Медицина

БІОСИНТЕЗ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДІВ

МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ РЕПЛІКАЦІЇ ДНК. ТРАНСКРИПЦІЯ – БІОСИНТЕЗ РНК. БІОСИНТЕЗ БІЛКА В РИБОСОМАХ. ЕТАПИ ТА МЕХАНІЗМ ТРАНСЛЯЦІЇ, РЕГУЛЯЦІЯ ТРАНСЛЯЦІЇ. АНТИБІОТИКИ – ІНГІБІТОРИ ТРАНСКРИПЦІЇ ТА ТРАНСЛЯЦІЇ

 

СТРУКТУРА НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

 

 

 

Історія дослідження

ДНК була відкрита Іоганном Фрідріхом Мішером у 1869 році. Спочатку нова речовина отримала назву нуклеїн, а пізніше, коли Мішер визначив, що ця речовина володіє кислотними властивостями, речовина отримала назву нуклеїнова кислота. Біологічна функція нововідкритої речовини була неясна, і довгий час ДНК вважалася запасником фосфору в організмі. Більш того, навіть на початку 20 століття багато біологів вважали, що ДНК не має ніякого відношення до передачі інформації, оскільки будова молекули, на їхню думку, була дуже одноманітною і не могла містити закодовану інформацію.

 

Іоганн Фрідріх Мішер

 

Поступово було доведено, що саме ДНК, а не білки, як вважалося раніше, є носієм генетичної інформації. Одними з перших вирішальних доказів стали експерименти О. Евері, Коліна Мак-Леода і Маклін Мак-Карті (1944 рік) з трансформації бактерій. Їм вдалося показати, що за так звану трансформацію (придбання хвороботворних властивостей нешкідливою культурою у результаті додавання до неї мертвих хвороботворних бактерій) відповідає виділена з пневмококів ДНК. Експеримент американських учених Алфреда Хершу і Марти Чейз (1952 рік) з міченими радіоактивними ізотопами білками і ДНК бактеріофагів показали, що в заражену клітку передається тільки нуклеїнова кислота фага, а нове покоління фага містить такі ж білки і нуклеїнову кислоту, як і початковий фаг.

До 50-х років 20 століття точна будова ДНК, як і спосіб передачі спадкової інформації, залишалася невідомою. Хоч і було напевно відомо, що ДНК складається з кількох ланцюжків, що у свою чергу складаються з нуклеотидів, ніхто не знав точно, скільки цих ланцюжків і як вони сполучені.

Структура подвійної спіралі ДНК була запропонована Френсісом Кріком і Джеймсом Ватсоном у 1953 році на основі рентгеноструктурних даних, отриманих Морісом Вілкінсом і Розаліндою Франклін, і «правил Чаргаффа», згідно з якими в кожній молекулі ДНК дотримуються строгі співвідношення, що зв'язують між собою кількість азотистих основ різних типів. Пізніше запропонована Ватсоном і Кріком модель будови ДНК була доведена, а їхня робота відмічена Нобелівською премією з фізіології і медицини 1962 року. Серед одержувачів не було Розалінди Франклін, що померла на той час, оскільки премія не присуджується посмертно.

У відомій доповіді 1957 року, Крік окреслив основи так званої «Центральної догми» молекулярної біології, яка передбачає взаємовідношення між ДНК, РНК і білками, та сформулював «адаптерну гіпотезу». Остаточне підтвердження механізму копіювання, запропонованого на основі спіральної структури, було отримане в 1958 році за допомогою експерименту Мезельсона-Сталя. Подальші роботи Кріка і його лабораторії показали, що генетичний код засновується на трійках основ, що не перекриваються, кодонах, що пізніше дозволило Гару Ґобінду Хорані, Роберту Голлі і Маршаллу Ніренбергу розшифрувати генетичний код. Ці відкриття позначають початок молекулярної біології.

Значення РНК в синтезі білків було припущено в 1939 році в роботі Торберна Оскара Касперсона, Жана Брачета і Джека Шульца . Джерард Маірбакс виділив першу матричну РНК, що кодує гемоглобін кролика і показав, що при її введені в ооцити утворюється той же самий білок. У Радянському Союзі в 1956-57 роках проводилися роботи (А. Білозерський, О. Спірін, Е. Волкін, Ф. Астрахан) з визначення складу РНК клітин, які привели до висновку, що основну масу РНК в клітині становлять рибосомні РНК. Северо Очоа отримав Нобелівську премію з медицини в 1959 році за відкриття механізму синтезу РНК. Послідовність з 77 нуклеотидів однієї з тРНК дріжджів S. cerevisiae була визначена в 1965 році в лабораторії Роберта Холі, за що в 1968 році він отримав Нобелівську премію з медицини. У 1967 Карл Воуз припустив, що РНК мають каталітичні властивості. Він висунув так звану Гіпотезу РНК-світу, в якому РНК прото-організмів служила і як молекули зберігання інформації (зараз ця роль виконується ДНК) і молекули, яка каталізувала метаболічні реакції (зараз це роблять ферменти). У 1976 Уолтер Фаерс і його група з Гентського університету (Голландія) визначили першу послідовність геному РНК- яке міститься у вірусі, бактеріофага MS2. На початку 1990-х було виявлено, що введення чужорідних генів у геном рослин призводить до придушення вираження аналогічних генів рослини. Приблизно в цей же час було показано, що РНК довжиною близько 22 підстав, які зараз називаються мікро-РНК, відіграють регуляторну роль в онтогенезі нематод C.elegans. Гіпотеза про значення РНК в синтезі білків була висловлена Торбьерном Касперссоном (Torbjörn Caspersson) на основі досліджень 1937-1939 рр., В результаті яких було показано, що клітини, що активно синтезують білок, містять велику кількість РНК. Підтвердження гіпотези було отримано Юбером Шантренне (Hubert Chantrenne).

 

Нуклеїнові кислоти — складні високомолекулярні біополімери, мономерами яких є нуклеотиди. Природні нуклеїнові кислоти — ДНК і РНК — виконують у всіх живих організмах роль передачі і експресії генетичної інформації. Даний термін був введений Рихардом Альтманом. Вперше їх виявлено в ядрі клітини, звідки й походить назва цих сполук (від лат. нуклеус — ядро).

Структурними одиницями нуклеїнових кислот є нуклеотиди. Молекула нуклеотиду складається із залишків нітратної основи, п'ятивуглецевого моносахариду (пентози) і фосфатної кислоти. Залежно від виду пентози, що входить до складу нуклеотиду, їх поділяють на дезоксирибонуклеїнову (ДНК) та рибонуклеїнову (РНК).

 

Схема будови нуклеотиду (1); формули рибози і дезоксирибози (2)

Дезоксирибонуклеї́нова кислота́ (ДНК) — один із двох типів природних нуклеїнових кислот, який забезпечує зберігання, передачу з покоління в покоління і реалізацію генетичної програми розвитку й функціонування живих організмів. Основна роль ДНК в клітинах — довготривале зберігання інформації про структуру РНК і білків.

Біологічні функції ДНК

Збереження спадкової інформації.

 

Кількість ДНК у соматичних та статевих клітинах організму людини є сталою величиною, яку ці клітини отримують у процесах запліднення батьківських гамет та подальшого поділу зиготи.

2. Передавання генетичної інформації нащадкам.

Подвоєння молекул ДНК у процесі реплікації та передавання нащадкам копій материнських молекул є основою консерватизму спадковості, збереження протягом багатьох поколінь основних біологічних ознак виду.

3. Реалізація генетичної інформації.

Ця біологічна функція здійснюється за рахунок передачі закодованої в ДНК інформації молекулам інформаційних (матричних) РНК (транскрипції) та подальшої розшифровки цієї інформації при синтезі білків (трансляції).

Сукупність зазначених біологічних функцій ДНК та механізмів їх реалізації отримала назву — центральна догма молекулярної біології (Ф.Крік)

 

У клітинах еукаріотів (наприклад, тварин, рослин або грибів) ДНК знаходиться в ядрі клітини в складі хромосом, а також в деяких клітинних органелах (мітохондріях і пластидах). У клітинах прокаріотів (бактерій і архей) кільцева або лінійна молекула ДНК, так званий нуклеоїд, знаходиться в цитоплазмі і прикріплена зсередини до клітинної мембрани. У них і у нижчих еукаріот (наприклад дріжджів) зустрічаються також невеликі автономні кільцеві молекули ДНК, так звані плазміди. Крім того, одно- або дволанцюжкові молекули ДНК можуть утворювати геном ДНК-вірусів.

З хімічної точки зору, ДНК це довга полімерна молекула, що складається з послідовності блоків нуклеотидів. Кожний нуклеотид складається з азотистої основи, цукру (дезоксирибози) і фосфатної групи (або гомологічної арсеноїдної). Зв'язки між нуклеотидами в ланцюжку утворюються за рахунок дезоксирибози і фосфатної групи. У переважній більшості випадків (окрім деяких вірусів, що містять одноланцюжкові ДНК) макромолекула ДНК складається з двох ланцюжків, орієнтованих азотистими основами один проти одного. Ця дволанцюжкова молекула утворює спіраль. В цілому структура молекули ДНК отримала назву «подвійної спіралі».

У ДНК зустрічається чотири види азотистих основ (аденін, гуанін, тимін і цитозин) (виняток становлять випадки пізніших модифікацій нуклеотидів, наприклад метилювання). Азотисті основи одного з ланцюжків сполучені з азотистими основами іншого ланцюжка водневими зв'язками згідно з принципом комплементарності: аденін з'єднується тільки з тиміном, гуанін тільки з цитозином. Послідовність нуклеотидів дозволяє «кодувати» інформацію про різні типи РНК, найважливішими з яких є інформаційні, або матричні (мРНК), рибосомальні (рРНК) і транспортні (тРНК). Всі ці типи РНК синтезуються на матриці ДНК (тобто за рахунок копіювання послідовності ДНК у послідовність макромолекули, що синтезується) у процесі транскрипції і беруть участь у біосинтезі білків (процесах сплайсингу і трансляції). Крім кодуючих послідовностей, ДНК клітини містить послідовності, що виконують регуляторні і структурні функції. Ділянки кодуючої послідовності разом із регуляторними ділянками називаються генами.

 

 

Основи, що входять до складу нуклеотидів, розділяють на дві групи

 

Пуринові основи нуклеїнових кислот

Піримідинові основи нуклеїнових кислот

аденін [A] і гуанін [G], утворені сполученими п'яти- і шестичленним гетероциклами

урацил [У], цитозин [C] і тимін [T] — утворені одним шестичленним гетероциклом

 

Як виняток, наприклад, у бактеріофага PBS1, в ДНК зустрічається п'ятий тип основ урацил (U), піримідинова основа, що зазвичай входить до складу РНК замість тиміну і відрізняється від тиміну відсутністю метильної групи на кільці. Слід зазначити, що тимін і урацил не так строго приурочені до ДНК і РНК відповідно, як це вважалося раніше. Так, після синтезу деяких молекул РНК значне число урацилів у цих молекулах метилюєтся за допомогою спеціальних ферментів, перетворюючись на тимін. Це відбувається в транспортних і рибосомних РНК.

