ФУНДАМЕНТАЛЬНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ ОБМІНУ РЕЧОВИН: КАТАБОЛІЗМ, АНАБОЛІЗМ. СТАДІЇ КАТАБОЛІЗМУ. СПІЛЬНІ ШЛЯХИ ПЕРЕТВОРЕНЬ БІЛКІВ, ВУГЛЕВОДІВ, ЛІПІДІВ. ОСОБЛИВОСТІ ФУНКЦІОНУВАННЯ ЦИКЛУ

ТРИКАРБОНОВИХ КИСЛОТ

 

ВСТУП ДО ОБМІНУ РЕЧОВИН

 

Живі організми є відкритими системами, оскільки між організмом і навколишнім середовищем постійно відбувається обмін речовин і енергії. Організм людини споживає кисень, воду, вуглеводи, жири, білки, мінеральні солі, вітаміни, а виводить вуглекислий газ, воду, сечовину, сечову кислоту й у незначній кількості інші речовини. Із спожитих харчових речовин синтезуються специфічні для організму білки, нуклеїнові кислоти, ліпіди, вуглеводи, з яких будуються клітини, їх мембрани, органели. Разом з тим, клітини руйнують макромолекули шляхом гідролізу й окиснюють продукти розпаду (глюкозу, жирні кислоти, органічні кислоти) для того, щоб отримати енергію.

Обмін речовин включає процеси споживання, нагромадження, перетворення, використання і видалення речовин і енергії, завдяки чому живі організми ростуть, розвиваються, розмножуються в умовах навколишнього середовища, а також пристосовуються до його постійних змін.

Які масштаби обміну речовин? Щоденне споживання дорослою людиною органічних речовин з їжею складає приблизно 0,6 кг; за 40‑50 днів маса органічних речовин, що надійде в організм, становить близько 25 кг, що дорівнює загальній масі органічних речовин у тілі людини. Оскільки маса здорової людини зберігається постійною, то за цей період така ж маса речовин виведеться з організму. За 40 років людина споживає приблизно 6 т твердої їжі й близько 38 т води – такі величезні масштаби обміну речовин.

Використання терміна «метаболізм» може бути в більш розширеному контексті й означати сукупність усіх реакцій від моменту надходження поживних речовин до утворення та виведення кінцевих продуктів обміну. В цьому випадку метаболізм передбачає такі послідовні стадії (рис. 1):

1) надходження білків, ліпідів, вуглеводів, неорганічних речовин з продуктами харчування;

2) перетравлювання органічних речовин до більш простих та їх усмоктування в ШКТ;

3) транспорт сполук кров’ю від ШКТ до клітин організму;

 

Рис. 1. Стадії обміну речовин. Взаємозв’язок обміну речовин і енергії:

1 - травлення; 2, 4 - катаболізм; 3 - анаболізм; 5 - екзергонічні реакції; 6, 7 - ендергонічні реакції; 8 - виділення кінцевих продуктів

 

4) біохімічні перетворення в клітинах різних органів та систем, у тому числі з утворенням кінцевих продуктів;

5) екскреція кінцевих продуктів обміну (СО₂, NH₃, сечовини, сечової кислоти, кон’югатів тощо).

Проте найчастіше під цим поняттям розуміють проміжний обмін (внутрішньоклітинний), що відбувається безпосередньо в клітинах, тобто сукупність усіх хімічних перетворень клітин організму. Так, наприклад, виділяють метаболізм білків, метаболізм вуглеводів, метаболізм нуклеотидів тощо.

Зазначене трактування терміна «обмін речовин» досить умовне. В біохімії людини розглядають як хімічні перетворення, пов’язані з перетравлюванням та всмоктуванням окремих нутрієнтів, так і специфічні реакції, що відбуваються безпосередньо в клітинах.

Для розуміння обміну речовин повинні бути відомими структура речовин, реакції, в які вони вступають, ферменти, які каталізують ці реакції, і регуляторні механізми, що забезпечують нормальний обмін речовин, швидкість послідовних реакцій, при яких відбувається перетворення початкового субстрату в кінцевий продукт. Сукупність таких послідовних реакцій перетворення біомолекули до певного продукту складає метаболічний шлях.

Метаболічний шлях – послідовність біохімічних перетворень, пов’язаних зі специфічним перетворенням сполук у необхідні продукти.

Метаболіти – проміжні продукти метаболічного шляху.

Наприклад, речовина А перетворюється в кінцевий продукт Е в результаті 6 послідовних ферментативних реакцій:

Ферменти, які каталізують ці послідовні стадії, утворюють мультиферментну систему – продукт першої реакції служить субстратом для наступної реакції, каталізується іншим ферментом тощо. Метаболічні шляхи в основному лінійні, хоч можуть бути і циклічні.

Метаболічні шляхи поділяють не лише за видом послідовності реакцій у них, але й за біологічним значенням для життєдіяльності  організму. Виділяють:

Головні метаболічні шляхи – біохімічні перетворення, що пов’язані з розпадом та синтезом найбільш важливих сполук і є загальними для більшості живих організмів.

Специфічні метаболічні шляхи – біохімічні перетворення окремих індивідуальних сполук, які є специфічними для певного виду обміну.

До головних метаболічних шляхів, наприклад, належать синтез ДНК, РНК, білків, цикл Кребсу, синтез жирних кислот, тощо. До специфічних метаболічних шляхів потрібно віднести метаболізм глюкуронової кислоти, сорбітолу, карнозину, анзерину тощо.

У клітинах організму відбуваються синтез і розпад сполук, тобто процеси, які мають взаємопротилежні напрям і кінцевий результат. Тому в метаболізмі виділяють:

Анаболізм (anabole – від грец. підйом)  – сукупність біохімічних процесів синтезу складних біомолекул з більш простих.

Катаболізм (katabole – від грец. руйнація) – сукупність біохімічних процесів розщеплення складних молекул до більш простих, у тому числі до кінцевих продуктів обміну.

Відповідно всі метаболічні шляхи в організмі поділяють на:

1) анаболічні – біохімічні перетворення, які спрямовані на синтез білків, ліпідів, вуглеводів тощо.

2) катаболічні – біохімічні перетворення, які містять реакції розщеплення сполук (гідроліз, окиснення, тощо).

Крім того, існують амфіболічні шляхи, які поєднують процеси катаболізму та анаболізму:

Амфіболізм – процес катаболізму, проміжні метаболіти якого можуть бути використані для синтезу (для анаболізму) інших сполук.

Виходячи з визначення, катаболічний шлях може бути амфіболічним (тобто виконувати амфіболічну функцію) в разі, якщо його проміжні метаболіти вилучаються або використовуються для синтезу інших молекул.

Амфіболічні шляхи надають метаболізму певної гнучкості, що дозволяє здійснювати більш точну регуляцію процесів. Крім того, гіпотетичне існування виключно процесів анаболізму та катаболізму, які мають протилежний напрям реакцій, створювало б цикли (футильні цикли), які б не мали ніякого метаболічного сенсу взагалі, що власне спостерігається при деяких патологічних станах.

Для підсилення метаболічних шляхів, що необхідно, наприклад, для утворення більшої кількості енергії, в клітинах існують анаплеротичні реакції (поповнювальні). Послідовність таких реакцій продукує метаболіт, який потім може надходити в певний метаболічний процес, робота якого стане більш ефективною, тобто процес буде підсилений. З термодинамічної точки зору, всі анаболічні процеси є ендергонічними, тобто відбуваються з поглинанням енергії (реакції синтезу та відновлення).

Відповідно катаболічні процеси – це екзергонічні, тобто супроводжуються виділенням енергії, яка акумулюється у високоенергетичних (макроергічних) сполуках (наприклад, АТФ, креатинфосфат тощо); ці сполуки в подальшому використовуються для анаболічних перетворень (рис. 2). Між катаболізмом та анаболізмом існує взаємозв’язок, який реалізується на енергетичному рівні, а також на рівні субстратів. Катаболічні перетворення постачають енергію для реакцій синтезу.

