин, хімотрипсин, каталаза тощо.

За офіційною міжнародною класифікацією, ферменти діляться на 6 класів, залежно від типу каталізованих реакцій:

1. Оксидоредуктази – ферменти, які каталізують окисно-відновні реакції.

2. Трансферази – ферменти, які каталізують міжмолекулярне перенесення різних хімічних груп.

3. Гідролази, які каталізують реакції гідролітичного розщеплення внутрішньомолекулярних зв'язків.

4. Ліази, які каталізують реакції негідролітичного розщеплення з утворенням подвійних зв'язків, і навпаки – приєднання груп у місцях подвійних зв'язків.

5. Ізомерази, які каталізують реакції ізомеризації.

6. Лігази (синтетази) – ферменти, які каталізують з'єднання двох молекул із використанням енергії фосфатного зв'язку. Джерелом енергії для таких реакцій служить АТФ або інші нуклеозидтрифосфати.

 

Класи ферментів діляться на підкласи, а вони – на підпідкласи.

Підклас уточнює дію ферменту, вказуючи на природу субстрату. Ще більше конкретизує дію ферменту підпідклас, що вказує на природу субстрату чи акцептора, який бере участь у реакції. Згідно з класифікацією, для кожного ферменту існує шифр, що містить 4 кодові числа, які розділяють крапками. 1 цифра шифру означає клас, 2 – підклас, 3 – підпідклас, 4 – порядковий номер ферменту у підкласі.

Наприклад, фермент цитохромоксидаза за міжнародною класифікацією має шифр 1.9.3.1, для лактатдегідрогенази шифр представлений цифрами 1.1.1.27.

 

Оксидоредуктази

Оксидоредуктази – це ферменти, що каталізують окисно-відновні процеси. Окисненням називається процес віднімання електронів від елемента. Зворотний до окиснення процес називається відновленням.

Але, оскільки окиснення одних речовин супроводжується відновленням інших, то всі ці перетворення об'єднуються під назвою окисно-відновних процесів. У живих організмах окиснення відбувається за допомогою відняття атомів водню або електронів від субстратів (донаторів). Акцептором атомів водню або електронів можуть бути різні речовини – нікотинамідні коферменти (НАД, НАДФ), флавінові коферменти (ФМН, ФАД), іони металів, кисень, дисульфідні сполуки та ін (рис. 1).

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: http://www.biochemistry.ru/images/book6/image006.gif

Рис. 1. Будова коферментних форм нікотинаміду та рибофлавіну

 

Оксидоредуктази поділяються на 17 підкласів. Цим ферментам належить дуже важлива роль у життєдіяльності організмів. Детальніше ми з ними познайомимось при вивченні тканинного дихання. Субстратами оксидоредуктаз можуть бути спирти, кислоти, альдегіди, кетони, NH2, NH, SH-групи, гем і його похідні та інші. Назви цим ферментам даються за принципом: донатор: акцептор-окcидоредуктаза. Так, фермент, що окиснює лактат до пірувату, називається лактат: НАД-оксидоредуктазою.

За тривіальною (робочою) номенклатурою, оксидоредуктази, що відщеплюють атоми водню або електрони від субстрату окиснення і передають їх на будь-який акцептор, крім кисню або перекису водню, називаються дегідрогеназами.

Тому розглянута вище лактат НАД-оксидоредуктаза за тривіальною номенклатурою називається лактат­дегідрогеназою. Оксидоредуктази, що використовують кисень як акцептор водню або електронів, називаються оксидазами; а ті з них, що переносять атоми водню на перекис водню – пероксидазами. Ті ферменти, яким властива більш відновна дія, називаються редуктазами. Частина ферментів класу оксидоредуктаз сприяє прямому включенню кисню в субстрат. Такі оксидази отримали назву оксигеназ, або гідроксилаз. Таким чином, у живому світі окиснення може відбуватися шляхом включення в субстрат атомів кисню або відщеплення електронів чи атомів водню.

Оксидоредуктази – дуже великий клас, що нараховує приблизно 500 ферментів (табл.3). Наведемо декілька прикладів оксидаз: цитохромоксидаза (рис. 2) окиснює цитохром С внаслідок перенесення двох електронів на кисень: 2 цит. с (Fe2+)+1/2 О2 2 цит. с (Fe3+)+О22-; каталаза (рис. 3) розкладає Н2О2 на Н2О+1/2 О2; пероксидаза окиснює речовини (спирти, феноли), використовуючи перекис водню як акцептор атомів.

Рис. 2. Просторова будова цитохромоксидази

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: http://vivovoco.rsl.ru/VV/JOURNAL/NATURE/11_03/PROT04.JPG

Рис. 3. Просторова будова каталази

 

Трансферази

Трансферази каталізують реакції міжмолекулярного переносу хімічних груп і залишків від одного субстрату (донор) до іншого (акцептор). Назва цих ферментів за міжнародною класифікацією будується так: донатор:акцептор – транспортована група – трансфераза. Наприклад, фермент, який каталізує реакцію перенесення фосфорної групи з АТФ на гексозу – гексокіназа, а повна – АТФ:D-гексозо-6-фосфотрансфераза. Трансферази, залежно від виду переношуваних груп, діляться на 8 підкласів. Ті, що переносять СН3-групи, називаються метилтрансферазами; переносники NH2-груп отримали назву амінотрансфераз. Розрізняють ще трансферази, що переносять залишки ацилів –ацилтрансферази; залишки карбоксильних груп – карбокситрансферази. Є також трансферази, що переносять залишки альдегідів, кетонів тощо. Досить поширений підклас ферментів, що переносять залишки фосфорної кислоти на АДФ або від молекули АТФ на субстрат. Такі фосфотрансферази називають ще фосфокіназами.