 

Нуклеотиди — трикомпонентні сполуки, які побудовані з азотистої основи пуринового чи піримідинового ряду, залишків пентоз (рибози або дезоксирибози) та фосфату.

Структури гетероциклічних основ і аденозинмонофосфату (AMФ)

 

 

Adenine chemical structure.png

Guanine chemical structure.png

Thymine chemical structure.png

Cytosine chemical structure.png

AMP chemical structure.png

аденін

гуанін

тимін

цитозин

аденозинмонофосфат

 

 

 

Нуклеозиди складаються з азотистої основи і пентози

 

нуклеозиди є N-глікозидами рибози або дезоксирибози та відповідної азотистої основи

 

Хімічна структура подвійної спіралі ДНК.

Полімер ДНК має досить складну структуру. Нуклеотиди ковалентно сполучені між собою в довгі полінуклеотидні ланцюжки. Ці ланцюжки в переважній більшості випадків (окрім деяких вірусів, що мають одноланцюжковий ДНК-геном), у свою чергу, попарно об'єднуються за допомогою водневих зв'язків у структуру, що отримала назву подвійної спіралі. Фосфатні групи формують фосфодіестерні зв'язки між третім і п'ятим атомами вуглецю сусідніх молекул дезоксирибози, в результаті взаємодії між 3-гідроксильною (3 —ОН) групою однієї молекули дезоксирибози і 5-фосфатною групою (5 —РО3) іншої. Асиметричні кінці ланцюжка ДНК називаються 3' (три-прайм) і 5' (п'ять-прайм). Полярність ланцюжка грає важливу роль при синтезі ДНК (подовження ланцюжка можливе тільки шляхом приєднання нових нуклеотидів до вільного 3' кінця).

Кожна основа на одному з ланцюжків зв'язується з однією певною основою на іншому ланцюжку. Таке специфічне зв'язування називається комплементарним. Пуринові основи комплементарні піримідиновим (тобто, здатні до утворення водневих зв'язків з ними): аденін утворює зв'язки тільки з тиміном, а цитозин — з гуаніном. У подвійній спіралі ланцюжки також зв'язані за допомогою гідрофобної взаємодії і стекінгу, які не залежать від послідовності основ ДНК.

 

 

Комплементарність подвійної спіралі означає, що інформація, що міститься в одному ланцюжку, міститься і в іншому ланцюжку. Оборотність і специфічність взаємодій між комплементарними парами основ важлива для реплікації ДНК і решти всіх функцій ДНК в живих організмах.

Оскільки водневі зв'язки нековалентні, вони легко розриваються і відновлюються. Ланцюжки подвійної спіралі можуть розходитися як замок-змійка під дією ферментів (гелікази) або при високій температурі.

Різні пари основ утворюють різну кількість водневих зв'язків. A-T зв'язані двома, G-C — трьома водневими зв'язками, тому на розрив GC потрібно більше енергії. Відсоток GC пар і довжина молекули ДНК визначають кількість енергії, необхідної для дисоціації ланцюжків: довгі молекули ДНК з великим вмістом GC більш «тугоплавкі».

 

Вторинна структураДНК

Всі ДНК мають певні кількісні взаємовідносини між вмістом пуринових та піримідинових нуклеотидів. Згідно з цими закономірностями (правилами Чаргафа),у складі ДНК:

1

сума пуринових основ дорівнює сумі піримідинових основ, тобто:

А + Г = Т + Ц

2

кількість 6-аміногруп дорівнює кількості 6-кетогруп (за хімічною номенклатурою Фішера)

3

вміст аденіну дорівнює вмісту тиміну, а вміст гуаніну дорівнює вмісту цитозину

(правило еквівалентності):

А = Т, Г = Ц.

Згідно з моделлю Уотсона-Кріка, молекула ДНК складається з двох ланцюгів, що утворюють правообертаючу спіраль, в якій обидва полінуклеотидні ланцюги закручені навколо центральної осі; при цьому два полінуклеотидні ланцюги в молекулі ДНК антипаралельні

 

ДНК в клітині знаходиться в складі хроматину. Хроматин – ДНК плюс різні білки

Гістони – основні білки хроматину. ДНК упаковується закручуючись в соленоїдну структуру

 

 

Будова хроматину.

 

 

Фізико-хімічні властивості ДНК

Реакційноздатність

Завдяки кислотним властивостям і наявності на своїй поверхні негативних зарядів молекули ДНК при фізіологічних значеннях рН активно реагують і утворюють комплекси з катіонами:

– поліамінами (спермідином, сперміном);

– основними білками (гістонами, протамінами);

– катіонами металів (Са2+, Mg2+, Fe2+).

В’язкість

Висока молекулярна маса і велика довжина молекул ДНК зумовлюють високу в’язкість навіть дуже розбавлених їх розчинів. В’язкість молекул ДНК у розчині залежить від їх конформації і суттєво змінюється за умов денатурації та рена-

турації (див. нижче), що дозволяє використовувати віскозиметричні методи для дослідження кінетики цих процесів.

Оптична активність

Завдяки впорядкованій вторинній структурі молекули ДНК є оптично активними, тобто вони здатні обертати площину поляризованого світла. Оптична активність розчинів ДНК також застосовується з метою реєстрації конформаційних змін молекул.

Поглинання в УФ-ділянці

Азотисті сполуки (та відповідні нуклеотиди), що входять до складу нуклеїнових кислот ДНК і РНК, мають властивість поглинати ультрафіолетове світло при 260 нм.

За умов утворення полінуклеотидів взаємний вплив паралельно розташованих по довжині молекули ДНК пар азотистих основ супроводжується певним зниженням УФ-поглинання. Таким чином, поглинання при 260 нм нативної молекули ДНК дещо

нижче (в середньому на 40 %) від відповідного поглинання суми азотистих основ, що входять до складу полінуклеотиду — гіпохромний ефект. При порушенні  високовпорядкованої двоспіральної конформації ДНК та структурних взаємовідносин

між азотистими основами спостерігається гіперхромний ефект, тобто зростання поглинання розчинів молекул ДНК при 260 нм, що дозволяє досліджувати процесс денатурації.

Денатурація

Денатурація ДНК — це порушення нативної двоспіральної конформації молекул ДНК та їх упорядкованого просторового розташування з утворенням невпорядкованих одноланцюгових клубків. За умов денатурації ковалентні зв’язки в ДНК зберігаються, проте відбувається розкручування подвійної спіралі з втратою специфічних взаємодій між азотистими основами.

Ренатурація — відновлення нативної вторинної конформації ДНК, що спостерігається за певних умов.

 

Молекулярною основою денатурації молекул ДНК є руйнування водневих зв’язків між комплементарними азотистими основами  АТ та ГЦ, відповідно.

 

 

РНК (рибонуклеїнова кислота) — клас нуклеїнових кислот, лінійних полімерів нуклеотидів, до складу яких входять залишок фосфорної кислоти, рибоза (на відміну від ДНК, що містить дезоксирибозу) і азотисті основи — аденін, цитозин, гуанін і урацил (на відміну від ДНК, що містить замість урацила містить тимін). РНК містяться головним чином в цитоплазмі клітин. Ці молекули синтезуються в клітинах всіх клітинних живих організмів, а також містяться в віроїдах та деяких вірусах. Основні функції РНК в клітинних організмах — шаблон для трансляції генетичної інформації в білки та поставка відповідних амінокислот до рибосом. В вірусах є носієм генетичної інформації (кодує білки оболонки та ферменти вірусів). Віроїди складаються з кільцевої молекули РНК та не містять в собі інших молекул. Існує гіпотеза світу РНК, згідно з якою, РНК виникли до білків й були першими формами життя.

Клітинні РНК утворюються в ході процесу, що зветься транскрипцією, тобто синтезу РНК на матриці ДНК, що здійснюється спеціальними ферментами - РНК-полімерази. Потім матричні РНК (мРНК) беруть участь у процесі, що називається трансляцією. Трансляція - це синтез білка на матриці мРНК за участю рибосом. Інші РНК після транскрипції піддаються хімічним модифікаціям, і після утворення вторинної та третинної структур виконують функції, що залежать від типу РНК.

Для одноланцюжкових РНК характерні різноманітні просторові структури, в яких частина нуклеотидів одного і того ж ланцюга спарені між собою. Деякі високо структуровані РНК беруть участь у синтезі білка клітини, наприклад, транспортні РНК служать для впізнавання кодонів та доставки відповідних амінокислот до місця синтезу білка, а матричні РНК служать структурною і каталітичною основою рибосом.

Однак функції РНК в сучасних клітинах не обмежуються їх роллю в трансляції. Так малі ядерні РНК беруть участь у сплайсингу еукаріотичних матричних РНК та інших процесах.

Крім того, що молекули РНК входять до складу деяких ферментів (наприклад, теломерази) у окремих РНК виявлена власна ензиматична активність, здатність вносити розриви в інші молекули РНК або, навпаки, «склеювати» два РНК-фрагмента. Такі РНК називаються рибозимами. Геноми ряду вірусів складаються з РНК, тобто у них вона відіграє роль, яку у вищих організмів виконує ДНК. На підставі різноманітності функцій РНК в клітині була висунута гіпотеза, згідно з якою РНК - перша молекула, здатна до самовідтворення в добіологічних системах.

Нуклеотиди РНК складаються з цукру - рибози, до якої в положенні 1 'приєднана одна з основ: аденін, гуанін, цитозин або урацил. Фосфатна група поєднує рибози в ланцюжок, утворюючи зв'язок з 3 'атомом вуглецю однієї рибози і атомом вуглецю в 5' положенні іншого. Фосфатні групи при фізіологічному рН негативно заряджені, тому РНК - поліаніон. РНК транскрибується як полімер чотирьох основ (аденіну (A), гуаніну (G), урацилу (U) і цитозину (C)), але в «зрілої» РНК є багато модифікованих основ і цукрів. Всього в РНК налічується близько 100 різних видів модифікованих нуклеозидів, з яких 2'-О-метилрибоза найбільш часта модифікація цукру, а псевдоуридин - модифікована основа , що найбільш часто зустрічається.

 У псевдоуридину (Ψ) зв'язок між урацилом і рибозою не C - N, а C - C, цей нуклеотид зустрічається в різних положеннях у молекулах РНК. Зокрема, псевдоуридин важливий для функціонування тРНК. Інша модифікована основа - гіпоксантин, дезамінований гуанін, нуклеозид якого носить назву інозину. Інозин відіграє важливу роль у забезпеченні виродженності генетичного коду. Роль багатьох інших модифікацій не до кінця вивчена, але в рибосомальної РНК багато посттранскрипційних модифікацій знаходяться у важливих для функціонування рибосоми ділянках. Наприклад, на одному з рибонуклеотидів, що беруть участь в утворенні пептидного зв'язку.

 

Будова РНК на прикладі тетрануклеотиду,

що містить аденін(A), цитозин (C), гуанін(G) і урацил (U).