Крім того, в ході катаболізму відбувається утворення простих сполук, які можуть бути використані для синтезу більш складних.

 

 

Рис. 2. Поєднання ендергонічних процесів з екзергонічними

 

Катаболічні шляхи вивільняють енергію у вигляді АТФ, а також НАДН₂, НАДФН₂ і ФАДН₂. Ця енергія може використовуватись в анаболічних реакціях для синтезу клітинних макромолекул із низькомолекулярних сполук.

У свою чергу, анаболізм постачає складні речовини для катаболізму, реакції якого перетворюють їх у більш прості й проходять з виділенням енергії. Схематично взаємозв’язок анаболізму та катаболізму показано на рис. 3.

Рис. 3. Взаємозв’язок анаболізму та катаболізму на енергетичному рівні

 

http://www.youtube.com/watch?v=MrOK_zWUzpM

 

Катаболізм і анаболізм

 

Звичайно процеси метаболізму ділять на процеси катаболізму (від грец. kata – вниз) й анаболізму (від грец. ana – вгору). Порівняємо основні особливості цих процесів.

 

Таким чином, катаболізм і анаболізм – це пов’язані, взаємодоповнювані процеси, що поєднуються через систему АТФ-АДФ, відновлені й окиснені форми коферментів (НАДН⁺ і НАД⁺), субстрати і продукти.

Шлях катаболізму певної речовини і протилежний шлях синтезу цієї ж речовини звичайно дещо відрізняються. Наприклад, розпад глюкози до молочної кислоти в м’язах складається з 11 послідовних стадій, що каталізуються специфічними ферментами. Зворотний шлях (синтез глюкози з молочної кислоти) здійснюється в печінці й включає 8 ферментативних стадій, спільних із катаболічним шляхом, і 3 стадії, відмінні від нього.

Аналогічне спостерігається під час синтезу і розпаду жирних кислот, білків, нуклеїнових кислот. Завдяки неідентичності катаболічний і анаболічний шляхи регулюються незалежно один від одного. Протилежно спрямовані катаболічні й анаболічні шляхи відрізняються своєю локалізацією в клітині, що дає їм змогу відбуватись одночасно і використовувати енергію, яка звільняється під час розпаду речовин, для біосинтезу в інших місцях клітини. Наприклад, окиснення жирних кислот відбувається в мітохондріях, а синтез – у цитоплазмі.

Розглянемо катаболізм детальніше. У ньому можна виділити три головні стадії (рис. 4).

 

Рис. 4. Стадії катаболізму біомолекул

 

http://www.youtube.com/watch?v=XmrwRAytaMU&feature=related

 

На першій стадії макромолекули білків, жирів і вуглеводів розпадаються до своїх мономерів (гексози, пентози, жирні кислоти, гліцерин, амінокислоти). На другій стадії ці метаболіти перетворюються в один спільний продукт – ацетил-КоА. Ці дві стадії складають специфічні шляхи катаболізму, тобто різні для білків, вуглеводів і ліпідів. На третій стадії ацетил-КоА потрапляє в циклічний процес, який називається циклом лимонної кислоти, або циклом Кребса, і окиснюється до СО₂ і Н₂О. Перетворення піровиноградної кислоти в ацетил-КоА, цикл лимонної кислоти і ланцюг тканинного дихання відносять до загального шляху катаболізму, який завершує специфічні етапи розпаду вуглеводів, ліпідів і білків. Таким чином, під час катаболізму з різних вихідних речовин утворюються однакові кінцеві продукти.

Анаболізм також відбувається в декілька стадій, але є відмінності між тваринами, рослинами і бактеріями щодо тих речовин, з яких починаються анаболічні шляхи. Фотосинтезуючі організми будують вуглеводи із СО₂ і Н₂О. В організмі тварин і людини анаболізм починається з піровиноградної кислоти, ацетил-КоА, з проміжних продуктів циклу лимонної кислоти. Із порівняно невеликої кількості простих молекул-попередників утворюється широкий набір різноманітних макромолекул.

Перетворення білків, ліпідів і вуглеводів складають центральні метаболічні шляхи: потоки метаболітів на цих шляхах досить великі (сотні чи десятки грам). В організмі є ще інші метаболічні шляхи зі значно меншим потоком метаболітів (добовий синтез чи розпад вимірюється міліграмами). Ці шляхи становлять вторинний метаболізм. Роль його полягає в утворенні таких різних біологічно активних речовин, як коферменти, гормони, медіатори, пігменти.

Отже, метаболізм виконує чотири специфічні функції:

1) постачання хімічної енергії, яка отримується шляхом розщеплення багатих енергією харчових речовин, синтезу макроергічних сполук (АТФ та інших), їх використання для виконання різних видів роботи;

2) перетворення молекул харчових речовин у низькомолекулярні метаболіти (будівельні блоки), що застосовуються далі клітиною для побудови макромолекул;

3) синтез білків, ліпідів, полісахаридів, нуклеїнових кислот та інших клітинних компонентів із цих будівельних блоків із використанням енергії АТФ і НАДФН;

4) синтез і розпад низькомолекулярних, біологічно активних речовин, необхідних для виконання будь-яких специфічних функцій.

Усі метаболічні шляхи в кінцевому результаті взаємозв’язані й при порушенні будь-якого з них змін зазнають усі інші.

Організм здійснює тонку регуляцію метаболізму, забезпечуючи принцип максимальної економії. швидкість катаболізму визначається не наявністю в організмі клітинного палива (глюкози, жиру), а потребою в енергії. Білки, нуклеїнові кислоти та їх структурні компоненти синтезуються тільки тоді, коли вони потрібні, й у такій кількості, яка необхідна. Надлишок харчових речовин відкладається в організмі тварин і людини. Такими запасними речовинами є глікоген і жир, а білки і нуклеїнові кислоти в запас не відкладаються.

 

РЕГУЛЯЦІЯ ОБМІНУ РЕЧОВИН

 

Є декілька видів регуляторних механізмів:

1) регуляція швидкості надходження метаболітів у клітину;

2) регуляція синтезу ферментів шляхом індукції і репресії;

3) регуляція активності наявних ферментів шляхом алостеричної регуляції, ковалентної модифікації, активації проферментів.

В організмі людини клітини різних органів і тканин диференційовані для виконання специфічних біохімічних і фізіологічних функцій. Тому існують системи, які узгоджують і координують роботу різних органів і тканин. Таку інтегруючу роль відіграють гормональна (ендокринна) і нервова системи (рис. 5), а також судинна система, яка служить для перенесення всіх хімічних речовин в організмі. У нормі ці системи взаємодіють, доповнюючи одна одну.

Дорослий здоровий організм знаходиться в стаціонарному стані й головним фактором, який визначає баланс процесів обміну речовин, є співвідношення між споживанням їжі й витратою енергії.

Рис. 5. Регуляція обміну речовин

 

Недостатнє харчування швидко призводить до зворотної мобілізації енергії із депонованих продуктів, однак тривале голодування чи неповноцінне харчування викликає незворотний розпад тканин. Процеси катаболізму часто переважають в умовах патології. А в період одужання після захворювань, у процесі загоювання ран, у молодому організмі, який росте, та під час вагітності переважає анаболізм. Патологічно виражена перевага анабо­лізму може призвести до надмірного росту – гігантизму (рис. 6), чи ожиріння (рис. 7).

Для біохімічної діагностики захворювань використовують той факт, що регуляторні механізми підтримують концентрацію ряду важливих метаболітів у певних межах (рівень норми), а при патології концентрація їх змінюється, причому ці зміни часто бувають специфічними для тієї чи іншої хвороби. Оскільки концентрація метаболітів змінюється і внаслідок споживання їжі, переходу від спокою до фізичної роботи, то дослідження проводять звичайно натще, після нічного сну.