За поширенням трансферази близькі до оксидоредуктаз. Вони беруть участь у реакціях взаємоперетворень різних речовин, знешкодженні природних та чужорідних сполук. Деякі трансферази використовуються в діагностиці захворювань. Наприклад, АлАТ, АсАТ – для діагностики гострих гепатитів та інфаркту міокарда; креатинкіназа – для виявлення уражень скелетних м'язів.

http://www.youtube.com/watch?v=6r5Ddlcq26s

 

Гідролази

Гідролази – це ферменти, що каталізують розрив зв'язків у субстратах із приєднанням елементів молекули води. Гідролаз нараховується до 460.

До гідролаз відносять травні ферменти (ліпази, протеази, глікозидази) та багато іншихи.

Гідролази входять до складу лізосом та інших органоїдів, де сприяють розпаду біомакромолекул на прості речовини.

 

Ліази

Ліази каталізують відщеплення від субстрату негідролітичним шляхом якої-небудь групи з утворенням подвійного зв'язку або, навпаки, приєднання групи в місці подвійного зв'язку. Вони каталізують розрив зв'язків С-С, С-N, С-О, С-S. У зв'язку з цим, розрізняють такі підкласи:

– С ‑ С - ліази. До них відносять декарбоксилази. Під впливом декарбоксилаз відбувається декарбоксилювання амінокислот та альфа-кетокислот;

– С – О - ліази називаються ще гідроліазами, а за тривіальною номенклатурою – дегідратазами (гідратазами). Наприклад, карбангідраза (карбонатгідроліаза), яка розщеплює вугільну кислоту на СО2 і Н2О, а також фумаратгідратаза, під впливом якої відбувається гідратація фумаро­вої кислоти з утворенням яблучної;

– С – N - ліази – це ферменти, які відщеплюють аміак або амідинові групи. Наприклад, аргініносукцинат-ліаза розкладає аргінінбурштинову кислоту на фумарову й аргінін, що має місце під час утворення сечовини;

– альдолази – це ферменти, що каталізують розрив гексозофосфатів на дві тріози. Наприклад, фруктозо-1,6-дифосфат розщеплюється на дві тріози – гліцеральдегід-3-фосфат і діоксіацетонмонофосфат.

 

Ізомерази

Ізомерази каталізують різноманітні процеси ізомеризації. В їх складі є декілька підкласів (табл.6):

– рацемази, які каталізують перетворення L-амінокислот на D‑амінокислоти;

– епімерази, які каталізують взаємне перетворення цукрів, наприклад, галактози в глюкозу;

– мутази, які каталізують перенесення хімічних груп з однієї частини молекули в іншу.

Кофактором тут часто виступає похідне вітаміну В12. Розрізняють ще цис-трансізомерази, внутрішньомолекулярні оксидоредуктази, внутрішньомолекулярні трансферази.

 

Лігази (синтетази)

Лігази каталізують процеси конденсації двох молекул за рахунок енергії АТФ (або ГТФ, УТФ). Ці ферменти призводять до утворення нових зв'язків, звідки і походить назва цього класу ферментів (від лат. лігаре – зв'язувати). Інша назва – синтетази, оскільки вони є каталізаторами біосинтетичних процесів.

 

Іммобілізовані ферменти та їх застосування

Ферменти виявляють свою активність не тільки в мікропросторі клітини, але й поза організмом. Вони є виключно активними і специфічними каталізаторами, котрі мають недосяжну для хімічних каталізаторів активність і вибірковість і, крім того, прискорюють багато реакцій, для яких взагалі не відомі хімічні каталізатори. Тому практичне використання ферментів відкриває величезні можливості для розробки багатьох хімічних процесів, які йдуть у м'яких умовах з високим виходом цільових продуктів. Однак, по-перше, ферменти, ідеально пристосовані для роботи в живій клітині і у разі вилучення зі свого оточення стають дуже нестійкими і не можуть функціонувати достатньо тривалий термін. По-друге, ферменти, як правило, є гомогенними каталізаторами, що дуже незручно з технологічної точки зору, оскільки такий каталізатор важко відокремити від продуктів реакції і використати знову. По-третє, деякі хіміко-технологічні процеси бажано проводити за підвищеної температури, наприклад, для того, щоб не допустити забруднення продуктів синтезу (особливо лікарських препаратів) мікрофлорою; проте з підвищенням температури стабільність ферментів катастрофічно знижується. Окрім того, дуже часто потрібні органічні речовини можна одержувати з високим виходом лише в тому випадку, коли реакція йде виключно в середовищі органічного розчинника. Але в цих умовах звичайні ферменти також не здатні нормально працювати і швидко втрачають каталітичну активність. З цього випливає, що фермент, виділений із живої клітини, потребує значного вдосконалення.

За останні 15-20 років проблему вдалося розв'язати, і ферменти стали повноправними компонентами технологічних схем виробництва. Це було досягнуто шляхом розвитку методів іммобілізації ферментів, тобто фіксації їх на якихось нерозчинних матеріалах, які запобігають руйнуванню ферментів, збільшують термін їхньої дії, перетворюють їх у гетерогенний каталізатор (наприклад, у вигляді зерен).

Під іммобілізацією розуміють таку процедуру, внаслідок якої молекула ферменту тим чи іншим способом прикріплюється до певних об'єктів (носіїв), нерозчинних у воді (нерухомий). Ці об'єкти разом із ферментом легко відокремлюються від розчину після завершення реакції. Хімічне «пришивання» ферменту до носія закріплює конформацію ферменту, що й є причиною підвищення стійкості та зниження лабільності.

Іммобілізовані ферменти є начебто моделлю структурно організованих у клітині ферментів (мембрана - це та ж нерозчинна основа для сполучення із ферментом).

Приблизно в 70-х рр. XX ст. на стику певних хімічних і біологічних дисциплін сформувався новий науково-інженерний напрямок: інженерна ензимологія (найважливіший розділ біотехнології), стрімкий розвиток якої зумовив створення нових типів гетерогенних біоорганічних каталізаторів - іммобілізованих ферментів.