 

Особливості будови РНК

Нуклеотиди РНК складаються з цукру - рибози, до якої в положенні 1 'приєднана одна з основ: аденін, гуанін, цитозин або урацил. Фосфатна група поєднує рибози в ланцюжок, утворюючи зв'язок з 3 'атомом вуглецю однієї рибози і атомом вуглецю в 5' положенні іншого. Фосфатні групи при фізіологічному рН негативно заряджені, тому РНК - поліаніон. РНК транскрибується як полімер чотирьох основ (аденіну (A), гуаніну (G), урацилу (U) і цитозину (C)), але в «зрілої» РНК є багато модифікованих основ і цукрів. Всього в РНК налічується близько 100 різних видів модифікованих нуклеозидів, з яких 2'-О-метилрибоза найбільш часта модифікація цукру, а псевдоуридин - модифікована основа , що найбільш часто зустрічається. У псевдоуридину (Ψ) зв'язок між урацилом і рибозою не C - N, а C - C, цей нуклеотид зустрічається в різних положеннях у молекулах РНК. Зокрема, псевдоуридин важливий для функціонування тРНК. Інша модифікована основа - гіпоксантин, дезамінований гуанін, нуклеозид якого носить назву інозину. Інозин відіграє важливу роль у забезпеченні виродженності генетичного коду. Роль багатьох інших модифікацій не до кінця вивчена, але в рибосомальної РНК багато посттранскрипційних модифікацій знаходяться у важливих для функціонування рибосоми ділянках. Наприклад, на одному з рибонуклеотидів, що беруть участь в утворенні пептидного зв'язку.

БУДОВА, ВЛАСТИВОСТІ Й БІОЛОГІЧНІ ФУНКЦІЇ РНК

Рибонуклеїнові кислоти — полірибонуклеотиди, що в клітинах еукаріотів та прокаріотів за характером своєї структури та біологічних функцій поділяються на такі основні класи: інформаційні (матричні) РНК (мРНК), транспортні РНК (тРНК), рибосомні РНК (рРНК).

Інформаційні (матричні) РНК

Це клас РНК, що складають 2-5 % загальної кількості клітинної РНК. мРНК виконують функцію переносників генетичної інформації від геному (ядерної ДНК) до білоксинтезуючої системи клітини.

мРНК властиві метаболічна нестабільність і найбільша гетерогенність молекулярної маси та розмірів молекул (від 25·103 до 1-2·106) з константами седиментації від 6 до 25 s.

Широкий спектр окремих молекул мРНК відповідає кількості білків організму, носіями генетичної інформації для синтезу яких є РНК цього класу.

За своїм нуклеотидним складом мРНК відповідає (з урахуванням принципу комплементарності) нуклеотидній послідовності фрагмента одного з ланцюгів ядерної ДНК, транскриптом якого вона (мРНК) є.

5'-кінець усіх молекул мРНК еукаріотів та деяких вірусів в якості першого нуклеотиду містить 7-метилгуанозин (перший нуклеотид). Модифікований 7-метилгуанозином 5'-кінець мРНК має назвукепа”.

3'-кінець багатьох мРНК еукаріотів містить відносно довгі поліаденілатні (poly(A)) послідовності. До складу poly(A)-“хвостівмРНКвходять 20-250 нуклеотидів.

Транспортні РНК

На тРНК припадає 10-20 % клітинної РНК. Їх молекули — це полірибонуклеотидні ланцюги, довжина яких — 70-90 нуклеотидів. Молекулярна маса тРНК — (23-28)·103 кД, константа седиментації — 4 s.

Усього в клітинах знаходиться не менше 20 типів тРНК, що відповідає кількості природних L-амінокислот, з якими тРНК взаємодіють у ході трансляції.

Первинна структура тРНК відзначається великою кількістю мінорних нуклеотидівнаявністю метильованих, псевдоуридилових та дигідроуридилових залишків.

Вторинна структура молекул тРНК у двомірному просторі має конформаціюлистка конюшини”, що утворюється за рахунок специфічної взаємодії комплементарних азотистих основ упродовж полірибонуклеотидного ланцюга.

Неспарені нуклеотидні послідовності формують специфічні для будови тРНК структурні елементи:

Акцепторну гілку (стебло)

Антикодонову петлю

Дигідроуридилову петлю

Псевдоуридилову петлю

Додаткову гілку

Рибосомні РНК

Рибосомні РНК (рРНК) — клас клітинних РНК, що входять до складу рибосом прокаріотичних та еукаріотичних клітин. На рРНК припадає до 90 % загальної кількості клітинних РНК.

рРНК разом із специфічними білками становлять основу структури та функції рибосом (рибонуклеопротеїнових часточок), в яких відбувається процес трансляції

Рибонуклеїнові кислоти цього типу є метаболічно стабільними молекулами; взаємодіючи з рибосомними білками, вони виконують функцію структурного каркаса для організації внутрішньоклітинної системи білкового синтезу.

Модифікованих (мінорних) основ у складі рРНК значно менше, ніж у тРНК. Проте рибосомні РНК є також високометильованими полірибонуклеотидами, в яких метильні групи звязані або з азотистими основами, або з

 2'-гідроксильними групами рибози.

Азотисті основи у складі РНК можуть утворювати водневі зв'язки між цитозином і гуаніном, аденін і урацилом, а також між гуаніном і урацилом. Однак можливі й інші взаємодії, наприклад, кілька аденінів можуть утворювати петлю, або петля, що складається з чотирьох нуклеотидів, в якій є пара основ аденін - гуанін.

Важлива структурна особливість РНК, що відрізняє її від ДНК - наявність гідроксильної групи в 2 'положенні рибози, яка дозволяє молекулі РНК існувати в А, а не В-конформації, що найчастіше спостерігається у ДНК. У А-форми глибока і вузька велика борозенка і неглибока і широка мала борозенка. Другий наслідок наявності 2 'гідроксильної групи полягає в тому, що конформаційної пластичні, тобто не беруть участь в утворенні подвійної спіралі, ділянки молекули РНК можуть хімічно атакувати інші фосфатні зв'язку та їх розщеплювати. «Робоча» форма одноланцюжкові молекули РНК, як і у білків, часто володіє третинною структурою. Третинна структура утворюється на основі елементів вторинної структури, що утворюється за допомогою водневих зв'язків усередині однієї молекули. Розрізняють декілька типів елементів вторинної структури - стебло-петлі, петлі і псевдовузли. У силу великої кількості можливих варіантів спарювання підстав передбачення вторинної структури РНК - набагато складніше завдання, ніж передбачення вторинної структури білків, але в наш час є ефективні програми, наприклад, mfold.

Прикладом залежності функцій молекул РНК від їх вторинної структури є ділянки внутрішньої посадки рибосоми (IRES). IRES - структура на 5 'кінці інформаційної РНК, яка забезпечує приєднання рибосоми в обхід звичайного механізму ініціації синтезу білка, що вимагає наявності особливого модифікованого підстави (кепа) на 5' кінці і білкових факторів ініціації. Спочатку IRES були виявлені у вірусних РНК, але зараз накопичується все більше даних про те, що клітинні мРНК також використовують IRES-залежний механізм ініціації в умовах стресу. Багато типів РНК, наприклад, рРНК і мяРНК (малі ядерні РНК) в клітині функціонують у вигляді комплексів з білками, які ассоціюють з молекулами РНК після їх синтезу або (у еукаріотів) експорту з ядра в цитоплазму. Такі РНК-білкові комплекси називаються рибонуклеопротеїновими комплексами або рибонуклеопротеїдами.

Матрична рибонуклеїнова кислота (мРНК, синонім - інформаційна РНК, іРНК) відповідає за перенесення інформації про первинну структуру білків від ДНК до місць синтезу білків мРНК синтезується на основі ДНК в ході транскрипції, після чого, у свою чергу, використовується під час трансляції як матриця для синтезу білків. Тим самим мРНК грає важливу роль в «прояві» (експресії) генів.

 

 

 

Основні етапи життєвого циклу мРНК еукаріотів

Довжина типової зрілої мРНК складає від кількох сотень до кількох тисяч нуклеотидів. Найдовші мРНК відмічені у РНК-вмісних вірусів, проте слід пам'ятати, що у цих вірусів мРНК утворює весь їхній геном.

ДНК нерідко порівнюють з кресленнями для виготовлення білків. Розвиваючи цю інженерно-виробничу аналогію, можна сказати, що, якщо ДНК - це повний набір креслень для виготовлення білків, що знаходиться на зберіганні в сейфі директора заводу, то мРНК - тимчасова робоча копія креслення, що видається в складальний цех.

Однак переважна більшість РНК не кодують білок. Ці некодуючі РНК можуть транскрибувати з окремих генів (наприклад, рибосомальні РНК) або бути похідними інтронів. Класичні, добре вивчені типи некодуючих РНК - це транспортні РНК (тРНК) і рРНК, які беруть участь у процесі трансляції. Існують також класи РНК, відповідальні за регуляцію генів, процесинг мРНК і інші ролі. Крім того, є й молекули некодуючих РНК, здатні каталізувати хімічні реакції, такі, як розрізання та лігірування молекул РНК. За аналогією з білками, здатними каталізувати хімічні реакції - ензимами (ферментами), каталітичні молекули РНК називаються рибозимами.

Транспортні (тРНК) - малі, що складаються з приблизно 80 нуклеотидів, молекули з консервативною третинною структурою. Вони переносять специфічні амінокислоти до місця синтезу пептидного зв'язку в рибосомі. Кожна тРНК містить ділянку для приєднання амінокислоти і антикодон для пізнавання та приєднання до кодону мРНК. Антикодон утворює водневі зв'язки з кодоном, що поміщає тРНК в положення, що сприяє утворенню пептидного зв'язку між останньою амінокислотою утвореного пептиду і амінокислотою, приєднаною до тРНК.

Рибосомальні РНК (рРНК) - каталітична складова рибосом. Еукаріотичні рибосоми містять чотири типи молекул рРНК: 18S, 5.8S, 28S і 5S. Три з чотирьох типів рРНК синтезуються в полісом.

У цитоплазмі рибосомальні РНК з'єднуються з рибосомальними білками і формують нуклеопротеїн, званий рибосомою. Рибосома приєднується до мРНК і синтезує білок. рРНК складає до 80% РНК, що виявляється в цитоплазмі еукаріотичної клітини.

Схема будови транспортної РНК

А, Б, В, Г - ділянки, у яких комплементарні нуклеотиди сполучаються за допомогою водневих зв 'язків; Ґ - антикодон; Д - ділянка, до якої прикріплюється амінокислота

Незвичайний тип РНК, який діє в якості тРНК і мРНК (тмРНК) виявлений у багатьох бактеріях і пластидах. При зупинці рибосоми на дефектних мРНК без стоп-кодонів тмРНК приєднує невеликий пептид, що направляє білок на деградацію.

Мікро-РНК (21-22 нуклеотиду в довжину) знайдені в еукаріот і впливають через механізм РНК-інтерференції. При цьому комплекс мікро-РНК і ферментів може призводити до метилювання нуклеотидів в ДНК промотора гена, що служить сигналом для зменшення активності гена. При використанні іншого типу регуляції мРНК, комплементарна мікро-РНК, деградує. Однак є й міРНК, які збільшують, а не зменшують експресію генів. Малі інтерферуючі РНК (міРНК, 20-25 нуклеотидів) часто утворюються в результаті розщеплення вірусних РНК, але існують і ендогенні клітинні міРНК. Малі інтерферуючі РНК також діють через РНК-інтерференцію за схожими з мікро-РНК механізмам.