Рис. 6. Гіпофізарний гігантизм

http://doktorland.ru/gigantizm_nanizm.html

 

Рис. 7.  Ожиріння в дитячому віці

 

http://ua.korrespondent.net/tech/health/1399452-dityache-ozhirinnya-zbilshue-rizik-rozvitku-sercevo-sudinnih-zahvoryuvan-u-zrilomu-vici

 

МЕТОДИ ВИВЧЕННЯ ОБМІНУ РЕЧОВИН

 

У процесі вивчення обміну речовин дослідника цікавить, яких перетворень зазнають речовини (субстрати) і які ферменти каталізують їх, як забезпечуються енергією хімічні процеси, які поживні речовини потрапляють у клітини і як виводяться кінцеві продукти обміну.

Для вивчення обмінних процесів в організмі використовуються різноманітні методичні підходи на різних рівнях організації живого (рис. 8): цілісного організму, ізольованих органів, тканинних зрізів, гомогенатів, екстрактів, субклітинних структур, біорідин та ін. При цьому використовуються сучасні фізико-хімічні й біохімічні методи виділення, розділення, ідентифікації й кількісного визначення речовин:

Рис. 8. Дослідження обміну речовин на рівні всього організму

 

1) балансові – на цілісному організмі визначаються загальні кількісні зрушення речовин за їх поглинанням і виділенням кінцевих продуктів обміну (розрахунок балансу приходу-витрати);

2) манометричні – для вивчення загальних обмінних процесів у спеціальних апаратах;

3) хроматографічні – для визначення наявності й кількісних зрушень тих або інших молекул;

4) авторадіографічні – з використанням мічених атомів для встановлення на цілісному організмі розподілу, біосинтезу і розпаду тих або інших речовин в органах і тканинах;

5) гістохімічні – для встановлення наявності тих чи інших молекул у клітинах різних органів і тканин;

6) спектрофотометричні – для визначення кількісних зрушень за спектром поглинання;

7) електрофорез – для розділення, ідентифікації й кількісного визначення речовин;

8) ферментативні методи  – за специфічністю дії ферментів тощо.

Найчастіше при вивченні обміну речовин застосовується одночасно декілька підходів. Інформація, отримана за допомогою різних методів, потім інтегрується, що й дає можливість відповісти на питання, які зміни в обміні речовин відбуваються в нормі та за різних патологічних станів.

Існує ряд способів, які дають можливість з’ясувати роль перетворення окремих речовин в організмі.

Найчастіше згодовують лабораторних тварин штучними раціонами, в яких відсутня необхідна для організму речовина. На основі таких експериментів сформувалися поняття про незамінні поживні речовини. Вони потрібні для підтримання на стаціонарному рівні обмінних процесів дорослого організму або для росту і розвитку молодого орга­нізму. Сюди були віднесені вітаміни, деякі амінокислоти та поліненасичені жирні кислоти, мінеральні речовини, макро- і мікроелементи.

Такі речовини обов’язково повинні потрапляти в організм із продуктами харчування. Спостереження за людьми, в раціоні яких була недостатня кількість свіжих овочів і фруктів, показали, що вони хво­ріють на цингу, а у випадках обмеження надходження з продуктами харчування рослинних жирів у них спостерігається "куряча сліпота". Результати аналогічних спостережень підтвердились в експериментах на тваринах і сприяли відкриттю вітамінів С, А тощо.

 

Балансові дослідження

Їх також проводять на всьому організмі. Вони дають змогу встановити добову потребу та ступінь засвоєння певних речовин їжі.

В основі балансових досліджень знаходиться визначення співвідношення між кількістю речовин, що потрапляють в організм, та кількістю речовин (або продуктів їх розщеплення), що виводяться з організму через органи виділення. Ці дослідження проводяться в так званих обмінних (метаболічних) клітках, в яких для кожної експериментальної тварини враховується кількість спожитих продуктів і виділених кінцевих метаболітів. Найчастіше вивчають азотний, водний та мінеральний баланси.

Якщо в організм з їжею і водою потрапляє більше речовин, ніж виводиться, то має місце позитивний балансовий обмін. Наприклад, при позитивному балансі води спостерігається затримка води в організмі й зменшене її виділення з екскрементами та потом. Негативний баланс води супроводжується надмірним виділенням води, тобто тканини втрачають її. У тих випадках, коли надходження речовини в організм зрівноважується такою ж кількістю продуктів кінцевого обміну, то говорять про нульовий баланс. Оскільки балансові дослідження обміну речовин проводять, як правило, на різних лабораторних тваринах (морських свинках, щурах, мишах, курчатах), то результати можуть бути різними. Найближчі до метаболізму людини результати можна одержати при проведенні балансових досліджень на мавпах та інших приматах.

У клініці нерідко проводять балансові дослідження при вивченні обміну білків, води, мінеральних речовин у здорових і хворих людей.

Цей метод досить інформативний і не має протипоказань для проведення.

 

Експериментальні нориці

Експериментальні нориці допомагають вивчати обмін речовин в окремих органах чи тканинах за життя експериментальних тварин.

Хірургічним способом у різних ділянках шлунково-кишкового тракту, зокрема на жовчних протоках тварин, створюють штучні нориці, а далі збирають кров чи лімфу, що надходить у відповідний орган і що відтікає від нього. Збирають також секрети, що виділяються у різних ділянках шлунково-кишкового тракту, і досліджують вміст окремих речовин та продуктів їх обміну. Метод дає можливість стежити за перетворенням сторонніх речовин, внесених в організм per os або парентерально.

 

Катетеризація кровоносних судин

Участь будь-якого органа в метаболізмі можна оцінювати, порівнюючи хімічний склад крові, що надходить до нього по артеріях і відтікає через вени.

За допомогою цього методу досліджують також вплив на метаболізм специфічних речовин при введенні їх в артеріальну кров. Наприклад, катетеризація сонної артерії та яремної вени дає можливість з’ясувати роль мозку в перетворенні амінокислот, глюкози чи інших речовин, які можна додатково вводити через катетер в артерію, і стежити за зміною їх концентрації (або їх метаболітів) у венозній крові.

 

Ізотопні індикатори

Метод ізотопних індикаторів застосовують in vivo та in vitro. Вони дають змогу маркувати специфічні ділянки ферментів або їх активні центри і стежити за перетворенням складових компонентів організму при їх додатковому потраплянні в організм.

У біології і медицині використовують ізотопи таких елементів: Н, N, С, S, Р, О; працюють також з ізотопами I, Na, K, FeiCa. Крім стабільних ізотопів Н (²Н), N (¹⁵N) і О (¹⁸О), широко застосовують нестабільні (радіоактивні) ізотопи. Ізотопні атоми входять до складу простої молекули: ¹⁴СО₂, ²Н₂О, ²⁴NаСI, К¹³¹І, NаН³²РО₄. Мічені сполуки одержують шляхом включення позначених атомів під час синтезу або біосинтезу цих сполук. Наприклад, для одержання міченого альбуміну сироватки крові вносять у раціон тварин амінокислоту з радіоактивною міткою, а потім із плазми виділяють альбумін.

Метод ізотопних індикаторів є надзвичайно важливим для визначення швидкості процесів та з’ясування механізмів підтримання на постійному рівні тих чи інших компонентів. Він дає можливість стежити за шляхом перетворення даної речовини в організмі. У такому випадку вводиться мічена ізотопом певна речовина, а далі досліджують появу ізотопної мітки в продуктах її перетворення. За допомогою методу мічених атомів була сформована концепція про безперервне поновлення складових компонентів організму.

Завдяки поєднанню специфічних імунологічних методів із методом ізотопних індикаторів з’явилася можливість оцінювати кількість деяких компонентів крові й метаболітів із низькою молекулярною масою.

Цей метод, названий радіоімунним аналізом, базується на утворенні в експериментальної тварини антитіл у результаті ін’єкції антигенного білка чи речовини з низькою молекулярною масою, що не має антигенних властивостей, але перетворюється в гаптен, зв’язуючись із певним білковим переносником.