Ферменти і ферментні системи традиційно застосовуються в найрізноманітніших галузях практичної діяльності: у харчовій, фармацевтичній, текстильній, хутровій, шкіряній та інших галузях промисловості, у медицині, сільському господарстві, органічному синтезі, хімічному аналізі. Останніми роками ферменти стали застосовувати для здійснення таких реакцій органічної хімії, як окислення, відновлення, метилювання, ацетилювання, дезамінування, декарбоксилювання, дегідратація, конденсація для поділу і відокремлення ізомерів тощо. Вже зараз стало очевидним, що застосування біокаталізу в тонкому органічному синтезі відкриває шлях до безвідходних і низькотемпературних процесів, які протікають до того ж у неагресивних середовищах. Немає сумнівів, що впровадження біокаталітичних процесів у хімічну технологію неминуче сприятиме економії сировини й енергії, зменшенню шкоди, якої сучасна промисловість завдає навколишньому середовищу. Оволодіння тонкими механізмами дії ферментів, без сумніву, надасть необмежені можливості одержання у величезних кількостях і з великою швидкістю корисних речовин у лабораторних і заводських умовах майже зі 100 % виходом.

Таке широке застосування ферментів сприяло налагодженню промислового їх одержання у великих кількостях. Сировиною для цього служать тканини різних рослин і тварин, але найчастіше - мікроорганізми, які вирощують на селективних середовищах. Окрім того, мікроорганізми швидко накопичують свою біомасу, тому для їх культивування можуть бути використані дешеві поживні середовища. Наприклад, методами селекції, мутагенезу та генної інженерії вдалося одержати штами різноманітних видів бактерій, що продукують ті чи інші ферменти в значних кількостях: іноді з виходом понад 50\% від загальної маси клітинного білка.

Таким чином, іммобілізовані ферменти - це штучно одержаний комплекс ферменту з нерозчинним у воді носієм. Однак, поняття «іммобілізація» необхідно розуміти ширше, тобто як будь-яке обмеження свободи руху білкової молекули ферменту в просторі. Окрім зв'язування з нерозчинним носієм, цього можна також досягти, наприклад, шляхом внутрішньомолекулярної або міжмолекулярної «зшивки» білкових молекул ферменту низькомолекулярними біфункціональними реагентами або ж приєднанням ферменту до розчинного полімеру.

Іммобілізація здійснюється шляхом фізичної адсорбції ферментів на нерозчинному матеріалі; включенням ферментів до комірок гелю, а також ковалентним зв'язуванням ферменту з нерозчинним матеріалом або молекул ферменту між собою з утворенням нерозчинних поліферментних комплексів. Як адсорбенти використовують скло, силікагель, гідроксиапатити, целюлозу та її похідні, хітин, декстрани та ін. Для включення ферменту до комірок гелю використовують різноманітний гелеутворюючий матеріал, найчастіше поліак-риламідний гель. Як матеріал для ковалентного зв'язування ферментів застосовують поліпептиди, білки, похідні стиролу, поліакрила-мід, нейлон, різні похідні целюлози, крохмаль, агар, агарозу, а також скло, силікагель тощо. При ковалентному зв'язуванні ферменти знаходяться на хімічному поводку біля нерозчинного носія.

При іммобілізації ферментів використовують ті ж самі принципи, що і при афінній хроматографії. Афінна хроматографія ґрунтується на біоспецифічній взаємодії біополімеру, що виділяється, або групи полімерів із певною речовиною. Цей вид хроматографії застосовується до ферментів, імуноглобулінів, рецепторних білків, які здатні вибірково за типом комплементарності зв'язуватися із субстратами, рецепторами, антигенами, інгібіторами, кофакторами. Принцип цього методу хроматографії полягає в тому, що на нерозчинному носії закріплюють речовину, здатну специфічно зв'язуватися з білком, що виділяється, зокрема, ферментом. Цю речовину називають лігандом. Оброблений таким чином носій (адсорбент) розміщують у колонці і через неї пропускають суміш білків. З адсорбентом зв'язується тільки той білок, який має спорідненість зі специфічним лігандом. Потім білок знімають із колонки розчином, що викликає дисоціацію комплексу, який утворився між білком і лігандом.

Під час одержання іммобілізованих ферментів вживають усіх запобіжних заходів для збереження активності ферменту. Іммобілізовані ферменти, як правило, менш активні, ніж вільні, оскільки зв'язування з носієм послаблює індукційний ефект і контакт із субстратом (рис. 5, 6).

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: http://studentus.net/pictures/books/11901.files/image102.jpg

Рис. 5. Схема методу афінної хроматографії:

1 - носій (матриця); 2 - «ніжка»; 3 - ліганд; 4 - білок (фермент)

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: http://studentus.net/pictures/books/11901.files/image101.jpg

Рис. 6. Різні способи іммобілізації ферментів: «зшивка» білкового ланцюга (а);

приєднання молекули ферменту до поверхні інертного носія (б); включення в пористу матрицю (в)

У порівнянні з нативними попередниками іммобілізовані ферменти мають ряд переваг у разі їхнього використанні з прикладною метою. По-перше, іммобілізований фермент як гетерогенний каталізатор можна легко вилучити з реакційного середовища, що дає можливість:

- зупинити в потрібний момент реакцію;

- іще раз використати каталізатор;

- одержати продукт, не забруднений ферментом, що є особливо важливим для харчового і фармацевтичного виробництва. По-друге, використання гетерогенних каталізаторів дозволяє здійснювати ферментативний процес безперервно, наприклад, у проточних колонках, і регулювати швидкість реакції, яку каталізують, а також вихід продукту шляхом зміни швидкості потоку. По-третє, іммобілізація або модифікація ферменту сприяє цілеспрямованій зміні властивостей каталізаторів, у тому числі його специфічності, залежності каталітичної активності від рН, іонного складу та інших параметрів середовища, і, що дуже важливо, його стабільності стосовно різного роду денатуруючих впливів.

По-четверте, іммобілізація ферментів дає можливість регулювати їхню каталітичну активність шляхом зміни властивостей носія під впливом деяких фізичних факторів (світло, звук та ін.). На цій основі створюються механіко-звукочутливі датчики, посилювачі слабких сигналів і безсрібляні фотографічні процеси.