Порівняння з ДНК

ДНК містить цукор дезоксирибозу

РНК містить рибозу, у якої є додаткова, порівняно з дезоксирибозою, гідроксильна група. Ця група збільшує ймовірність гідролізу молекули, тобто зменшує стабільність молекули РНК.

Нуклеотид, комплементарний аденіну, в ДНК тимін.

Нуклеотид, комплементарний аденіну, в РНК не тимін, як в ДНК, а урацил - неметилована форма тиміну.

ДНК існує у формі подвійної спіралі, що складається з двох окремих молекул.

Молекули РНК, в середньому, набагато коротші і переважно одноланцюжкові.

 

Структурний аналіз біологічно активних молекул РНК, включаючи тРНК, рРНК, мяРНК та інші молекули, які не кодують білків, показав, що вони складаються не з однієї довгої спіралі, а з численних коротких спіралей, розташованих близько один до одного і утворюють щось, схоже на третинну структуру білка. У результаті цього РНК може каталізувати хімічні реакції, наприклад, пептид-трансферазний центр рибосоми, що бере участь в утворенні пептидного зв'язку білків, повністю складається з РНК.

Особливості функцій РНК

1. Процесинг

Багато РНК беруть участь в модифікації інших РНК.

Інтрони можуть каталізувати власне вирізання. Синтезована в результаті транскрипції РНК також може бути хімічно модифікована. У еукаріотів хімічні модифікації нуклеотидів РНК, наприклад, їх метилювання, виконується малими ядерними РНК (мяРНК, 60-300 нуклеотидів). Цей тип РНК локалізується в ядерці і тільцях Кахаля. Після асоціації мяРНК з ферментами, мяРНК зв'язуються з РНК-мішенню шляхом утворення пар між основами двох молекул, а ферменти модифікують нуклеотиди РНК-мішені. Рибосомальні і транспортні РНК містять багато подібних модифікацій, конкретне положення яких часто зберігається в процесі еволюції. Також можуть бути модифіковані мяРНК і самі мяРНК.

2. Трансляція

тРНК приєднують певні амінокислоти в цитоплазмі і направляється до місця синтезу білка на іРНК де зв`язується з кодоном і віддає амінокислоту яка використовується для синтезу білка.

3. Інформаційна функція

У деяких вірусів РНК виконує подібні функції як ДНК у еукаріотів. Також інформаційну функцію виконує іРНК яка переносить інформацію про білок і є місцем його синтезу.

4. Регуляція генів

Деякі типи РНК беруть участь у регулюванні генів збільшуючи чи зменшуючи його активність. Це так звані міРНК (малі інтерферуючі РНК) та мікро- РНК.

5. Каталітична

Є так звані ферменти які відносяться до РНК вони називаються рибозими. Ці ферменти виконують різноманітні функції і мають своєрідну будову.

 

БІОСИНТЕЗ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

Проблема біосинтезу білка і нуклеїнових кислот надзвичайно цікава не тільки для медицини й біохімії, але й для молекулярної генетики зокрема. Під час біосинтезу білка відбувається реалізація генетичної (спадкової) інформації, закладеної в ДНК, яка проявляється у вигляді відтворення відповідних білкових та небілкових структур, їх властивостей та поведінки цілого організму.

 

 

 Вже в кінці XIX ст. генетичні та цитологічні дослідження довели, що за передачу ознак за спадковістю відповідають хромосоми. Велика заслуга в розкритті механізму передачі спадкових ознак від покоління до покоління належить чеському природодосліднику, монаху Грегору Менделю. Роль біохімії у вирішенні цього питання в минулому столітті була другорядною. Можна згадати лише двох німецьких учених: професор Гоппе-Зейлер доручив своєму учневі Мішеру (1866) дослідити бинти, що знімали із гнійних ран. Мішер, виконавши завдання, повідомив, що в гної ран є кисла речовина, яку він назвав нуклеїном. Пізніше ці речовини були названі нуклеїновими кислотами. Пройшло більш як півстоліття, поки вчені почали пов'язувати з нуклеїновими кислотами спадкові властивості організму. Оскільки хромосоми складаються з ядерних білків та ДНК, то виникло питання, яка роль кожного з цих компонентів у передачі спадкових ознак.

 Експериментально було доведено, що основна роль в передачі спадкової інформації належить ДНК, а білок виконує захисну та стабілізувальну функцію для ДНК. Наочним доведенням цього послужило вивчення розмноження бактеріофага (вірус, що уражає бактерії) у кишковій паличці. Встановлено, що бактеріофаг складається із ДНК та білкової оболонки. Під час зараження кишкової палички фат прикріплюється до стінки бактерії і всередину її впорскує ДНК, білкова оболонка при цьому залишається зовні на поверхні. Через кілька хвилин в бактерії виявляють сотні фагових частинок, що мають нову білкову оболонку і ДНК всередині. Звідси ясно, що вся інформація про структуру фата міститься в ДНК. Генетична інформація, тобто пам'ять про структуру білків, характерних для даної клітини, закодована в нуклеотидній послідовності ДНК (або РНК для РНК-вмісних вірусів). При поділі клітин відбувається точне відтворення молекул ДНК із наступним рівним розподілом інформаційного матеріалу клітини між дочірніми клітинами.

 У процесі реалізації генетичної інформації ДНК служить матрицею для синтезу РНК, а РНК — матрицею для синтезу білків. Цю тезу називають центральною догмою (постулатом) молекулярної біології:

 

Стрілки показують напрями перенесення генетичної інформації, а цифри — конкретні метаболічні процеси.

 

Існують три різновиди передачі генетичної інформації:

1. Реплікація — синтез дочірніх молекул ДНК, ідентичних материнській ДНК (ДНК -> ДНК).

 

http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0

 

2. Транскрипція — синтез на матриці ДНК молекул РНК, нуклеотид-на послідовність яких комплементарна певній ділянці матриці (ДНК—> РНК).На ДНК-матрицях утворюються всі три типи РНК — мРНК, рРНК, тРНК.

http://www.youtube.com/watch?v=ztPkv7wc3yU

 

 

3. Трансляція — синтез білків, амінокислотна послідовність якихвизначається нуклеотидною послідовністю мРНК (мРНК —> білок).

 

У клітинах, інфікованих РНК-вмісними вірусами, відбуваються ще такі процеси, як зворотна транскрипція (4) і реплікація РНК (5). Зворотна транскрипція — синтез ДНК, нуклеотидна послідовність якої комплементарна послідовності молекули РНК (РНК —> ДНК). Реплікація РНК — синтез молекул РНК на матриці вірусної РНК для утворення нових вірусних частинок (РНК -> РНК).

 

http://www.youtube.com/watch?v=5bLEDd-PSTQ

http://www.youtube.com/watch?v=-zb6r1MMTkc&feature=related

 

Загальна схема биосинтезу білків в клітині (ДНК РНК білок)

 

 

Важливими процесами у передачі генетичної інформації є репарація, рекомбінація і транспозиція ДНК.

1.      Репарація — ферментативне видалення і повторний синтез ділянок ДНК, що отримали пошкодження під дією фізичних та хімічних агентів.

 

2.      Рекомбінація — обмін генетичним матеріалом між різними молекулами ДНК. За цих умов утворюються так звані рекомбінантні ДНК.

 

3.      Транспозиція — переміщення гена чи групи генів із одного місця геному в інше. Такі гени називаються транспозонами, або стрибаючи­ми генами. Вони можуть викликати перебудову тих ділянок ДНК, поряд з якими вони розміщуються, впливають на мінливість організмів і їх еволюцію.

 

 

Біосинтез ДНК (реплікація)

 

Гіпотези реплікації ДНК

Після того, як було встановлено, що ДНК утворюється шляхом побудови на існуючій молекулі нових ланцюгів, виникло питання яким чином відбувається подвоєння вихідної молекули. Були висунуті три гіпотетичних механізми реплікації.

·    Консервативний механізм — при такому способі розкручування спіралі не відбувається, існуюча подвійна спіраль є матрицею для синтезу двох нових ланцюгів. Нова спіраль будується повністю з нового матеріалу, існуюча спіраль залишається незмінною.

Напівконсервативний механізм — існуюча спіраль розкручується, на кожному полінуклеотидному ланцюзі комплементарно будується новий. Таким чином нова подвійна спіраль є «гібридом» старого та нового ланцюгів

 

·    Дисперсивний механізм — існуюча спіраль розривається на кожному півоберті шляхом багаторазової фрагментації. Синтез нових ланцюгів проходить на фрагментах, які потім хрест-нахрест зливаються з відрізками нового матеріалу. Кожний полінуклеотид ний ланцюг складається з відрізків старого та нового матеріалу, які чергуються.

З метою з'ясувати, який механізм є дійсним Меселсон та Сталь провели експерименти з міченою ДНК, яка містила у своєму складі важкий ізотоп азоту. В результаті дослідження вдалося виявити, що ДНК синтезується за напівконсервативним механізмом.

Модель подвійної спіралі Уотсона-Кріка не тільки описує структуру ДНК, але й показує, яким чином ця молекула може точно відтворюватись. Оскільки нуклеотидні послідовності двох ланцюгів молекули ДНК комплементарні, то після розділення ланцюгів материнської молекули кожний із них служить матрицею для біосинтезу комплементарного дочірнього ланцюга .

Вихідні материнські і новосинтезовані дочірні ланцюги попарно з'єднуються, утворюючи дві ланцюгові молекули ДНК, повністю ідентичні материнській молекулі. Цей спосіб реплікації ДНК називається напівконсервативним, оскільки в кожній дочірній ДНК зберігається тільки один материнський ланцюг. Експерименти дійсно підтвердили напівконсервативний спосіб реплікації, а не консервативний, при якому одна дочірня молекула ДНК повинна була б мати обидва вихідні ланцюги, а друга складалась би із двох новосинтезованих ланцюгів.

Головними ферментами є ДНК-залежні ДНК-полімерази. Клітини у прокаріотів і еукаріотів містять декілька ДНК-полімераз. Добре вивчені ДНК-полімерази І, II, III Е. соїі. Більшість еукаріотних клітин містять ДНК-полімерази а, Р, у. Крім ДНК-полімераз, у процесі реплікації беруть участь понад 20 різних ферментів і білків, кожний з яких виконує певну функцію. Весь комплекс називають ДНК-репліказною системою або реплісомою.

По ланцюгу ДНК, наприклад, "їздить" фермент ДНК-полімераза, яка копіює молекули ДНК. Вчені намагаються штучно стоврити подібні структури, однак до цих пір ні одна із них не змогла зрівнятися с природними аналогами. Автори досліджень стверджують, що по багатьох характеристиках їх "молекулярна машина" переважає інші.