Утворені антитіла, що спрямовані проти внесеного антигену чи гаптену, мітять (найчастіше йодом-125) і використовують для проведення специфічних реакцій антитіло-антиген у біологічній рідині.

Методом радіоімунного аналізу можна визначати нанограмові кількості речовин, швидкість зникнення введених речовин (за періодом напіврозпаду), інтенсивність розпаду речовини в судинній системі, локалізацію внесених речовин у тканинах-мішенях, а також ступінь зв’язування їх із специфічними рецепторами.

 

Дослідження in vitro

Метод ізольованих органів

Хірургічне виділення органів – один із найдавніших підходів до вивчення метаболізму. Наприклад, відомості про метаболічну роль печінки були одержані в результаті спостережень за собаками, в яких хірургічно видалили печінку. Зокрема, так була встановлена роль печінки в утворенні сечовини, глікогену тощо.

Через ізольований орган безупинно прокачують поживну речовину (перфузія) і цим підтримують його життєдіяльність. Перфузію проводять за допомогою плазми крові, фізіологічного розчину, в які додають ті речовини, що підлягають вивченню.

Досліджуючи склад рідини на вході й виході з органа, можна з’ясувати шляхи перетворення внесених речовин і роль відповідних органів у метаболізмі.

Значення цих методів помітно збільшилось з використанням ізотопних індикаторів. Наприклад, вводячи в артерію ізольованої печінки розчин глюкози і визначаючи її вміст на виході з органа (у венозній крові), встановлено, що глюкоза затримується в печінці. А наступні дослідження з використанням мічених атомів показали, що глюкоза в печінці окиснюється до СО₂ і Н₂О, використовується на утворення глікогену, жирів та амінокислот.

Метод ізольованих органів у поєднанні з перфузією є високоінформативним, але він не дає змоги враховувати контроль ендокринної та нервової систем за обміном речовин, що має місце в усьому організмі.

 

Метод зрізів органів і тканин

Тонкі зрізи завтовшки приблизно 50 мкм отримують із печінки, нирки, мозку та інших органів. Їх поміщають у рідке середовище, яке за хімічним складом близьке до внутрішнього середовища організму. Додаючи в омиваючу рідину різні речовини, стежать за їх змінами та роблять висновки про їх перетворення у відповідних органах.

 

Гомогенати і субклітинні фракції

Зрізи органів містять також неушкоджені клітини, захищені клітинними мембранами та оболонками. Проникність клітинних мембран для різних хімічних речовин неоднакова, таким чином регулюються надходження та видалення речовин із клітин.

При руйнуванні клітинних мембран з’являється можливість для безпосереднього контакту між вмістом клітини і доданими речовинами. Це дає змогу встановити, які ферменти, коферменти і субстрати беруть участь у досліджуваному процесі.

Для одержання гомогенатів орган розрізають на дрібні шматочки, які поміщають у рідке ізотонічне середовище відомого складу (наприклад, 0,25 М розчин сахарози) і розтирають у ступці з піском, але в більшості випадків використовують спеціальний пристрій – гомогенізатор. Найпоширенішим є гомогенізатор Поттера. Це скляна товстостінна пробірка зі сферичним дном, в якій знаходиться підігнаний поршень, що може обертатися навколо осі за допомогою електромотора (рис. 9 ).

Рис. 9. Гомогенізатор Поттера

 

Пробірку з поміщеними в ній шматочками тканини рухають вгору і вниз. Тканина при цьому розтирається, клітини руйнуються, але субклітинні частинки залишаються непошкодженими. Таким чином одер­жують гомогенат, який значною мірою зберігає біологічну активність.

http://www.youtube.com/watch?v=tzRsaFwSI2s

 

Субклітинні структури

Дослідження субклітинних структур (органел) стало можливим після освоєння методу диференційованого ультрацентрифугування. Сучасні ультрацентрифуги розвивають прискорення, яке в 300 000 разів перевищує прискорення земного тяжіння.

Для одержання субклітинних фракцій гомогенат суспензують у сахарозі й фракціонують багаторазовим центрифугуванням на холоді. Центрифугування з прискоренням 700-1000 g (g – прискорення земного тяжіння, см/с²) протягом 10 хв осаджує уривки клітинних мембран і ядра, які є найтяжчими компонентами клітини (рис. 10).

Рис. 10. Схема послідовності операцій для розділення субклітинних фракцій за допомогою ультрацентрифугування

ДОХ – дезоксихолат натрію

 

Надосадкову рідину від першого центрифугування знову центрифугують при 10000 g протягом 10 хв. В осад випадають переважно мітохондрії, а також лізосоми. Із надосадкової рідини від другого центрифугування під дією відцентрової сили в 100 000 g протягом не менше 1 години осаджують мікросоми і рибосоми.

Остання надосадкова рідина містить цитозоль, тобто розчинені компоненти (в даному випадку – в розчині сахарози).

У табл. 1 наведено типові фракції, які можна одержати при диференційованому центрифугуванні, й показано найважливіші ферментативні системи кожної з них.

Таблиця 1. Типові фракції клітин, що одержують при диференційованому центрифугуванні гомогенатів

 

Дослідження культури тканин

Метод культури тканин дозволяє досліджувати біохімічні процеси в популяціях тваринних клітин і в ряді наступних клітинних генерацій. Клітини і тканини можуть вирощуватися тільки в середовищі з певним хімічним складом. У середовищі повинен бути набір усіх факторів, ­необхідних для росту і підтримання життєдіяльності клітин (вітаміни, амінокислоти, мікроелементи тощо).

У культурі тканини вирощують багато різних типів клітин, як здорових, так і злоякісних. На тканинних культурах вивчають різні впливи фізичних і хімічних факторів, моделюють різні біологічні процеси, досліджують дію ліків тощо.

Протягом останніх років техніка вирощування культури тканини дозволяє робити трансплантацію гепатоцитів, одержаних від ембріона чи молодого організму з метою компенсації ураженої печінки. Ця методика розглядається як альтернатива пересадці органів. Найчастіше для вирощування в культурі використовують клітини, виділені з ізольованого органа за допомогою ферменту колагенази або трипсину.

 

ОКИСНЮВАЛЬНЕ ДЕКАРБОКСИЛЮВАННЯ ПІРОВИНОГРАДНОЇ КИСЛОТИ

 

Процес окиснювального декарбоксилювання пірувату включає реакції дегідрування і декарбоксилювання, коли карбоксильна група пірувату вивільняється у вигляді СО₂, а ацетильний залишок, тобто залишок оцтової кислоти, переноситься на коензим А:

Каталізує цю сукупність реакцій складний піруватдегідрогеназний комплекс, локалізований у мітохондріях. Тому спочатку піруват переходить із цитоплазми, де відбувається гліколіз, у матрикс мітохондрій.

Піруватдегідрогеназний комплекс складається з 3 різних ферментів: піруватдегідрогенази, дигідроліпоатацетилтрансферази і дигідроліпоатдегідрогенази. До його складу входять 5 коферментів: тіамін-дифосфат (ТДФ), коензим А (КоА), ліпоєва кислота, НАД і ФАД. ТДФ – це похідне вітаміну В₁ (тіаміну), КоА – вітаміну В₃ (пантотенової кислоти), НАД – вітаміну РР (нікотинаміду), ФАД – вітаміну В₂ (рибофлавіну), а ліпоєва кислота є вітаміноподібною сполукою. При нестачі цих вітамінів окиснювальне декарбоксилювання піровиноградної кислоти і ряду інших альфа-кетокислот гальмується; накопичення пірувату і лактату зумовлює ацидоз. У хворих із спадковою недостністю піруватдегідрогенази також може розвинутись ацидоз, особливо після навантаження глюкозою.

Кожний із ферментів піруватдегідрогеназного комплексу каталізує певний етап сумарної реакції, причому ультраструктура комплексу, компактне розміщення всіх компонентів забезпечують ефективну роботу без звільнення проміжних продуктів до завершення процесу. На рис. 11, 12 схематично наводиться послідовність реакцій.