Основні вимоги, яким мають відповідати носії:

- висока хімічна і біологічна стійкість;

- висока механічна міцність;

- достатня проникність для ферменту і субстратів;

- висока пористість;

- можливість одержання у вигляді зручних у технологічному відношенні форм (гранул, мембран, труб, листів і т. ін.);

- легке переведення в реакційно-здатну форму (активація):

- висока гідрофільність, яка забезпечує можливість проведення реакції зв'язування ферменту з носієм у водному середовищі;

- невисока вартість.

Як носії для іммобілізації ферментів білки використовують під час фундаментальних біохімічних досліджень, а також з практичною метою, особливо у медицині. Із точки зору практичного значення важливими властивостями білкових носіїв є висока місткість відносно ферментів, здатність до біодеградації, а також можливість застосування деяких із них (завдяки фібрилярній природі), у вигляді тонкої (товщиною 80 мкм) плівки (мембрана). Іммобілізацію на білкових носіях можна проводити і у відсутності, і у присутності зшиваючих агентів. До недоліків білків як носіїв медичних препаратів для використання їх in vivo слід віднести високу імуногенність (виняток становлять колаген та фібрин). Найчастіше як носії використовуються структурні білки (кератин, фіброїн, колаген); рухові білки (міозин), а також транспортні білки, наприклад, сироватковий альбумін. Природні носії-ліпіди. Питання щодо білок-ліпідних взаємодій давно привертають увагу дослідників, оскільки in vivo більшість ферментативних реакцій протікають поблизу або на поверхні біомембран - білок-ліпідних утворень. Тому іммобілізація ферментів на природних ліпідних носіях (конструювання ансамблів білок-ліпід) може розглядатися як найоптимальніше наближення до умов функціонування ферментних систем у живій клітині.

Для такої іммобілізації, як правило, використовуються природні ліпіди - компоненти біомембран (фосфатидилхолін, фосфатидил-етаноламіни, холестерин та ін.). Ліпідні носії застосовуються у вигляді моношарів на різних поверхнях або бішарів (як правило, сферичної форми - ліпосоми). Зазвичай ліпідні носії використовуються у вигляді моношарів на твердих поверхнях, наприклад, сілікагелі, аеросилі. Для приготування ліпосом найчастіше використовують фосфатидилхолін (лецитин), кардіоліпіни, сфінгомієліни. Ліпосоми - це бульбашки розміром від 20-30 нм до 1-2 мкм, отримані з різних природних або синтетичних фосфоліпідів. Розміщені усередині ліпосом ферменти захищені від швидкого руйнування протеїназами організму, тому знаходяться в ньому відносно тривалий час, виявляючи свою відповідну дію.

Дуже перспективною є галузь утворення багатоферментних систем (за типом поліферментних систем в організмі), закріплених на одному й тому ж носії, у безпосередній близькості один від одного. При цьому іммобілізуються два або декілька ферментів, які працюють послідовно, їх активні центри певним чином орієнтовані відносно один до одного. Таким шляхом вдається значно збільшити ефективність їх роботи: проміжні продукти, які утворюються під дією одного ферменту в такій системі відразу ж потрапляють на інший фермент. Це є особливо важливим, коли проміжні продукти нестійкі та легко руйнуються в навколишньому середовищі: у такій системі вони не виходять назовні, а відразу ж перероблюються.

Можна навести низку прикладів, які свідчать про великі можливості інженерної ензимології в різних галузях промисловості, медицини, сільського господарства. Зокрема, іммобілізовану бета-галактозидазу (фермент, який розщеплює лактозу до глюкози й галактози), приєднану до магнітного стрижня-мішалки, використовують для зменшення вмісту лактози в молоці, і таким чином вирішують проблему нестерпності до лактози в деяких людей. Оброблене таким чином молоко в замороженому вигляді зберігається значно довше і не піддається загусненню. За допомогою ферментативної технології отримують продукти харчування, зокрема вуглеводи (крохмаль та глюкозу) із целюлози та ін.

У медичній практиці застосовується препарат «Дальцекс-трипсин», який являє собою лікарську форму трипсину, іммобілізованого на диальдегідцелюлозі і має пролонговану протеолітичну дію, застосовують для очищення гнійних ран та поліпшення процесу їх регенерації. Інший препарат трипсину - «Пакс-трипсин» є іммобілізованим трипсином на полотні трикотажного поліаміду; його використовують як матеріал для перев'язок. Фармпрепарат «Стрептодеказа», створений на основі іммобілізації препарату «Стрептокіназа» (який має тромболітичну активність) на водорозчинній матриці полісахаридної природи, здатний до тривалого існування в системі кровообігу, забезпечуючи пролонговану фібринолітичну дію в крові протягом 48-72 год. «Стрептодеказа» з успіхом застосовується при тромбозах, інфаркті міокарда тощо, має перевагу перед стрептокіназою і фібринолізином, які швидко руйнуються після введення в організм. Після введення стрептодекази, якщо це зробити вчасно, тромб майже безслідно зникає.

Моделювання за допомогою інженерної ензимології процесу фотосинтезу з використанням іммобілізованих ферментів, кофакторів тощо має велике майбутнє. Нині здійснюються роботи з іммобілізації не тільки ферментів, але і кофакторів, гормонів, інгібіторів та інших біологічно активних лікувально-профілактичних засобів з метою доставки їх в організм при захворюваннях, пов'язаних із їх недостатністю або відсутністю. Це усуває дефіцит деяких ферментів в організмі; видаляє вже відмерлі денатуровані структури через дію, головним чином, протеолітичних ферментів (зокрема, трипсину та хімотрипсину); забезпечує лізіс тромбів, детоксикацію організму і т.ін. Іммобілізовані ферменти почали використовуватися в спеціальних колонках для перфузії (очищення) крові типу «штучна нирка», «штучна печінка». Із лікувальною та діагностичною метою використовують іммобілізовані ферменти та інші речовини, введені в напівпроникні (наприклад, поліамідні) мікрокапсули розміром приблизно 200 ммк. У таких напівпроникних капсулах ферменти відносно довго зберігаються і чинять відповідну дію на певні органи, до яких капсула заноситься током крові, тобто певною мірою забезпечується ще й спрямовна доставка ферментів за місцем призначення. Іммобілізовані ферменти застосовуються для отримання амінокислот, гідроксикислот, а також природних речовин із дуже складною структурою, наприклад, стероїдів, порфіринів, алкалоїдів, простагландинів, антибіотиків тощо.