Розглянемо коротко основні етапи синтезу ДНК. Необхідно зазначити, що більшість результатів отримані для Е. соїі, а конкретні етапи і ферментативні фактори, що необхідні для реплікації ДНК в еукаріотних клітинах, ще мало вивчені, хоч і мають багато спільного з реплікацією в прокаріотів.

Для реплікації необхідні материнська дволанцюгова ДНК, чотири дезоксирибонуклеозидтрифосфати (дАТФ, дГ ТФ, дТТФ, дІДТФ), іони Мд2+, Zn2+, ферменти і білкові фактори реплісоми. У кільцевих молекулах ДНК реплікація починається з певної ділянки (нуклеотидної послідовності завдовжки 100-200 пар основ) і перебігає в обох напрямках до повної реплікації молекули. Ділянка, що є точкою початку росту в процесі реплікації ДНК і має V-подібну конфігурацію, називається реплікативною вилкою. Реплікація ДНК еукаріотів починається одночасно у багатьох місцях; вважають, що число точок початку реплікації перевищує тисячу. Із кожної точки одночасно у протилежних напрямках рухаються дві реплікативні вилки.

Перед точкою початку реплікації під дією ферментів геліказ (від helix — спіраль) невеличка ділянка подвійної спіралі розплітається, причому на розділення кожної пари основ витрачається енергія гідролізу двох молекул АТФ. Далі до ділянки ланцюгів, що розділились, приєднується декілька молекул ДНК-зв'язаних білків, які перешкоджають зворотному з'єднанню ланцюгів. Завдяки цьому нуклеотидні послідовності ланцюгів ДНК стають доступними для дії ДНК-полімерази. Остання синтезує нові ланцюги ДНК, комплементарні ланцюгу матриці. Тобто, якщо в матричному ланцюгу знаходиться тимін, то у дочірньому ланцюгу на це місце стає залишок аденіну, і навпаки. Аналогічним чином, якщо в матричному ланцюгу стоїть залишок цитозину, то у дочірній ланцюг включається залишок гуаніну, і навпаки. Дезоксирибонуклеотиди приєднуються своєю а-фосфатною групою до вільного гідроксилу 3-кінця ланцюга, що синтезується . Енергія на утворення кожного нового фосфодіефірно-го зв'язку забезпечується відщепленням від дезоксирибонуклеозидтрифосфату пірофосфатного залишку. Таким чином, рівняння синтезу ДНК у найпростішій формі має такий вигляд:

 

m(дАТФ + дТТФ) + n(дГТФ + дЦТФ)

 

Синтез нових ланцюгів відбувається тільки в напрямку 5'—>3', причому антипаралельно до матричного ланцюга.

 

http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0

http://www.youtube.com/watch?v=-mtLXpgjHL0&feature=related

       http://www.youtube.com/watch?v=qn-JW-M89fo&feature=related

 

 

 

 Один ланцюг (ведучий) синтезується безперервно в напрямку руху реплікативної вилки, а другий (відстаючий) переривчасто з утворенням фрагментів завдовжки близько 2000 нуклеотидів у прокаріотів і значно коротших в еукаріотів. Ці так звані фрагменти Оказакі (японський учений, який вперше їх відкрив) синтезуються у напрямку, протилежному руху реплікативної вилки.

Головний фермент, що каталізує реплікацію обох ланцюгів у прокаріотів — ДНК-полімераза III, а в еукаріотів — ДНК-полімераза а. Інші ДНК-полімерази відіграють допоміжну роль у реплікації. При дослідженні різних ДНК-полімераз з'ясувалось, що вони не спроможні почати синтез нового ланцюга, а приєднують нуклеотиди до З'-ОН-кінця ланцюга приманки. Приманкою служить короткий відрізок РНК, комплементарний матричному ланцюгу ДНК. Такий олігонуклеотид називають праимером (від англ primer — приманка) і синтезується він за допомогою специфічної РНК-полімерази (праймази, або примази).

Таким чином, синтез фрагмента Оказакі починається з праймера, який після завершення синтезу фрагмента видаляється, а розриви між фрагментами заповнюються дезоксирибонуклеотидами під дією ДНК-полімерази І. Врешті фрагменти Оказакі з'єднуються один з одним за допомогою ферменту ДНК-лігази. Два нові ланцюги, з'єднані зі своїми комплементарними ланцюгами, утворюють дві дочірні подвійні спіралі, кожна з яких містить один материнський і один новосинтезований ланцюг.

Важливе значення має здатність ДНК-полімераз проявляти, крім полімеразної активності, екзонуклеазну. Якщо в ході реплікації включиться некомплементарний нуклеотид, фермент робить крок назад, відщеплює неправильний нуклеотид і після цього знову продовжує полімеразні реакції. Завдяки такому коректуванню частота помилок при реплікації ДНК не перевищує однієї помилки на 109-1010 нуклеотидів.

 

Біосинтез РНК (транскрипція)

 

Для транскрипції необхідні

ДНК-матриця

фермент ДНК-залежна РНК- полімераза

4 нуклеозидтрифосфати

іони Мg2+

Як матриця використовується тільки один ланцюг ДНК

 

http://www.youtube.com/watch?v=ztPkv7wc3yU

http://www.youtube.com/watch?v=WsofH466lqk&NR=1

 

Інша відмінність транскрипції від реплікації: транскрибується не вся молекула ДНК, а лише певна ділянка (ген чи група генів). Тому в ДНК є сигнальні нуклеотидні послідовності, які вказують на початок та кінець ділянок молекули, що підлягають транскрипції (промоторні і термінальні послідовності).

 

 

 

http://www.youtube.com/watch?v=OtYz_3rkvPk&NR=1

 

У прокаріотів є тільки одна РНК-полімераза, яка каталізує синтез усіх 3 типів РНК, а в еукаріотів є три ядерні РНК-полімерази (І, II і III) і одна мітохондріальна. РНК-полімераза І бере участь у транскрипції рРНК, II — у транскрипції мРНК і III — у транскрипції тРНК і 5S-pPHK.

 

Спочатку РНК-полімераза розпізнає промоторну ділянку ДНК і зв'язується з нею. Це зумовлює локальне розходження ланцюгів подвійної спіралі ДНК. Для початку синтезу РНК не потрібна приманка. Фермент розміщує перший нуклеозидтрифосфат (звичайно ГТФ або АТФ) комп­лементарно до матриці і послідовно приєднує нуклеотиди фосфодіефір-ним зв'язком до вільної З'-ОН групи рибози. Таким чином, ланцюг РНК синтезується у напрямку 5'-3'. Комплементарні пари у процесі транскрипції Г—Ц і А—У, тобто замість тимінових залишків ДНК у РНК включається залишок урацилу. РНК-полімераза, на відміну від ДНК-полімерази, не здатна виправити помилки. Синтез ланцюга РНК припиняється, як тільки РНК-полімераза доходить до термінальної послідовності ДНК (стоп-сигналу).

http://www.youtube.com/watch?v=ztPkv7wc3yU

http://www.youtube.com/watch?v=WsofH466lqk&NR=1

Після завершення транскрипції і звільнення РНК відновлюється двоспіральна структура ДНК. Відзначимо, що з одного гена можуть одночасно транскрибуватись багато ланцюгів РНК. Ряд антибіотиків гальмують синтез РНК і використовуються для вивчення механізму цього процесу. Одні з них зв'язуються з матрицею ДНК, інші — з РНК-полімеразою. Актиноміцин Д проникає (інтеркалює) всередину між сусідніми основами Г-Ц.

 

Актиноміцин Д

 

Це зумовлює  локальну деформацію матриці перешкоджає рухові НК-полімерази по матриці. Актиноміцин Д гальмує синтез всіх типів РНК як у прокаріотів, так і в еукаріотів. Він проявляє протипухлинну дію, але внаслідок великої токсичності використовується рідко. Аналогічним чином діє рубоміцин.

Рифампіцин зв'язується з Р-субодиницею РНК-полімерази прокаріотів, гальмуючи ініціацію синтезу РНК. На РНК-полімерази еукаріотів рифампіцин не діє і широко використовується як протимікробний препарат. Стрептолідигін також зв'язується з Р-субодиницею, але інгібує процес елонгації після ініціації росту ланцюга РНК. а-аманітин, отруйна речовина із блідої поганки, є сильним інгібітором РНК-полімерази II еукаріотів, пригнічує синтез матричних РНК.

Дозрівання РНК

Усі типи РНК синтезуються у вигляді РНК-попередників, які після транскрипції зазнають певних змін, перетворюючись у біологічно активні РНК. Цей процес називається дозріванням, або процесингом. Молекули 5S-PHK, 8S-pPHK, 18S-pPHK і 28S-pPHK утворюються із одного попередника (прерибосомної РНК) шляхом фрагментації і відщеплення нуклеотидів під дією ендо- і екзонуклеаз. тРНК також утворю­ються із більш довгих РНК-попередників у результаті видалення зайвих нуклеотидів, крім того, ряд основ модифікуються (шляхом мети-лювання, дезамінування, відновлення). До тРНК у ході процесингу приєднується З'-кінцева послідовність - Ц-Ц-А.

 

 

 

 

 

Дуже складним процесом є утворення еукаріотних матричних РНК із попередників, що мають назву гетерогенні ядерні РНК (гяРНК). До 3'-кінця гяРНК послідовно приєднуються 100-200 залишків аденілової кислоти, утворюється полі (А) — хвіст мРНК. До 5'-кінцевого залишка приєднується трифосфатним зв'язком 7-мєтилгуанозин, утворюючи "шапочку", або "кеп". "Хвіст" і "шапочка", вірогідно, підвищують стабільність мРНК, охороняючи її від розщеплення під дією цитоплазматичних нуклеаз. Крім того, "шапочка" бере участь у зв'язуванні мРНК з рибосомами на початкових стадіях біосинтезу білків.

 

Як відомо, еукаріотні гени містять два види нуклеотидних послідовностей — екзони та інтрони. Екзони кодують амінокислотну послідовність білків, а інтрони не кодують, тобто не транслюються. Функція інтронів точно не встановлена, можливо, вони є регуляторними сигналами. У процесі транскрипції РНК-полімераза списує шформацію із екзошв та інтронів. Тому первинні транскрипти (гяРНК) значно довші, ніж мРНК. На гяРНК діють специфічні ферменти, вирізають інтрони і зшивають екзони. В цьому процесі бере участь мала ядерна РНК (мяРНК). Ферментативне з'єднання екзонів називається сплайсингом. Після завершення сплайсингу зрілі мРНК виходять із ядра в цитоплазму, а інтронні фрагменти розщеплюються нуклеазами до нуклеотидів, які знову використовуються для синтезу РНК в ядрі.

 

http://www.youtube.com/watch?v=FVuAwBGw_pQ&feature=related

 

Особливості реплікації геному вірусів

Віруси містять тільки один вид нуклеїнових кислот — або ДНК, або РНК. ДНК вірусів може бути дволанцюговою або одноланцюговою, мати форму кільця або лінійну. Вірусні нуклеїнові кислоти кодують синтез специфічних білків, характерних тільки для вірусних частинок, а також деяких ферментів, необхідних для реплікації вірусу у клітині-господарі. Після проникнення вірусної нуклеїнової кислоти у клітину-господаря відбувається реплікація вірусної нуклеїнової кислоти, синтез вірусних білків, утворення нових вірусних частинок і вихід їх із клітин (або шляхом руйнування, лізису її, або без руйнування).