На 1-й стадії піруватдегідрогеназа (Е₁) каталізує декарбоксилювання пірувату з утворенням гідроксіетильного похідного, приєднаного до коферменту ТДФ. Цей проміжний продукт на 2-й стадії взаємодіє з ліпоєвою кислотою – простетичною групою другого ферменту комплексу дигідроліпоатацетилтранс­ферази (Е₂). Ліпоєва кислота може існувати в окисненій (дисульфідній), відновленій (дигідроліпоєва кислота) і відновленій ацильованій формах. Умовно їх позначають так:

При взаємодії дисульфідної форми ліпоєвої кислоти з гідроксі­етильною групою остання окиснюється до ацетильної групи і зв’язу­ється з атомом сірки відновленої ліпоєвої кислоти. Ця окисно-відновна реакція супроводжується утворенням макроергічного тіоефірного зв’язку.

Рис. 11. Стадії окиснювального декарбоксилювання піровиноградної кислоти

 

Дигідроліпоатацетилтрансфераза каталізує перенесення ацетильного залишку з ацетилліпоєвої кислоти на КоА з утворенням ацетил-КоА і дигідро­ліпоєвої кислоти (3-я стадія).

Таким чином, перші три реакції здійснюють перетворення пірувату і КоА в продукти – ацетил-КоА і СО₂.

Дві наступні стадії необхідні для отримання вихідної окисненої форми ліпоєвої кислоти. Дигідроліпоатдегідрогеназа, яка містить простетичну групу ФАД, окиснює дигідроліпоєву кислоту (4-а стадія) і далі передає 2 атоми водню з ФАДН₂ на НАД⁺ (5-а стадія).

Після завершення процесу три коферменти (ТДФ, ліпоєва кислота і ФАД), зв’язані з ферментами, знаходяться у своїй вихідній формі й можуть брати участь у наступному циклі. Два інші коферменти дисоцію­ють з комплексу. Коензим А поставляє ацетильну групу в цикл ­лимонної кислоти, а НАДН, Н⁺ передає водень на мітохондріальний дихальний ланцюг.

 

Рис. 12. Схема піруватдегідрогеназного комплексу

Процес окиснювального декарбоксилювання пірувату супроводжується значним зменшенням стандартної вільної енергії і практично незворотний. Активність піруватдегідрогеназного комплексу регулюється двома способами. По-перше, продукти реакції – ацетил‑КоА і НАДН – є алостеричними інгібіторами комплексу. І тоді, коли окиснення ацетил-КоА в циклі лимонної кислоти відстає від утворення його пірувату чи жирних кислот, активність піруватдегідрогеназного комплексу гальмується. Такий же ефект має місце при накопиченні НАДН внаслідок перевантаження дихального ланцюга. Активує комплекс фруктозо-1,6-дифосфат – проміжний продукт гліколізу. Алостеричні ефекти проявляються дуже швидко.

Другий механізм регуляції (повільніший) – це переходи між активною і неактивною формами ферменту внаслідок фосфорилювання і дефосфорилювання (рис. 13).

 

Рис. 13. Регуляція піруватдегідрогеназного комплексу

 

Фосфорильована форма піруватдегідрогенази неактивна, а нефосфорильована – активна. Реакцію фосфорилювання ферменту під дією АТФ каталізує кіназа піруватдегідрогенази, яка активується при високому рівні НАДН і АТФ.

Отже, в таких умовах піруватдегідрогеназний комплес виключається. Протилежний процес активації піруватдегідрогенази шляхом дефосфорилювання каталізує фосфатаза, яка активується іонами Са⁺². Рівень їх у клітині завжди зростає при збільшенні потреби в АТФ. Кіназа і фосфатаза входять до складу піруватдегідрогеназного мультиферментного комплексу.

 

ЦИКЛ ЛИМОННОЇ КИСЛОТИ

В аеробних умовах вуглеводи окиснюються повністю до СО₂ і Н₂О. Гліколіз становить першу стадію окиснення вуглеводів і закінчується утворенням піровиноградної кислоти, яка не відновлюється до молочної кислоти, як в анаеробних умовах, а окиснюється до ацетил-КоА і СО₂. Далі двовуглецеві ацетильні групи (з ацетил-КоА) окиснюються до СО₂ і Н₂О в ході циклічної послідовності реакцій, що називаються циклом лимонної кислоти, і реакцій тканинного дихання.

При окисненні глюкози до СО₂ і Н₂О вивільнюється значно більше енергії, ніж при гліколізі (максимально 38 моль АТФ на 1 моль глюкози проти 2 моль АТФ при анаеробному гліколізі). АТФ утворюється головним чином шляхом окиснювального фосфорилювання, поєднаного з тканинним диханням.

http://www.youtube.com/watch?v=A1DjTM1qnPM&feature=related

Реакції циклу лимонної кислоти

Цикл лимонної кислоти називають також циклом Кребса (на честь Г. Кребса – лауреата Нобелівської премії 1953 р., який відкрив його у 1937 р.) та циклом трикарбоновних кислот, оскільки ряд проміжних продуктів циклу є трикарбоновими кислотами.

 

 

КРЕБС Ханс Адольф, сер (Krebs, Sir Hans Adolf; 1900, Хільдесхайм, Німеччина, – 1981, Оксфорд, Великобританія), англійський біохімік. У 1925 р. закінчив Гамбурзький університет. До 1930 р. працював у О.Г. Варбурга в Берліні, потім у медичному інституті міста Фрайбург. У 1933 р., після приходу до влади нацистів, емігрував до Англії, вів наукову роботу в Кембріджському університеті, де в 1934р. отримав ступінь магістра, а потім у ряді англійських університетів, займався дослідженням циклічних реакцій метаболізму клітини (в роки Другої світової війни вивчав також проблеми авітамінозу). З 1947 р.  Кребс – член Лондонського королівського товариства, в 1958 р. зведений у дворянство. З 1967 р. він був професором Королівської лікарні в Оксфорді.

Кребсу належить одне з найважливіших біохімічних відкриттів 20 ст. – встановлення послідовності окисних перетворень лимонної та інших три- та дикарбонових кислот у живих організмах (цикл Кребса). Він описав також орнітиновий цикл синтезу сечовини в печінці тварин. Його наукові досягнення були відзначені Нобелівською премією (1953 р.).

http://www.youtube.com/watch?v=hw5nWB0xN0Y&feature=related

 

Цикл Кребса виконує такі функції:

1) інтегративну  – поєднує шляхи метаболічних перетворень ліпідів, вуглеводів, білків: вказані паливні молекули можуть розщеплюватися до інтермедіатів циклу і синтезуватися з них;

2) енергетичну – в циклі Кребса є одна реакція субстратного фосфорилювання, в якій утворюється 1 молекула ГТФ; потім ГТФ бере участь в утворенні 1 молекули АТФ (тобто енергетичний баланс самого циклу, без подальших перетворень відновних еквівалентів, становить 1 АТФ);

3) воденьгенеруючу – цикл є головним генератором Н⁺ для роботи дихального ланцюга, тому що в циклі Кребса відбувається відновлення НАД⁺ до НАДН^.Н⁺ та ФАД до ФАДН₂; далі НАДН^.Н⁺ та ФАДН₂ окиснюються в дихальному ланцюзі, робо-та якого приводить до синтезу АТФ (тому сумарний енергетичний баланс одного циклу більше ніж 1 АТФ і становить 12 молекул АТФ – розрахунок буде наведений нижче);

4) амфіболічну – інтермедіати цього катаболічного процесу можуть бути використані для синтезу інших сполук. Виведення проміжних метаболітів з циклу повинно бути пов’язане з високою катаболічною активністю циклу Кребса для продукції АТФ.