Амінокислоти використовують у медицині, сільському господарстві, прикладній мікробіології і в багатьох галузях науки. Вони необхідні як компоненти харчування при недостатності якої-небудь із природних, особливо незамінних амінокислот, як складова частина внутрішньовенного харчування хворих, для створення лікарських і біологічно активних сполук і т. ін. Усі амінокислоти засвоюються організмом тільки в L-формі (за винятком метіоніну), а надходження до організму L-форми є небажаним. Нижче подано схему безперервного потоку отримання L-амінокислоти L-аланіну та регенерації коферменту в модельній системі, куди вихідний субстрат (молочна кислота) подається за допомогою насоса в камеру-реактор, який містить іммобілізовані на декстрані НАД+ та дві НАД-залежні дегідрогенази: лактат- і аланіндегідроге-нази. Із протилежного кінця реактора продукт реакції L-аланін видаляється із заданою швидкістю методом ультрафільтрації:

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: http://studentus.net/pictures/books/11901.files/image103.jpg

Подібні реактори знайшли застосування у фармацевтичній промисловості, наприклад, під час синтезу глюкокортикоїдного препарату преднізолону з гідрокортизону. Не менш важливим напрямком для медицини є іммобілізація клітин. Як приклад медичного використання досягнень біотехнології можна навести іммобілізацію клітин щитовидної залози для визначення тиреотропного гормону в біорідинах або тканинних екстрактах, отриманих з організму; введення бета-клітин підшлункової залози в організм при діабеті та ін. За допомогою іммобілізованих ферментів здійснюється не тільки промисловий синтез ряду фармпрепаратів, але й розроблені високочутливі методи аналізу ліків, експрес-аналіз біологічних компонентів (автомати для аналізу крові, сечі). Ферменти значно спрощують аналіз крові: якщо для біохімічного аналізу необхідно взяти цілу пробірку крові, то створений останніми роками імуноферментний метод аналізу на базі іммобілізації ферментів обмежується всього однією краплею крові і визначає вміст приблизно 50 речовин одразу. Нині отримані деякі штучні каталізатори, які функціонують за принципом ферментативного каталізу. Вони отримали назву син-зимів. Окремі синзими дуже ефективні, але специфічності ферментів не мають.

 

Конституційні та індуковані ферменти

Ферменти, що постійно зустрічаються в тому чи іншому органі, називаються конституційними. Вони знаходяться практично в усіх клітинах і органах та забезпечують у них синтез білків, нуклеїнових кислот, утворення біологічних мембран та енергетичний обмін. Разом із тим, диференційовані клітини відрізняються між собою за функціями і набором різних ферментів. Наприклад, клітини печінки містять ферменти, завдяки яким відбувається синтез сечовини; клітини кори надниркових залоз мають ферменти, необхідні для синтезу стероїдних гормонів, а в м'язових клітинах є багато креатинфосфокінази. Ферменти, які наявні тільки в одному чи двох органах, називаються органоспецифічними ферментами. Наприклад, уроканіназа наявна тільки в печінці, кисла фосфатаза – переважно в передміхуровій залозі, аргіназа – в печінці. Ці ферменти найчастіше використовуються для діагностики захворювань.

Усередині клітини ферменти також розміщуються нерівномірно. Одні з них перебувають у колоїдно-розчинному стані в складі цитозолю, інші фіксовані в клітинних органелах.

За певних обставин у тварин, рослин і бактерій виявляють нові ферменти, яких переважно немає або є дуже мало. Їх називають адаптивними, бо вони виникають внаслідок пристосування організму до певних умов, або індукованими (від слова індукція – наведення, пуск, введення). Речовини, що викликають утворення таких ферментів, називаються індукторами. Наприклад, при систематичному введенні в кров тварини сахарози тут з'являється фермент сахараза, що роз­щеп­лює цей цукор на два мономери. У нормі в крові цього ферменту немає.

 

РЕГУЛЯЦІЯ ФЕРМЕНТАТИВНИХ ПРОЦЕСІВ

У кожній клітині відбуваються тисячі різних хімічних реакцій, кожна з яких каталізується специфічними ферментами. Як досягається їх гармонійна синхронізація?

Клітина продукує енергію відповідно до потреб, виробляє стільки мономерів, скільки їх необхідно для біосинтезу білків, нуклеїнових кислот, полісахаридів, тобто в нормі в клітинах і в усьому організмі немає нестачі чи надлишку (перевиробництва) продуктів реакцій. У регуляції ферментативних процесів мають значення кілька механізмів:

1. Механізм саморегуляції ферментативних процесів, який базується на негативному або позитивному зворотному зв'язку. Механізм саморегуляції за принципом позитивного (+) зворотного зв'язку проявляється в автокаталітичних і ланцюгових реакціях. Сюди відносяться перетворення проферментів у активні форми ферментів. Так перетворюється пепсиноген у пепсин, трипсиноген – у трипсин тощо.

Зустрічаються два типи такого інгібування: стеричне (конкурентне) й алостеричне. У першому випадку продукт реакції (Р) подібний до субстрату (S) і може конкурувати з ним за активний центр, внаслідок чого реакція сповільнюється. В організмі більш поширені реакції, продукти яких не є подібними за структурою до субстрату. Тут Р-інгібітор діє не на активний центр, а на його віддалену ділянку, що врешті призводить до деформації молекули ферменту, зокрема й активного центру. Як наслідок фермент втрачає здатність приєднувати субстрат і реакція інгібується. Це вже інгібування алостеричне. Більшість регуляторних механізмів грунтується на принципах зворотного від'ємного зв'язку. Прикладом регульованих систем можуть бути поліферментні системи, всі компоненти яких взаємозв'язані. Продукт реакції (Р) може впливати на ферменти клітин опосередковано – через клітинне ядро, яке містить систему синтезу ферментів (нуклеїнові кислоти).