Реплікація ДНК вірусів відбувається за загальним для всіх ДНК напівконсервативним механізмом. Також на матриці ДНК синтезуються мРНК, які спрямовують синтез вірусних білків. Ці процеси синтезу забезпечуються метаболічним апаратом клітини-господаря. РНК-вмісні віруси використовують як генетичний матеріал РНК. Реплікація вірусних РНК може відбуватись двома способами. За першим способом РНК вірусів грипу, кору, везикулярного стоматиту, поліовірусу,реовірусу, ряду бактеріофагів реплікуються під дією РНК-залежної РНК-полімерази (РНК - реплікази). Цей фермент відсутній у клітинах-господарях, а синтезується на вихідній вірусній РНК в інфікованих клітинах і каталізує утворення великої кількості молекул вірусних РНК. Одночасно проходить трансляція цих РНК і утворюються структурні білки вірусів. РНК-репліказа не може використовувати як матрицю ДНК чи РНК клітини-господаря.У реплікацїї геному другої групи РНК-вмісних вірусів (онкогенних) бере участь унікальний фермент — РНК-залежна ДНК-полімераза (інакше зворотна транскриптаза, або ревертаза).

Розмноження онкогеннихвірусів у заражених клітинах відбувається наступним способом: на вірусній РНК зворотна транскриптаза синтезує комплементарний ланцюг ДНК;

1) на цьому ланцюгу синтезується другий ланцюг ДНК, нуклеотидна послідовність якого ідентична послідовності вірусної РНК;

2) новосинтезована дволанцюгова ДНК включається у ДНК клітини-господаря;

3) інтегровані у геном клітини-господаря вірусні гени транскрибуються, мРНК переходять у цитоплазму і використовуються для синтезу вірусних білків;

4) з білків і РНК збирається серцевина вірусних частинок, яка покривається глікопротеїнами оболонки.

Новоутворені віруси відділяються від поверхні клітини-господаря. вірусна ДНК, включена у геном клітини-господаря, може залишатись і у прихованому стані, без розмноження вірусів. а певних умов вірусні гени можуть сприяти перетворенню інфікованих клітин у ракові. воротні транскриптази вірусів проявляють найбільшу активність при використанні як матриці РНК свого вірусу, але можуть викорис­товувати як матрицю різні РНК, що широко застосовується у генній інженерії.

 

БІОСИНТЕЗ БІЛКА І ЙОГО РЕГУЛЯЦІЯ

Процес синтезу білків (трансляція) значно складніший за синтез нуклеїнових кислот. В ньому беруть участь не менше 20 ферментів, необхідних для активації амінокислот, понад 70 (40S і 30S) різних рибосомних білків, більше десяти білкових факторів ініціації, елонгації і термінації синтезу поліпептидних ланцюгів, понад 70 видів транспортних і рибосомних РНК. Крім того, не менше 100 додаткових ферментів каталізують реакції посттрансляційних модифікацій білків.

http://www.youtube.com/watch?v=5bLEDd-PSTQ

http://www.youtube.com/watch?v=-zb6r1MMTkc&feature=related

Генетичний код

Перед вивченням механізму утворення поліпептидного ланцюга розглянемо спосіб запису генетичної інформації, так званий генетичний код і "слова", або кодони, що його складають. На першому етапі реалізації генетичної інформації, тобто під час транскрипції, нуклеотидна послідовність генів ДНК переписується за принципом комплементарності у нуклеотидну послідовність матричної РНК. На другому етапі послідовність нуклео-тидів мРНК визначає послідовність амінокислот у поліпептидному ланцюзі білка. Але тут виникають серйозні утруднення, оскільки, по-перше, мРНК має 4 різних нуклеотиди (як і в ДНК), а у білку — 20 різних амінокислот, і, по-друге, залишки амінокислот поліпептидного ланцюга та основи нуклеотидів мРНК не комплементарні між собою, тобто між ними не існує специфічної спорідненості, як між парами нуклеотидів. Таким чином, вільні амінокислоти не можуть самі розміститися у правильному порядку на поверхні матричної РНК. Вони спочатку з'єднуються з моле-кулами-адапторами, а вже останні розпізнають кодони мРНК і забезпечують порядок розміщення амінокислот у ланцюгу (гіпотезу існування адап-торних молекул запропонував Ф. Крік). Адапторну роль відіграють транспортні РНК, що містять комплементарний кодону мРНК антикодон. Питання про кодове число, тобто про кількість нуклеотидів, що відповідає одній амінокислоті, розглянув ще у 40-х роках Г. Гамов (народився 1904 р. в Одесі). Оскільки нуклеотидів 4, а амінокислот 20, то кодон не може бути із 1-го чи 2-х нуклеотидів. У першому випадку кодувалось би 4 амінокислоти, а у другому — 16. Для кодонів із 3 нуклеотидів (триплетів) можливі 4x4x4 = 64 комбінації, що більше, ніж потрібно для кодування 20 амінокислот. Експериментальні дослідження підтвердили триплетність генетичного коду і вже у 60-х роках М. Ніренберг і Г. Матгеї, Г. Корана, С. Очоа, Р.У. Холлі та ін. повністю розшифрували генетичний код. Нуклеотидна послідовність деяких кодонів була встановлена шляхом використання синтетичних полінуклеотидів з відомою нуклеотидною послідовністю, які синтезували із рибонуклеозиддифосфату ферментом полінуклеотидфосфорилазою. Наприклад поліуридилова кислота служить матрицею для синтезу поліфенілаланіну, полі (А)-полілізину, полі (Ц)-поліпроліну і полі (Г)-полігліцину. За допомогою цих та інших експериментальних підходів були визначені всі 64 кодони.

 

Примітка. За допомогою цієї таблиці можна визначити, яку саме амінокислоту кодує певний триплет. Перший нуклеотид у триплеті беруть із лівого вертикального стовпчика, другий - з верхнього горизонтального і третій - з правого вертикального. В місці перетину ліній знаходиться інформація про амінокислоту, яку слід визначити. Зазначимо, що в таблиці наведено триплети іРНК, а не ДНК.

 

Для генетичного коду характерний ряд особливостей. Із 64 кодонів 61 кодують амінокислоти, а 3 є сигналами закінчення синтезу пептидного ланцюга (термінальні кодони). Кожний триплет кодує тільки якусь одну амінокислоту. Але всім амінокислотам, крім метіоніну і триптофану, відповідає більше одного кодону. Ця властивість називається виродженістю коду і має важливе значення для живих організмів. Різні кодони, що кодують одну амінокислоту, відрізняються у більшості випадків третім нуклеотидом.

 Наприклад, пролін кодується триплетами ЦЦЦ, ЦЦУ, ЦЦА і ЦЦГ, тобто перші дві букви Ц у всіх пролінових кодонів однакові. Внаслідок виродженості коду заміни нуклеотидів при реплікації чи транскрипції ДНК не завжди змінюють зміст кодону – може вийти другий кодон тієї ж амінокислоти. У випадку пролінових кодонів помилки тільки по першому і другому положенні кодону змінюють його значення. Тільки у мітохондріях знайдені відхилення від генетичного коду і 5 кодонів змінили своє значення.

Характерною ознакою коду є відсутність розділових знаків між кодонами для сусідніх амінокислот. Таким чином, генетичний код вироджений, універсальний, лінійний, однонаправлений і неперервний.

Довгий час думали, що нуклеотидна послідовність гена ДНК точно колінеарна, тобто лінійно відповідна послідовності матричної РНК і амінокислотній послідовності відповідного поліпептидного ланцюга. Але виявилось, що абсолютну колінеарність гена і закодованого ним поліпептиду порушують інтрони – вставні нуклеотидні послідовності, які не транслюються.

\

Діаграма генетичного коду

 

Властивості генетичного коду

 

Триплетність

Значущою одиницею коду є поєднання трьох нуклеотидів (кодон). Кожну амінокислоту кодує 3 нуклеотиди

Безперервність

Між кодонами немає розділових знаків, тобто інформація прочитується безперервно. Кожний з триплетів не залежить один від одного і під час біосинтезу зчитується повністю

Дискретність

Один і той же нуклеотид не може входити одночасно до складу двох або більш кодонів

Специфічність

 У переважній більшості випадків певний кодон відповідає тільки одній амінокислоті.Певні кодони відповідають тільки певним амінокислотам

Виродженість (надмірність) 

Одній і тій же амінокислоті може відповідати декілька кодонів. Кожну амінокислоту кодує більше як 1 кодон

Універсальність 

«Стандартний» генетичний код працює однаково в організмах різного рівня складності — від вірусів до людини (хоча існують кілька інших, менш поширених варіантів генетичного коду, див. список на сайті NCBI Taxonomy).Всім живим організмам єдиний генетичний код

 

 

Етапи біосинтезу білка

 

Першим етапом біосинтезу білків є активація і відбір амінокислот. На цьому етапі, що відбувається у цитозолі клітин, 20 амінокислот приєднуються ефірним зв'язком до відповідних "своїх" тРНК. Високоспецифічні ферменти аміноацил-тРНК-синтетази каталізують дві стадії цього етапу:

 

 

 

 

На першій стадії за рахунок енергії АТФ карбоксил амінокислоти приєднується високоенергетичним зв'язком до залишку аденілової кислоти. Аміноациладенілат залишається зв'язаним з активним центром ферменту, а під час другої стадії фермент каталізує перенесення аміноацильного залишку на 3'‑кінцевий залишок аденілової кислоти в молекулі тРНК. Складноефірний зв'язок карбоксилу амінокислоти з гідроксилом тРНК є високоенергетичним.

 

Для кожної із 20 амінокислот є своя аміноацил-тРНК-синтетаза, що також розпізнає одну чи декілька тРНК, відповідних даній амінокислоті.

 

Таким чином, аміноацил-тРНК-синтетази мають специфічні ділянки для зв'язування амінокислоти, тРНК і АТФ. Фермент розпізнає ­послідовність нуклеотидів у дигідроуридиловій петлі тРНК, що містить модифіковану основу дигідроуридину, тому цю стадію називають ще ­рекогніцією (з англ. recognition – розпізнавання). Вірогідно, що всі тРНК, специфічні до одної амінокислоти, мають у цій ділянці однакову послідовність нуклеотидів, хоч і різні антикодони в антикодоновій петлі. Точність синтезу поліпептидного ланцюга визначається, головним чином, специфічністю аміноацил-тРНК-синтетазної реакції. Так, якщо після утворення синтетазою аміноацил-тРНК амінокислотний залишок перетворити хімічним шляхом в інший (наприклад, аланін у цистеїн), то під час трансляції у відповідних положеннях поліпептидного ланцюга замість аланіну включається цистеїн.

Після активації молекули аміноацил-тРНК дифундують до рибосом, на яких проходить біосинтез білка. Їх діаметр дорівнює близько 21 нм, маса близько 4 млн, коефіцієнти седиментації цілої рибосоми – 80S, великої субчастинки – 60S і малої – 40S.