Під час виведення інтермедіатів циклу лимонної кислоти для синтетичних процесів їх концентрація не повинна суттєво знижуватися, тому що це може нашкодити процесу генерації енергії. Тому в клітині існують «запобіжні клапани», які допомагають підтримувати концентрацію проміжних метаболітів циклу на необхідному рівні – це анаплеротичні реакції.

До таких реакцій належить:

-       піруваткарбоксилазна реакція, яка каталізує утворення оксалоацетату з пірувату (одна з основних анаплеротичних реакцій);

-       аспартат-амінотрансферазна реакція, яка каталізує утворення оксалоацетату з аспартату;

-       глутаматдегідрогеназна реакція, яка каталізує утворення α-кетоглутарату з глутамату;

-        утворення сукциніл-КоА з пропіоніл-КоА, який, у свою чергу, утворюється при катаболізмі амінокислот з розгалуженим ланцюгом (Вал, Іле) та жирних кислот з непарним числом атомів вуглецю (один з основних анаплеротичних процесів);

-       утворення фумарату при катаболізмі ароматичних амінокислот (Фен, Тир);

-       γ-амінобутиратний шунт – процес, який відбувається в мозку і пов’язаний з утворенням ГАМК (гамма-аміномасляної кислоти) – важливого нейромедіатора гальмування, та  її катаболізмом до сукциніл-КоА.

10% глюкози мозку використовується для функціонування цього процесу, тобто він є вкрай важливим для нормальної роботи мозку.

Таким чином, на рівні циклу Кребса відбувається ефективна координація катаболічних та анаболічних процесів, що можливо завдяки існуванню численних високоточних регуляторних механізмів.

Цикл лимонної кислоти включає послідовно 8 реакцій, у результаті яких ацетильна група (СН₃СО^-) ацетил-КоА розпадається з утворенням СО₂ і атомів водню, які передаються на окиснені форми коферментів НАД і ФАД. Послідовність не лінійна, а циклічна, оскільки починається з конденсації двовуглецевої ацетильної групи з щавлевооцтовою кислотою (з чотирма атомами вуглецю). В результаті виникає лимонна кислота (з шістьма атомами вуглецю), далі в реакції декарбоксилювання виділяються 2 молекули СО₂ і в останній реакції циклу знову утворюється щавлево­оцтова кислота (рис. 14).

web-local.rudn.ru/web-local/kaf/rj/index.php?id=8&mod=video

Рис. 14. Схема циклу лимонної кислоти

1.    Проміжні продукти циклу можна назвати як кислоти і як аніони кислот.

2.    Цифрами вказано число атомів вуглецю у сполуках (в ацетил-КоА і сукциніл-КоА – без вуглецевих атомів коензиму А).

 

Ацетил-КоА утворюється не тільки з пірувату, а й із жирних кислот, амінокислот, тому цикл лимонної кислоти розглядається як загальний, кінцевий шлях катаболізму вуглеводів, жирів і амінокислот. Усі реакції циклу відбуваються в мітохондріях. Відновлені НАДН і ФАДН₂, які утворюються у реакціях дегідрування циклу, окиснюються шляхом переносу протонів і електронів по дихальному ланцюгу внутрішньої мембрани мітохондрій на кисень.

http://www.youtube.com/watch?NR=1&v=-_8aYKcQZ_Q

1.     Реакцію конденсації ацетил-КоА з оксалоацетатом з утворенням цитрату каталізує цитрат-синтаза.

Реакція не вимагає затрати АТФ, а необхідна енергія забезпечується гідролізом тіоефірного зв’язку ацетил-КоА. Цитрат-синтаза – регуляторний фермент циклу, активність його гальмується АТФ, НАДН і проміжним продуктом циклу – сукциніл-КоА.

2. Цитрат ізомеризується в ізоцитрат двохетапною реакцією під дією аконітази. При відщепленні молекули води утворюється цис-аконітова кислота, яка, не відділяючись від активного центру ферменту, приєднує ту ж молекулу води іншим способом. Реакція зворотна:

3. Ізоцитрат окиснюється шляхом дегідрування й одночасно декарбоксилюється під дією ізоцитратдегідрогенази:

Для дії ферменту потрібні іони Мg²⁺ чи Мn²⁺. Алостеричні активатори ізоцитратдегідрогенази – АДФ і НАД⁺, інгібітори – АТФ і НАДН. У цитоплазмі клітин відкрита НАДФ-залежна ізоцитратдегідрогеназа.

4. Окиснювальне декарбоксилювання альфа-кетоглутарату до сукциніл-КоА каталізує альфа-кетоглутаратдегідрогеназний комплекс, що, як і піруват­дегідрогеназний комплекс, включає 3 ферменти і 5 коферментів – ТДФ, ліпоєву кислоту, КоА, ФАД і НАД⁺. Механізм реакції також аналогічний до окиснювального декарбоксилювання пірувату. Частина енергії, що вивільняється в реакції окиснення, зберігається в макроергічному тіоефір­ному зв’язку сукциніл-КоА. Активність альфа-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу гальмують АТФ і продукти реакції – НАДН і сукциніл-КоА.

5. У наступній реакції розрив макроергічного зв’язку сукциніл-КоА при перетворенні у вільний сукцинат поєднаний з утворенням гуанозинтрифосфату, так що енергія макроергічного зв’язку зберігається:

Отже, ця реакція субстратного фосфорилювання аналогічна реакціям синтезу АТФ у процесі гліколізу. Каталізує її сукциніл-тіокіназа. Синтезований ГТФ може передати свою кінцеву фосфатну групу на АДФ з утворенням АТФ при дії нуклеозиддифосфаткінази:

6. Сукцинат окиснюється до фумарату. Сукцинатдегідрогеназа, яка каталізує цю реакцію, містить простетичну групу ФАД, що відновлюється до ФАДН₂, і залізо-сірчані центри:

Конкурентним інігібітором сукцинатдегідрогенази є малонова кислота. Серед ферментів циклу лимонної кислоти тільки сукцинатдегідрогеназа локалізована на внутрішній мембрані мітохондрій, а інші знаходяться в їх матриксі.

7. Стереоспецифічний фермент фумараза (фумаратгідратаза) ката­лізує гідратацію фумарової кислоти в L-яблучну (малат):

8. Малат окиснюється НАД-залежною малатдегідрогеназою до оксалоацетату:

Молекула оксалоацетату може з’єднуватись із новою молекулою ацетил-КоА і починати новий оберт циклу.

На рис. 15 показана послідовність реакцій циклу Кребса. Аналіз послідовності дозволяє зробити ряд висновків:

1. У цикл входить двовуглецева ацетильна група (в складі ацетил-КоА), а виходять 2 молекули СО₂.

2. У чотирьох реакціях дегідрування від проміжних продуктів циклу відриваються 4 пари атомів водню. Із них 3 пари використовуються на відновлення НАД⁺, а одна пара – ФАД.

3. Частина атомів кисню, необхідних для утворення СО₂, і атомів водню – для відновлення коферментів, постачаються молекулами води, які застосовуються в реакціях циклу.

 

Рис. 15. Цикл Кребса

4. Молекула оксалоацетату, що потрапляє в цикл, у результаті ­одного оберту циклу регенерується. Таким чином, оксалоацетат у циклі не витрачається і наново не утворюється (як і інші проміжні продукти циклу).

5. Один раз у циклі має місце реакція субстратного фосфорилювання, коли за рахунок макроергічного зв’язку субстрату утворюється молекула ГТФ (АТФ).

http://www.youtube.com/watch?v=3OmMOcbTqE4&feature=related

 

Хімічні формули інтермедіатів циклу лимонної кислоти наведені в табл. 2.