2. Механізм регуляції ферментативних процесів за допомогою клітинних мембран, що регулюють надходження і видалення продуктів реакції. Цей вид регуляції пов'язаний із тим, що ферменти в клітині вмонтовані в мембрани або в певні місця клітини і переміщення речовин до місць їх знаходження регулюється: чим більше надходить субстрату через мембрани, тим більше утворюється продукту. Таким чином, регуляція метаболічних процесів здійснюється не тільки шляхом зміни активності ферментів, але і розподілом субстратів, метаболітів у різних ділянках клітини.

3. Регуляція ферментативних процесів за допомогою аденілатів (АТФ, АДФ, АМФ). Вона характерна для реакцій, пов'язаних з утворенням АТФ. Тобто, якщо АТФ у клітині є багато, то відбувається інгібування ферментів, що прискорюють його синтез (фосфофруктокіназа, ізо­цитратдегідрогеназа, фумараза тощо). Коли концентрація АТФ в клітині низька, а отже, збільшена концентрація АДФ+АМФ, то це активує всі названі вище ферменти.

4. Регуляція шляхом модифікації ферменту. Одним із різновидів модифікації ферментів є їх фосфорилювання-дефосфорилювання. В одних випадках фосфорилювання ферментів призводить до підвищення їх активності, в інших – навпаки. Наприклад, у клітинах жирової тканини є фермент ліпаза, яка може перебувати у двох формах – фосфорильованій і нефосфорильованій. Але фосфорильована ліпаза має значно вищу активність.

Ключові ферменти енергетичного обміну – фосфорилаза і глікогенсинтетаза – також контролюються шляхом фосфорилювання і дефосфорилювання. Це здійснюється специфічними ферментами – протеїнкіназою і протеїнфосфатазою, рівень активності яких регулюється гормонами.

5. Регуляція за допомогою аденілатциклазної системи (рис.7, 8). Важлива роль тут належить аденілатциклазі та протеїнкіназі, що утворюють єдину регуляторну систему (каскад реакцій), необхідну для передачі фізіологічного сигналу з позаклітинного середовища всередину клітини. При цьому виникає цАМФ, який активує протеїнкінази. Протеїнкінази фосфорилюють певні ферменти, що призводить до зміни їх активності.

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Рис. 5-41. Аденилатциклазная система.

Рис. 7. Аденілатциклазна система

6. Гормональна регуляція ферментативних процесів має важливе значення в життєдіяльності клітин і всього організму.

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: http://studentus.net/pictures/books/11901.files/image347.jpg

Рис.8. Гормональна регуляція внутрішньоклітинних процесів

через цАМФ-залежні протеїнкінази (за Маррі Р., Греннером Д., Мейєсом П. та ін.)

 

СПОСОБИ ВИРАЖЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ

 

У біологічних об'єктах ферменти знаходяться в дуже мізерних концентраціях, тому для оцінки ферментативних процесів визначають не вміст ферментів, що пов'язано з великими труднощами, а швидкість каталізованої реакції. Швидкість ферментативної реакції залежить як від активності, так і від кількості ферменту. Дослідження проводять в умовах оптимальної температури (25 °С), рН середовища і повного насичення ферменту субстратом. Швидкість ферментативної реакції оцінюють за кількістю розщепленого субстрату або за кількістю утвореного продукту реакції. За міжнародну одиницю активності ферменту приймається та його кількість, що перетворює один мікромоль субстрату (мкмоль) за одну хвилину в стандартних умовах (МО=мкмоль/хв). Новою міжнародною одиницею активності ферменту є катал (кат.). Він відповідає кількості ферменту, що перетворює 1 моль субстрату в продукт за 1 с (Кат=моль/с). Відношення міжнародної одиниці (МО) до каталу виражається таким чином: 1 кат=1 моль•с-1=60 моль•хв-1=60•106 мкмоль•хв‑1=6•10МО; або МО=1 мкмоль•хв-1=1/60 мкмоль•с-1=1/60 мккат=16,67 нкат. Активність ферментів виражають ще через питому і молекулярну активність. Питома активність ферменту виражається числом одиниць ферментативної активності, що припадає на 1 мг білка. Чим вища питома активність, тим чистіший виділений фермент. Кількість молекул субстрату, що перетворюється однією молекулою ферменту за хвилину, називають сукупністю обертів, або молекулярною активністю ферменту. Наприклад, одна молекула каталази еритроцитів здатна розщепити за 1 хв 5•106 молекул перекису водню (рис. 9).

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQrHLVMZzm1FEsNeh-BDWrzh5NteA4Mr3zWAqiGIQdB0uS98J6qIpR-pdPZ

 

Рис. 9. Шумування каталази при розкладанні перекису водню

 

МЕТОДИ ЯКІСНОГО ВИЯВЛЕННЯ ФЕРМЕНТІВ

 

У тканинах і біологічних рідинах організму ферменти містяться в дуже малих кількостях, що ускладнює їх пряме визначення. Для виявлення ферментів, як правило, застосовують непрямі методи. На наявність ферменту вказує його дія на субстрат, показником якої є зменшення або вичерпання субстрату в результаті його перетворення (розщеплення, окиснення), або поява продуктів реакції.

 

Виявлення каталази в крові. Фермент каталаза відноситься до класу оксидоредуктаз. Міститься вона у всіх тканинах і рідинах організму, але найбільше в стромі еритроцитів і печінці. В процесі окиснення деяких речовин утворюється пероксид водню, який токсичний для організму. Каталаза (Н2О22О2-оксидоредуктаза) розкладає пероксид водню з утворенням води та молекулярного кисню:

каталаза

2 Н2О2-----------------  2 Н2О + О2

 

Принцип методу. При взаємодії каталази крові з пероксидом водню в пробірці виділяються бульбашки кисню, що свідчить про наявність ферменту в досліджуваній рідині.