У процесі синтезу поліпептидного ланцюга білка розрізняють стадії ініціації, елонгації і термінації .

Стадія ініціації починається з утворення комплексу між малою (40S) субчастинкою рибосоми, молекулами матричної РНК і ініціаторної аміноацил-тРНК. Зв'язування мРНК з рибосомою відбувається за рахунок локального спарювання рРНК з короткою ділянкою на 5'-кінці мРНК. Ініціаторною аміноацил-тРНК при синтезі будь-якого білка служить у прокаріотів N-формілметіонін-тРНК, в якої аміногрупа метіонінового залишку з'єднана з формільною групою, а в еукаріотів – метіонін-тРНК.

 Ініціаторна аміноацил-тРНК, що містить антикодон УАЦ, розпізнає ініціаторний кодон тРНК-АУГ і завдяки комплементарній ­взаємодії АУГ – УАЦ, а також взаємодії ­певної ділянки тРНК з рибосомою встановлюється у так званому пептидильному (П) центрі рибосоми, що утворюється після приєднання великої (60S) субчастинки рибосоми. В утворенні ініціаторного функціонально активного комплексу задіяні також додаткові нерибосомні білки – фактори ініціації (близько 10 білків).

Під час ініціації також відбувається зв'язування і гідроліз однієї молекули ГТФ.

 

http://www.youtube.com/watch?v=5bLEDd-PSTQ

http://www.youtube.com/watch?v=-zb6r1MMTkc&feature=related

 

Схематичне зображення дисоціації рибосоми, яка започатковує процес ініціації

 

Крім П-центру, в рибосомі є аміноацильний (А) центр. Обидва вони утворені завдяки специфічному сполученню 40S- і 60S-субчастинок. Під час ініціації в П-центрі розмістилась метіонін-тРНК. Далі у процесі елонгації аміноацил-тРНК приєднується в А-центрі.

Елонгація починається з відбору і приєднання аміноацил-тРНК з антикодоном, комплементарним кодону мРНК, що йде за ініціаторним (на схемі – УУУ). Зв'язування аміноацил-тРНК в А-центрі здійснюється за участю білка-фактора елонгації (ФТ-1) і супроводжується гідролізом ГТФ. Між метіоніном (у прокаріотів – формілметіоніном) і амінокислотою, що знаходиться в А-центрі, утворюється пептидний зв'язок. При цьому залишок метіоніну зі своєї тРНК переноситься на аміногрупу другої амінокислоти, тобто метіонін взаємодіє з карбоксильною групою, а аміногрупа його буде вільною. Таким чином, синтез поліпептидного ланцюга починається з N-кінця і йде у напрямку до С-кінця. Реакцію утворення пептидного зв'язку каталізує пептидилтрансфераза, що входить до складу 60S-субчастинки рибосоми. В результаті реакції в П-центрі буде вільна метіонінова тРНК, а в А‑центрі – дипептидил-тРНК. Далі рибосома переміщується вздовж мРНК у напрямі до 3'-кінця на один кодон, метіонінова тРНК вивільняється із комплексу, а дипептидил-тРНК попадає в П-центр. Ця фаза елонгації називається транслокацією і потребує участі другого фактора елонгації (ФТ-2) і гідролізу ще однієї молекули ГТФ. У звільненому А-центрі рибосоми до наступного кодону мРНК приєднується аміноацил-тРНК із відповідним антикодоном і цикл повторюється. Таким чином, під час стадії елонгації відбувається послідовне нарощення поліпептидного ланцюга по одній амінокислоті відповідно до порядку кодонів мРНК.

 

Швидкість нарощення поліпептидного ланцюга оцінюється в 10 амі­нокислотних залишків за секунду. На включення в поліпептид одного амінокислотного залишку затрачається 1 молекула АТФ (на стадії активації) і 2 молекули ГТФ (на стадії елонгації). Оскільки АТФ розщеплюється до АМФ, всього затрачаються 4 високоенергетичні зв'язки. Така велика витрата енергії на синтез білка служить одним із факторів забезпечення точності трансляції.

Процес елонгації продовжується до тих пір, поки в А-центр рибосоми не потрапить один із термінальних кодонів мРНК (УАА, УАГ, УГА), які служать сигналами закінчення синтезу поліпептидного ланцюга. Вони розпізнаються не комплементарними антикодонами аміноацил-тРНК (до термінальних кодонів таких немає), а специфічними білками – факторами термінації. За участю останніх відбувається гідролітичне відщеплення синтезованого поліпептиду від кінцевої тРНК, звільнення його, а також кінцевої тРНК і мРНК від рибосоми, дисоціація рибосоми на субодиниці. Майже завжди мРНК транслюється одночасно багатьма рибосомами, які, розміщуючись досить близько одна від одної, послідовно рухаються з 5'-кінця до 3'-кінця мРНК. Така структура називається полірибосомою (полісомою). Кількість рибосом, що складає полісому, залежить від довжини мРНК. Звичайно полісоми містять 3-20 рибосом, а дуже довгі мРНК можуть утворювати комплекси з 50-100 рибосомами.

 

 

Елонгація транскрипції у прокаріот

 

Одночасна трансляція одної мРНК багатьма рибосомами значно збільшує ефективність використання матриці, підвищує швидкість синтезу білка. У бактерій трансляція на мРНК починається ще під час її транскрипції на ДНК.

 

Посттрансляційні зміни білків

У міру синтезу поліпептидного ланцюга формується вторинна і третинна структура білка, яка визначається амінокислотною послідовністю, тобто первинною структурою. Досить часто синтезований по­ліпептидний ланцюг набуває біологічно активної конформації тільки після додаткових змін структури. Ці зміни можуть бути різними і об'єднуються під поняттям посттрансляційних модифікацій, які включають:

1. Утворення дисульфідних зв'язків (містків) між залишками ­цистеїну.

2. Відщеплення одного чи декількох амінокислотних залишків з кінця поліпептидного ланцюга (наприклад, метіоніну, сигнальної послідовності).

3. Розщеплення певних пептидних зв'язків у молекулі білка-попередника і видалення фрагмента ланцюга, наприклад, при перетворенні проінсуліну в інсулін, хімотрипсиногену в хімотрипсин.

4. Хімічні модифікації певних амінокислотних залишків (фосфорилювання, метилювання, гідроксилювання, карбоксилювання, йодування, ацетилювання).

5. Приєднання простетичних груп чи кофакторів, наприклад гему, піридоксальфосфату, біотину, іонів металів.

6. Утворення олігомерних білків із декількох поліпептидних ланцюгів, мономерів.

 

Деякі із посттрансляційних модифікацій відбуваються спонтанно, без участі ферментів. Інші, зокрема ковалентні модифікації амінокислотних залишків і реакції обмеженого протеолізу, є ферментативними процесами. Посттрансляційні модифікації приводять до утворення біологічно активної структури білка. У ряді випадків вони є зворотними і служать для регуляції активності ферментів, наприклад фосфорилювання-дефосфорилювання фосфорилази і глікогенсинтетази. Приєднання простетичних груп до апоферментів відіграє безпосередню роль у ферментативній функції і менш важливе як фактор, що визначає структуру білка.

 

Інгібітори синтезу білків

Для вивчення білкового синтезу використовуються різні антибіотики, які гальмують специфічним чином певні етапи процесу трансляції. Частина з них специфічно пригнічує синтез білків прокаріотів, але не діє на еукаріоти і завдяки цьому використовується як протимікробні засоби. Нечутливість еукаріотів до дії ряду антибіотиків зумовлюється відмінностями структури білків рибосом та інших компонентів систем трансляції прокаріотів і еукаріотів.

 

Стрептоміцин зв'язується з 30S-субчастинкою рибосом прокаріо­тів, порушує її структуру і зумовлює помилки при розпізнаванні кодону антикодоном.

 

Стрептоміцин

 

Тетрациклін гальмує стадію елонгації, блокуючи зв'язування аміноацил-тРНК в А-центрі рибосом. Левоміцетин (хлорамфенікол) інгібує активність пептидилтрансферази 50S-субчастинок рибосом прокаріотів.

Тетрациклін

 

 

Циклогексимід діє аналогічним чином, але на фермент 60S-субчастинок рибосом еукаріотів. Пуроміцин перериває елонгацію поліпептидного ланцюга у прокаріотів і еукаріотів. За структурою він по­дібний до кінцевого аміноациладенілату в складі аміноацил-тРНК, і під час елонгації пептидний ланцюг, що росте, переноситься не на аміно­ацил-тРНК, а на пуроміцин. Далі приєднання амінокислот стає неможливим і незавершений ланцюг з пуроміцином на кінці відділяється від рибосоми.

Еритроміцин зв'язується з 50S-субчастинкою рибосом і блокує стадію транслокації. Мутації відповідних рибосомальних білків зумовлюють появу бактерій, стійких до дії антибіотиків.

 

Один із потужних інгібіторів білкового синтезу –пуроміцин. Він є є аналогом кінцевої ділянки аміноацил-тРНК аденілової кислоти і тому легко взаємодіє з А-центром пептидил-тРНК з утворенням пептидил-пуроміцину.

 Пептидил-пуроміцин не несе на собі триплет антикодону і тому гальмує елонгацію пептидного зв'язку, викликаючи обрив реакції, тобто передчасну термінацію синтезу білка. За допомогою пуроміцину було доказано, наприклад, що гормональний ефект у ряді випадків залежить від синтезу білка de novo. Пуроміцин викликає гальмівну дію на синтез белка як у прокаріот, так і у еукаріот.

 

Стійкість бактерій до антибіотиків може зумовлюватись також синтезом специфічних ферментів, які розщеплюють антибіотики (наприклад, пеніцилінази), модифікують їх шляхом ацетилювання, фосфорилювання та інших реакцій і, таким чином, інактивують антибіотики. Крім того, стійкість виникає внаслідок змін бактеріальних мембран.

Специфічно гальмує синтез білків у еукаріотів дифтерійний токсин білкової природи. В клітинах еукаріотів цей білок розщеплюється протеолітичним ферментом на дві частини, одна з яких є ферментом АДФ-рибозилтрансферазою, що каталізує перенесення АДФ-рибозильного залишку з НАД+ на фактор елонгації ТF-2. Інактивація фактора зупиняє процес трансляції.

 

РЕГУЛЯЦІЯ БІОСИНТЕЗУ БІЛКІВ

Припускають, що геном людини містить від 50 до 100 тисяч генів (геном Е. coli – більше 3000). Кожна клітина організму містить повний набір генів, але ніколи не синтезує всі закодовані білки. Деякі білки наявні у клітині у великій кількості, а інші – у малій. Так, у більшості клітин наявні набори основних ферментів, що каталізують реакції головних шляхів метаболізму. Але клітини різних типів містять спеціалізовані білки, що реалізують характерні для даних клітин функції. Наприклад, еритроцити містять величезну кількість гемоглобіну, фібробласти – колагену, клітини скелетних м'язів – актину і міозину, але еритроцити не містять колагену, актину і міозину, а фібробласти – білків м'язів, печінки – гемоглобіну і т.п. Таким чином, кожна клітина має здатність контролювати біосинтез білків.