Таблиця 2. Хімічні формули проміжних метаболітів циклу Кребса

 

Сумарне рівняння циклу лимонної кислоти має вигляд:

Для нових обертів циклу відновлені коферменти повинні окиснитись, що відбувається шляхом переносу електронів і протонів по дихальному ланцюгу внутрішньої мембрани мітохондрій на молекулярний кисень з утворенням молекул води. Саме тому цикл лимонної кислоти є аеробним киснезалежним шляхом, хоч у жодній реакції циклу молекулярний кисень не використовується. За рахунок окиснювального фосфорилювання, поєднаного з переносом електронів і протонів по дихальному ланцюгу, забезпечується синтез основної кількості АТФ. Враховуючи, що окиснення однієї молекули НАДН призводить до утворення 3 молекул АТФ, окиснення однієї молекули ФАДН₂ – 2 АТФ, загальний вихід АТФ при окисненні однієї молекули ацетил-КоА складає:

Участь вітамінів у роботі циклі лимонної кислоти

Для роботи циклу потрібні п’ять вітамінів:

1)       В₁ (тіамін) у вигляді тіаміндифосфату (ТДФ) є коферментом α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу;

2)       В₂ (рибофлавін), коферментна форма якого – ФАД, є складовою α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу та сукцинатдегідрогенази;

3)       РР (ніацин) у вигляді НАД входить до складу трьох дегідрогеназ ЦЛК (ізоцитратдегідрогенази, α-кетоглута-ратдегідрогеназного комплексу, малатдегідрогенази);

4)       В₅ (пантотенова кислота) входить до складу коферменту А (КоА), який бере участь в активації ацильних залишків і утворює ацетил-КоА та сукциніл-КоА;

5)       ліпоєва кислота – дві молекули цієї кислоти у вигляді аміду входять до складу α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу (другого ферменту комплексу Е₂ ).

Тобто у складі α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу функціонують  В₁, В₂, РР, ліпоєва кислота.

 

Енергетичний баланс аеробного розпаду глюкози

Для з’ясування кількості АТФ, яка синтезується при повному окисненні глюкози до СО₂ і Н₂О, необхідно сумувати вихід АТФ у кожній стадії процесу:

1) гліколізу в аеробних умовах;

2) окиснювального декарбоксилювання пірувату;

3) циклу лимонної кислоти;

4) дихального ланцюга.

При гліколітичному розпаді однієї молекули глюкози в аеробних умовах утворюються 2 молекули піровиноградної кислоти, 2 АТФ і 2 НАДН:

   Окиснювальне декарбоксилювання двох молекул пірувату дає 2 ацетил-КоА і 2 НАДН:

   При окисненні 1 молекули ацетил-КоА, як розглянуто вище, утворюється 12 молекул АТФ. Окиснення в дихальному ланцюгу молекул НАДН, які утворюються при гліколізі й окиснювальному декарбоксилюванні пірувату, дає по 3 АТФ на 1 НАДН.

Сумуємо:

Сумарний вихід АТФ у результаті повного окиснення 1 молекули глюкози складає 38 молекул (або 38 моль на 1 моль глюкози). Із 38 молекул чотири синтезуються шляхом субстратного фосфорилювання (2 – в гліколізі й 2 – в циклі лимонної кислоти) і 34 – в ході окиснювального фосфорилювання, поєднаного з перенесенням електронів по дихальному ланцюгу.

Проте в такому розрахунку не прийнято до уваги, що гліколіз відбувається в цитоплазмі, а тканинне дихання з окиснювальним фосфорилюванням – у мітохондріях. Мембрана мітохондрій непроникна для НАДН, утвореного під час гліколітичного окиснення гліцеральдегід-3-фосфату в цитоплазмі. Тому для передачі водню з цитоплазматичних НАДН на дихальний ланцюг внутрішньої мембрани мітохондрій існують особливі системи, які називаються човниковими. Механізм їх дії такий: цитоплазматичний НАДН відновлює якусь речовину, її відновлена форма переноситься через мембрану в матрикс мітохондрій, де окиснюється НАД- чи ФАД-залежним ферментом і повертається в цитоплазму. Відновлений НАДН чи ФАДН віддає електрони і протони на дихальний ланцюг внутрішньої мітохондріальної мембрани.

У клітинах печінки, міокарда і нирок функціонує малат-аспартатна човникова система (рис. 16), яка забезпечує утворення 3 молекул АТФ на одну молекулу цитоплазматичного НАДН.

Рис. 16. Малат-аспартатна човникова система

1 – малатдегідрогеназна реакція в цитоплазмі;

2 – малатдегідрогеназна реакція у мітохондріях;

3 – аспартатамінотрансферазна реакція у мітохондріях;

4 - аспартатамінотрансферазна реакція в цитоплазмі.

 

У скелетних м’язах і клітинах мозку перенос водню з цитоплазматичного НАДН здійснює гліцеролфосфатна човникова система (рис. 17).

У цьому випадку мітохондріальна гліцерол-3-фосфатдегідрогеназа є флавіновим ферментом, який передає 2 атоми водню на убіхінон, тому утворюються не 3 молекули АТФ, а 2.

Таким чином, у скелетних м’язах і мозку окиснення 2 молекул цитоплазматичного НАДН дає 4 молекули АТФ.

Рис. 17. Гліцеролфосфатна човникова система

1 – цитоплазматична НАД-залежна гліцерол-3-фосфатдегідрогеназа;

2 – мітохондріальна ФАД-залежна гліцерол-3-фосфатдегідрогеназа.

 

Отже, сумарний вихід АТФ із молекули глюкози складає 36 молекул. При повному окисненні глюкози вивільняється 2880 кДж/моль енергії.

 

Роль циклу лимонної кислоти в анаболізмі

Як розглянуто вище, цикл лимонної кислоти служить для окиснення до СО₂ і Н₂О ацетил-КоА і, таким чином, є заключним етапом катаболізму вуглеводів, жирних кислот і амінокислот. Але, крім того, цикл відіграє значну роль і в біосинтезі основних класів біомолекул. Так, субстрат і проміжні продукти можуть виходити з циклу і використовуватись як попередники для біосинтезу різних сполук. Зокрема, альфа-кетоглутарат, оксалоацетат, а також тісно зв’язаний із циклом лимонної кислоти піруват використовуються для синтезу амінокислот. Оксалоацетат є проміжним продуктом глюконеогенезу – процесу синтезу глюкози з невуглеводних попередників (лактату і пірувату, амінокислот).

Таким чином, будь-який проміжний продукт циклу лимонної кислоти, переходячи в оксалоацетат, може застосовуватись для синтезу глюкози і глікогену. Ацетил-КоА є вихідною речовиною для синтезу жирних кислот, який здійснюється в цитоплазмі. І оскільки ацетил-КоА утворюється в мітохондріях, а через мітохондріальну мембрану прямо не переноситься, транспортною системою є сама лимонна кислота. Тобто в умовах, які сприяють використанню ацетил-КоА для синтезу жирних кислот, мітохондріальна цитрат-синтаза каталізує утворення лимонної кислоти, яка не починає цикл, а виходить у цитоплазму, де під дією ферменту цитратліази розпадається на ацетил-КоА й оксалоацетат. Ще один проміжний продукт циклу лимонної кислоти – сукциніл-КоА – використовується для синтезу гему.

При застосуванні проміжних продуктів циклу лимонної кислоти (від цитрату до оксалоацетату) для біосинтезу різних речовин у клітині знижується вміст оксалоацетату і в результаті активність циклу повинна би зменшуватись аж до зупинки його. Така вірогідність запобігається реак­ціями, які покривають втрати проміжних продуктів циклу. Основною з них є перетворення в мітохондріях пірувату в оксалоацетат під дією піруваткарбоксилази:

У піруваткарбоксилазі коферментом виступає вітамін Н (біотин). За рахунок розщеплення АТФ утворюється проміжний комплекс – фермент-біотин-СОО^-, з якого карбоксильна група переноситься на піруват. Активатором піруваткарбоксилази є ацетил-КоА. Таким чином, при на­явності ацетил-КоА і недостачі оксалоацетату стимулюється піруваткарбоксилазна реакція, в результаті утворюється більше оксалоацетату, що забезпечує синтез лимонної кислоти і функціонування циклу. Використання проміжних продуктів циклу лимонної кислоти з біосинтетичною метою повинно супроводжуватись катаболічною активністю циклу для утворення АТФ, який необхідний для здійснення реакцій анаболізму. Таким чином, цикл повинен одночасно виконувати обидві функції. Зазначимо, що окиснення ацетил-КоА в циклі, тобто катаболічна функція, не вимагає одночасного застосування проміжних продуктів для синтезу біомолекул.