 

Визначення активності каталази крові. Каталаза (Н2О22О2-оксидоредуктаза) розщеплює пероксид водню з утворенням молекулярного кисню і води:

каталаза

2О2 --------------- О2 + 2Н2О

 

Простетична група каталази побудована за типом гему гемогло-біну. Цей фермент міститься у всіх тканинах організму, але найбільш активний він в еритроцитах і печінці. Біологічна роль каталази полягає в знешкодженні пероксиду водню, який утворюється в процесі окисно-відновних реакцій в організмі. Активність каталази виражають каталазним числом і показником каталази. Каталазним числом називається кількість міліграмів пероксиду водню, яка розкладається каталазою в 1 мкл крові за 30 хв. У нормі воно дорівнює 10-15. Показником каталази називають дріб, в якому чисельником є  каталазне число, а знаменником – число мільйонів еритроцитів в 1 мкл досліджуваної крові.

 

Визначення каталазного числа

Принцип методу. Активність каталази крові визначають за кількістю розкладеного пероксиду водню за одиницю часу. Кількість пероксиду водню визначається титрометричним методом згідно з реакцією:

2 КМnО4+5Н2О2+4Н24-------2КНSО4 + 2МnО4 +8Н2О + 5О2

Різниця кількості КМnО4, використана на титрування до і після дії каталази, характеризує активність ферменту. Більш об’єктивною одиницею є показник каталази, а не каталазне число, так як фермент знаходиться майже виключно в еритроцитах.

Клініко-діагностичне значення. Активність каталази знижується при анемії, туберкульозі, ракових захворюваннях; підвищується за умов токсичного гепатиту, дії іонізуючого випромінювання, солей важких металів.

 

Виявлення пероксидази в крові. До пероксидаз відносяться ферменти, які каталізують окиснення субстратів у присутності пероксиду водню (субстрат: Н2О2-оксидоредуктаза).

Н           Н2О2

Суб. ------------------ суб. окиснений + 2Н2О

Н     пероксидаза

У реакціях виявлення пероксидаз застосовують такі речовини, які змінюють при окисненні своє забарвлення (феноли, поліфеноли, бензидин). Пероксидаза знаходиться головним чином, у рослинах. У тварин вона виявлена в еритроцитах, у молоці.

Принцип методу. Наявність пероксидази в крові виявляється реакцією окиснення бензидину в присутності пероксиду водню. Продукти окиснення бензидину забарвлюються в зелений, синій колір, який поступово переходить у бурий.

 

ВИКОРИСТАННЯ ФЕРМЕНТІВ У МЕДИЦИНІ

В останні роки ферменти набули широкого застосування в практичній і експериментальній медицині. Розрізняють три напрямки використання ферментів у медицині: ензимопатологія, ензимодіаг­ностика й ензи­мотерапія.

Ензимопатологія вивчає стан ферментативної активності в нормі й патології. Встановлено, що багато спадкових захворювань є наслідком дефекту якогось ферменту. Дефектними можуть бути ферменти, що каталізують обмін вуглеводів, ліпідів, амінокислот тощо. Так, галак­тоземія – спадкове захворювання, що проявляється підвищенням концентрації галактози в крові, розвивається внаслідок спадкового дефекту синтезу ключового ферменту – галактозофосфат-уридил-трансферази, який каталізує перетворення галактози в глюкозу. Причиною іншої спадкової хвороби (фенілкетонурії), яка супроводжується розладом психічної діяльності, є втрата клітинами здатності синтезувати фермент, що каталізує перетворення фенілаланіну в тирозин. Зараз виявлено багато форм різних ферментопатій.

Ензимодіагностика широко застосовується в практичній медицині з метою уточнення діагнозу, встановлення ефективності лікування та прогнозу перебігу патологічного стану. В клініці найчастіше вивчають активність ферментів крові, рідше – сечі та інших біологічних рідин. За умов ураження тканин і органів внаслідок порушення проникності клітинних мембран ферменти надходять у кров, що проявляється підвищенням їх активності, яку можна зафіксувати за допомогою специфічних способів. Із метою діагностики захворювань найчастіше вивчають зміни в крові (в основному підвищення) так званих органо­специфічних ферментів або ізоферментів. Для печінки такими фер­мен­тами є аланінамінотрансфераза, гістидаза, орнітинкарбамоїл­транс­фераза, лужна фосфатаза та інші; для діагностики захворювань серця вивчають ферменти аспартатамінотрансферазу, креатинфосфокіназу, лактат­де­гідрогеназу; для діагностики уражень підшлункової залози застосовують дослідження активності альфа-амілази, трансамідинази тощо.

Іноді для більш грунтовного дослідження стану хворого вивчають активність кількох ферментів, зокрема їх ізоформ. Наприклад, для діа­гностики уражень серця і печінки в сироватці крові визначають активність і співвідношення між ізоформами лактатдегідрогенази, аспартат- та аланін-амінотрансферазою (АсАТ і АлАТ). Інфаркт міокарда супрово­джу­ється збільшенням вмісту ізоформ ЛДГ1 і ЛДГ2, а також аспар­тат­аміно­трансферази, тоді як ураження печінки призводить до зростання переважно аланінамінотрансферази та ізоферментів ЛДГ5 і ЛДГ4.

Ферментні препарати використовуються також для визначення вмісту деяких речовин із діагностичною метою. Зокрема, препарат ферменту глюкозооксидази, що окиснює глюкозу киснем повітря, застосовують у клініці для виявлення глюкози в крові й сечі хворих на цукровий діабет. Зараз виготовляють індикаторні папірці (глюкотест), що використовують в експрес-методах для визначення глюкози біля ліжка хворого.