Зараз порівняно мало відомо про регуляцію експресії генів у тварин і більша частина результатів отримана в дослідженнях мікроорганізмів. Залежно від складу живильного середовища, бактерії синтезують багато ферментів з різною швидкістю. Наприклад, клітини Е. coli, які ростуть на середовищі, де єдиним джерелом вуглецю служить лактоза, містять фермент b-галактозидазу (лактазу) у кількості, що складає близько 3 % загального клітинного білка. Якщо ж середовище містить друге джерело вуглецю (глюкозу, фруктозу та ін.), то ця кількість зменшується у 1000 раз (до декількох молекул на клітину). Таким чином, внесення лактози в живильне середовище індукує синтез b-галактозидази; лактоза називається індуктором, а фермент – індукованим (індуцибельним). Кінцеві продукти певних ланцюгів реакцій (наприклад, реакцій синтезу амінокислот чи нуклеотидів) викликають репресію (гальмування) синтезу відповідних ферментів, що називаються репресованими (репресибельними). Такі кінцеві продукти ферментативних реакцій називаються корепресорами.

Синтез ферментів у бактерій регулюється, головним чином, на рівні транскрипції за рахунок зміни швидкості утворення мРНК. Для пояснення механізму контролю Ф. Жакоб і Ж. Моно розробили теорію індукції-репресії активності генів, або, інакше, теорію оперона. Встановлено, що експресія структурних генів, які кодують білки чи РНК, контролюється регуляторними генами. В результаті транскрипції регуляторних генів утворюються мРНК, які служать матрицею для синтезу білків-репресорів. Останні зв'язуються з певною ділянкою молекул ДНК (оператором) і, перешкоджаючи зв'язуванню РНК-полімерази з промоторною ділянкою ДНК, блокують ініціацію транскрипції відповідних структурних генів.

 

Регуляція експресії Lac—оперону E.Coli

 

Сукупність одного чи декількох функціонально зв'язаних структурних генів і регуляторних ділянок ДНК (оператора і промотора) складає оперон. Регуляторний ген не обов'язково розміщений поряд з опероном, який він контролює.

 

Схема регуляції синтезу білків шляхом індукції:

ГР – ген-регулятор, П – промотор, ГО – ген-оператор,

білки 1, 2, 3 –віцдповідно, бета-галактозидаза, пермеаза і трансацетилаза

 

Схема регуляції синтезу білків шляхом репресії:

ГР – ген-регулятор, П – промотор, ГО – ген-оператор,

білки 1, 2, 3 –відповідно, бета-галактозидаза, пермеаза і трансацетилаза

 

На рисунку схематично зображений лактозний оперон. Він включає 3 розміщені поряд структурні гени, що кодують білки, необхідні для засвоєння лактози (b-галактозидазу, пермеазу і трансацетилазу). Перед ними розміщені регуляторні ділянки – промотор (П) і оператор (О). За відсутності лактози активний білок-репресор зв'язаний з оператором і транскрипція структурних генів заблокована. В результаті із-за відсутності мРНК синтез b-галактозидази і зв'язаних з нею ферментів пригнічується (репресується). Якщо у живильному середовищі є лактоза, вона зв'язується з білком-репресором і переводить його в неактивний стан, коли репресор втрачає здатність зв'язуватись з оператором. Від'єднання комплексу індуктор-репресор від оператора робить можливим зв'язування РНК-полімерази з промотором і транскрипцію мРНК структурних генів. Тим самим індукується синтез ферментів для засвоєння лактози.

У бактерій відкрито велику кількість оперонів. У частини оперонів білок-репресор, на відміну від лактозного, не може зв'язуватись з оператором, якщо в клітині відсутня низькомолекулярна речовина-корепресор. Такими оперонами є гістидиновий і триптофановий, які регулюють синтез ферментів, необхідних для біосинтезу бактеріями амінокислот гістидину і триптофану.

При відсутності цих амінокислот у живильному середовищі має місце транскрипція структурних генів відповідних оперонів, а значить, і синтез ферментів, необхідних для утворення амінокислот. При наявності гістидину чи триптофану вони зв'язуються з білком-репресором – продуктом регуляторного гена, комплекс репресор-корепресор приєднується до оператора, внаслідок чого транскрипція структурних генів не відбувається. Таким чином, при наявності амінокислот синтез ферментів, необхідних для їх утворення, репресується.

Приклад дії негативного зворотнього триптофанового репресора

 

Гістидиновий оперон включає 10 структурних генів, що кодують 10 ферментів, необхідних для біосинтезу гістидину. Триптофановий оперон контролює синтез 5 поліпептидів.

 

Отже, двома важливими особливостями контролю активності генів шляхом індукції і репресії є:

1) під безпосереднім контролем знаходиться процес транскрипції (синтез мРНК), а контроль трансляції – тільки наслідок;

2) контроль здійснюється завдяки переходу білка-репресора з неактивного в активний стан і навпаки під дією індуктора та корепресора.

Крім регуляції експресії генів шляхом взаємодії білка-репресора з індукторами чи корепресорами, відкриті й інші регуляторні сигнали. Так, на процес транскрипції впливають надспіралізація ДНК, наявність специфічних нуклеотидних послідовностей ДНК, які служать регуляторними елементами різних типів, метилювання цитозину в ДНК. Вірогідно, що ці регуляторні сигнали також впливають на взаємодію між ДНК і білками.

Біологічне значення регуляції біосинтезу білків шляхом індукції і репресії генів полягає в тому, що вона дозволяє бактеріям пристосуватись до змін навколишнього середовища. Експресуються тільки ті гени, продуктів яких потребує клітина в даний момент згідно з зовнішніми умовами. У багатоклітинних організмах рослин і тварин також має місце адаптивна регуляція експресії генів шляхом індукції і репресії при зміні концентрації певних метаболітів, гормонів. Та основна проблема регуляції дії генів в вищих організмах зв'язана з тим, що всі клітини містять одну і ту ж ДНК, але повинні виконувати різні функції, а для цього синтезувати різні білки. Вибір білків, які повинні синтезуватись в тій чи іншій клітині, здійснюється основним чином на рівні транскрипції. Кожна клітина характеризується специфічною комбінацією активних і неактивних генів, яка поступово змінюється у процесі розвитку. Таким чином, відмінності клітин при диференціації виникають внаслідок стабільної репресії одних генів і дерепресії інших. Безперечно, експресія ДНК у вищих організмів регулюється набагато досконалішими механізмами, ніж у бактерій, і зараз інтенсивно вивчається.

 

Кількість структурних генів в опероні залежить від складності біохімічних перетворень того чи іншого субстрату. Регуляція генної активності у вищих організмів набагато складніше, ніж у бактерій. У еукаріот поряд з регуляторними процесами, які впливають на функціонування окремої клітини, існують системи регуляції організмів як цілого. Гормони утворюються в спеціалізованих клітинах залоз внутрішньої секреції і з кровю розносяться по всьому тілу.

В еукаріотів регуляція біосинтезу білка відбувається за участю хромосомних білків і так званої малої ядерної РНК.

Хромосомні білки (гістони і негістонові білки), таким чином, виконують не тільки структурну, але і регуляторну функцію, полегшуючи або утруднюючи транскрипцію певних генів хроматину. Гістони виступають у ролі негативного регулятора біосинтезу білка (подібно до репресорів у бактерій). Вони своїм позитивним зарядом зв'язуються з негативно зарядженими фосфатами ДНК і блокують транскрипцію. За цих умов транскрипція може відбуватись тільки при послабленні зв'язку гістонів з ДНК. Отже, зменшення позитивного заряду гістонів або модифікація їх структури буде призводити до деблокування транскрипції. Цьому сприяють такі перетворення гістонів, як фосфорилювання, ацетилювання і метилювання. Внаслідок таких модифікацій полегшується транскрипція і збільшується синтез РНК. В той же час можна припустити, що гістони не можуть забезпечувати специфічності регуляції генів, тому що їх число дуже обмежене (всього 5 різновидів). Вірогідніше, що регуляторна функція гістонів неспецифічна або специфічна для якихось однотипних транскриптонів.

Більш важлива роль в регуляції синтезу білка повинна належати негістоновим білкам ядра, яких нараховується понад 500 фракцій. Ці білки, як правило, містять негативний заряд і можуть зв'язуватись з певними специфічними ділянками ДНК. Тому вони відіграють роль позитивних регуляторів синтезу білка, полегшуючи транскрипцію в місцях зв'язування ДНК. Найбільш активно підсилюють транскрипцію фосфорильовані негістонові білки. Не виключено, що своїм значним негативним зарядом вони утворюють комплекс з позитивно зарядженими гістонами і відтягують їх від ДНК, що приводить до полегшення транскрипції. Регулятором транскрипції виступає і низькомолекулярна ядерна РНК (мала ядерна РНК), яка перебуває в ядрі у комплексі з білком (РНП). Такий рибонуклеопротеїн може вибірково включати гени шляхом комплементарної взаємодії з акцепторними ділянками транскриптону. Регуляторна функція малої ядерної РНК вивчається.

Регуляція синтезу білка в еукаріотів здійснюється на рівні транскрипції і трансляції. В першому випадку це проявляється у вибірковості дії різних регуляторів на окремі гени. Регуляція на рівні трансляції більше проявляється на швидкості синтезу окремих білків в рибосомах і менше на їх амінокислотному складі, бо під час трансляції лише механічно відтворюється програма мРНК. Речовини, що прискорюють синтез білка, називаються індукторами, а ті, що сповільнюють його, – інгібіторами. Індуктори (наприклад, гормони), потрапляючи в ядро клітини, взаємодіють з молекулами-регуляторами транскрипції або викликають їх модифікацію. Індуктори можуть включати "свої" гени в різних ділянках хромосом шляхом інактивації репресорної дії гістонів, зв'язуючись з ними або активуючи ферменти, які здійснюють їх фосфорилювання чи ацетилювання. Індуктори можуть також викликати модифікацію негістонових білків або діяти опосередковано через малу ядерну РНК. В кінцевому рахунку індуктор полегшує зв'язування РНК-полімерази з промотором і утворення копій транскриптонів-транскриптів.

Після припинення дії індуктора відбувається від'єднання модифікованих груп від гістонів, останні знову з'єднуються з ДНК, що призупиняє транскрипцію. Аналогічних змін зазнають і негістонові білки, які знову зв'язуються з хроматином.

Регуляція синтезу білка на рівні транскрипції може здійснюватись і шляхом впливу речовин на білкові фактори, що контролюють в рибосомах ініціацію, елонгацію і термінацію, і на різні функціональні ділянки рибосом. Індуктори застосовують з метою стимуляції синтезу білка в пошкоджених або атрофованих (внаслідок бездіяльності) органах, для стимуляції росту дітей, котрі погано фізично розвиваються. Крім гормонів, індукторами можуть виступати негормональні речовини, що одержані синтетично, або похідні гормонів. Як індуктори синтезу білків застосовують і деякі речовини, які стимулюють синтез азотових основ нуклеїнових кислот, наприклад оротат калію.

Інгібітори синтезу білка використовують для пригнічення поділу і росту клітин.