Ензимотерапія проводиться переважно в тих випадках, коли в орга­нізмі не вистачає якогось ферменту чи коферменту або як допоміжний засіб при деяких захворюваннях. Так, нестача ферментів у шлунково-кишковому тракті через зниження секреції травних соків може бути компенсована призначенням хворим препаратів пепсину із соляною кислотою за умов ахілії або препаратів трипсину в капсулах за умов нестачі ферментів підшлункової залози.

Препарати цитохрому с застосовують для лікування хворих, отруєних окисом вуглецю і деякими іншими сполуками, що порушують процеси тканинного дихання. Різні протеолітичні препарати використовують для первинної обробки некротичних ран, опіків, гангренозних уражень з метою розщеплення білків загиблих клітин. Це сприяє очищенню ран і зменшенню запальних явищ. Нуклеази застосовують для лікування деяких вірусних захворювань. Наприклад, для лікування вірусного кон'юнктивіту використовують очні краплі, що містять ДНКазу: фермент руйнує ДНК вірусу і цим виліковує захворювання.

Широко застосовуються протеолітичні ферменти в лікуванні й попередженні тромбозів, тобто закупорень судин згустками крові. Фер­мент аспарагіназу використовують для лікування деяких форм лейкозів. Воно полягає в тому, що амінокислота аспарагін у лейкозних клітинах не синтезується і вони їх одержують із плазми крові. Тому введення хворим аспарагінази призводить до руйнування в крові аспарагіну, пригнічення синтезу білків у лейкозних клітинах, що викликає їх за­гибель. Із метою знешкодження збудників запальних процесів під час лікування ран як зовнішній засіб використовують глюкозооксидазу.

Крім ферментів, у лікувальній практиці застосовують також ко­фер­менти. Наприклад, тіамінпірофосфат (кокарбоксилазу) вводять хворим на серцеві захворювання, нервові розлади тощо. Хворим на серцеві захворювання, м'язові дистрофії, променеву хворобу призначають АТФ, НАД та інші.

Широко застосовують у лікувальній справі інгібітори ферментів. Так, для пригнічення активності протеолітичних ферментів у підшлунковій залозі за умов гострого панкреатиту використовують інгібітор протеаз – трасилол. Природні інгібітори протеаз застосовують також у лікуванні алергічних захворювань, гострих артритів, при яких спостерігається активація протеолізу і фібринолізу, що супроводжується утворенням вазоактивних кінінів. Використовуються й інгібітори амінооксидаз, які, інгібуючи моноамінооксидази, сприяють збереженню потрібної кількості моноамінів.

 

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ФЕРМЕНТІВ У БІОЛОГІЧНИХ РІДИНАХ

В основі багатьох захворювань лежать порушення нормального функціонування ферментативних процесів. Зміни в специфічних ферментативних реакціях можна кваліфікувати як причину або наслідок різних патологічних станів.

Більшість ферментів, що каталізують хімічні реакції, знаходяться в клітинах. Проте на основі результатів аналізів позаклітинних рідин (плазми, сироватки крові, сечі та ін.) можна зробити  висновок про зміни, що відбуваються всередині клітин різних органів та тканин.

Кількість ферменту визначають за його дією на субстрат і називають активністю. Про активність ферментів свідчать такі критерії:

а) кількість субстрату, перетвореного в одиницю часу за постійних умов;

б) кількість кінцевих продуктів реакції, що утворилися в одиницю часу за постійних умов;

в) час який, необхідний для перетворення певної кількості субстрату за постійних умов. З цією метою використовують різні методи дослідження: спектрофотометричні, полярографічні, манометричні, хроматографічні та ін.

Мірою активності ферментів є умовні одиниці:

1. За міжнародну одиницю (МО) прийнята така кількість ферменту, яка  каталізує перетворення 1 мкМ субстрату за 1 хв.

2. Катал – це кількість ферменту, яка каталізує перетворення 1 моля субстрату за 1 с (6 ´107МО).

3. Молекулярна активність показує, скільки молекул субстрату перетворюється однією молекулою ферменту за 1 хв.

4. Питома активність – це число одиниць ферменту, яке припадає на 1 мг білка ферментного препарату (або число каталів на 1 кг активного білка).

 

Визначення активності амілази (діастази) сечі за методом Вольгемута. Амілаза – один із екскреторних ферментів, які всмоктуються в кров з тонкого кишечника і виділяються з сечею як низькомолекулярні білки. У нормі діастаза сечі, визначена за Вольгемутом, дорівнює 16-64 одиницям. Цей показник широко використовується в клінічній практиці з діагностичною метою.

Принцип методу. Метод грунтується на визначенні мінімальної кількості амілази, яка здатна розщепити задану кількість крохмалю протягом певного часу за стандартних умов. За одиницю діастази прийнята кількість мл 0,1% розчину крохмалю, яку може розщепити амілаза в 1 мл сечі при t0 450 С за 15 хв.

 

Визначення активності амілази сечі за методом Каравея

Принцип методу. Метод оснований на колориметричному визначенні залишку нерозщепленого крохмалю за інтенсивністю його забарвлення з йодом. За одиницю діастази сечі прийнята кількість грамів крохмалю, розщепленого амілазою в 1 л сечі за 1 год. У нормі вона дорівнює 20-160 г/л год.

 

Визначення активності амілази у сироватці крові за методом Каравея

Принцип методу. Принцип методу аналогічний, як методу визначення амілази в сечі. За одиницю діастази крові прийнята кількість мг крохмалю, гідролізованого 1 мл сироватки за 1 год. У нормі вона дорівнює 12-30 мг/мл год (або г/л год).

Клініко-діагностичне значення. Визначення активності α-амілази крові й сечі широко використовується у клінічній практиці з метою діагностики захворювань підшлункової залози. При гострих панкреатитах діастаза зростає в 10-30 разів, особливо у першу добу, потім поступово нормалізується. Хронічний панкреатит, рак підшлункової залози не супроводжуються різким підвищенням діастази. Деяке зростання активності амілази може супроводжувати паротит у дітей. При нирковій недостатності амілаза в сечі відсутня.