Отже, цикл лимонної кислоти разом із тканинним диханням і окиснювальним фосфорилюванням забезпечує утворення основної кількості АТФ у клітині, об’єднує процеси метаболізму всіх основних класів біомолекул, зв’язує процеси катаболізму й анаболізму.

 

Регуляція циклу лимонної кислоти

Цикл лимонної кислоти регулюється рядом факторів. По-перше, концентрацією субстратів – ацетил-КоА і оксалоацетату. Ацетил-КоА утворюється при катаболізмі вуглеводів і жирних кислот, його рівень визначається активністю піруватдегідрогеназної реакції і ­окисненням жирних кислот. Концентрація в мітохондріях оксалоацетату, який утворюється в піруваткарбоксилазній реакції, а також з аспарагінової кислоти, досить низька і залежить від метаболічних умов. Використовується оксалоацетат у різних метаболічних шляхах:

1) у циклі лимонної кислоти;

2) для глюконеогенезу;

3) для утворення аспарагінової кислоти, яка застосовується для синтезу пуринів, піримідинів, аргініну і сечовини;

4) для компенсації втрат із циклу лимонної кислоти інших проміжних продуктів (цитрату, альфа-кетоглутарату, сукциніл-КоА).

У нормальних умовах баланс між кількістю ацетил-КоА й оксалоацетату досягається завдяки активації ацетил-коензимом А піруваткарбоксилазної реакції. Баланс порушується під час голодування, коли внаслідок окиснення тканинного жиру в печінці накопичується надлишок ацетил-КоА, і при цукровому діабеті, коли порушується катаболізм глюкози і внаслідок недостачі пірувату не утворюється достатня кількість оксалоацетату. У цих випадках відносна нестача оксалоацетату, порівняно з рівнем ацетил-КоА, гальмує цикл лимонної кислоти, зумовлює підвищений синтез з ацетил-КоА кетонових тіл і розвиток кетозу.

Крім цитратсинтази, регуляторними ферментами циклу лимонної кислоти є ізоцитратдегідрогеназа й альфа-кетоглутаратдегідрогеназа. Усі вони чутливі до співвідношення концентрацій у клітині АТФ/АДФ, НАДН/НАД⁺ (табл. 3).

Таблиця 3. Активатори й інгібітори регуляторних ферментів

циклу Кребса

 

При високих значеннях цих відношень активність регуляторних ферментів циклу пригнічується. Таким чином, коли в клітині є високий рівень АТФ, робота циклу припиняється, а при використанні АТФ і зростанні рівня АДФ – стимулюється. Інгібітором цитратсинтази й альфа-кето­глутаратдегідрогенази служить також сукциніл-КоА – проміжний продукт циклу.

 

МАКРОЕРГІЧНІ СПОЛУКИ

 

АТФ відноситься до сполук, що містять макроергічні зв’язки, тобто багаті енергією. Зазначимо відмінність поняття «багатий енергією зв’язок» у біохімії від поняття «енергія зв’язку» у хімії. Під останнім поняттям у хімії розуміють енергію, необхідну для розриву зв’язку між двома атомами в молекулі (для розриву макроергічних зв’язків також потрібно затратити енергію). Розглядаючи в біохімії високоенергетичні та низькоенергетичні зв’язки і сполуки, енергію зв’язку визначають як вільну енергію, що виділяється при гідролітичному розпаді даної сполуки.

У реакції АТФ + Н₂О ® АДФ + Ф_н зміна вільної енергії дорівнює 34,5 кДж/моль. Зміни для інших реакцій гідролізу АТФ, АДФ і АМФ складають:

Зв’язок вважається високоенергетичним, якщо при гідролізі його звільняється більше 21 кДж (за іншими джерелами – 30 кДж/моль). Таким чином, у молекулі АТФ є два макроергічних зв’язки, які характеризуються величиною вільної енергії 28-37 кДж/моль. Макроергічний зв’язок містить і АДФ, але при його гідролізі до АМФ і Ф_н енергія вилучається у вигляді тепла.

Зазначимо, що в різних джерелах наводяться різні значення ΔG гідролізу АТФ. Це пояснюється тим, що реальне значення вільної енергії гідролізу АТФ (та інших сполук) залежить від концентрації АТФ, АДФ, АМФ, Фн, іонів Мg²⁺, величин рН і температури. При стандартних умовах (рН 7,0; температура 25 °С; концентрація АТФ, АДФ і Ф_н рівні 1 М; надлишок іонів Мg²⁺) G дорівнює 34,5 кДж/моль. Але у клітинах концентрації АТФ, АДФ, Ф_н набагато менші 1М, не однакові між собою та різні для різних клітин. Крім того, рН також якоюсь мірою відрізняється від стандартного 7,0. Тому справжнє значення зміни вільної енергії при гідролізі АТФ у фізіологічних умовах перевищує зміну стандартної вільної енергії (34,5 кДж/моль) і коливається у межах 40-60 кДж/моль (у середньому 50 кДж/моль).

Величини ∆G для гідролізу ряду інших сполук, зокрема ангідридів фосфорної кислоти, наведені у табл. 4.

Таблиця 4. Стандартна вільна енергія гідролізу (AG) деяких високоенергетичних та низькоенергетичних сполук

 

Зазначимо, що ряд високоенергетичних сполук мають більшу вільну енергію гідролізу, ніж АТФ. Наприклад, фосфоенолпіруват або 1,3-дифосфогліцерат, що утворюються при розщепленні глюкози до лактату. Але ці сполуки (надвисокоенергетичні) під дією специфічних кіназ можуть передавати свої фосфатні групи тільки на АДФ, що призводить до утворення АТФ, і не можуть служити джерелом енергії для інших сполук. Проміжне значення ∆G для АТФ дуже важливе для забезпечення функції її як посередника «біохімічної енергетичної валюти». Рівноцінні з АТФ інші нуклеозидтрифосфати (ГТФ, УТФ, ЦТФ, ТТФ).

Чому при гідролізі АТФ та інших макроергічних сполук виділяється значно більше енергії, ніж, наприклад, при гідролізі глюкозофосфатів? Це зумовлено властивостями всієї структури макроергічної сполуки, а не тільки зв’язком, при гідролітичному розриві якого виділяється вільна енергія. Існує ряд факторів, які вносять свій вклад у процес звільнення великої кількості вільної енергії при гідролізі макроергічних зв’язків:

1) електростатичне відштовхування. При рН 7,0 у молекулі АТФ всі чотири групи ОН зв’язані з фосфором і несуть негативні заряди (АТФ^4‑). Відштовхування однойменних зарядів призводить до електростатичної напруги у всій молекулі, особливо зв’язку Р-О-Р. Коли зв’язок розривається, електростатична напруга знімається за рахунок просторового роз’єднання негативно заряджених продуктів гідролізу АДФ^3- і НРО₄^2-;

2) фактор конкурентного резонансу. Два продукти гідролізу, АДФ^3- і НРО₄^2-, є резонансними гібридами, тобто такими структурними формами, що мають підвищену стійкість, бо частина їх електронів перебуває в конфігураціях з нижчими енергетичними рівнями, порівняно з АТФ;

3) виділення протонів. Сумарне рівняння гідролізу АТФ має такий вигляд:

АТФ ^4- + Н₂О ® АДФ^3- + НРО₄^2- + Н⁺

Зв’язування цього протона з буферним середовищем (рН 7,0) ­зсуває реакцію вправо, що вносить вклад у зміну вільної енергії.

 

Інтенсивність оновлення АТФ в організмі

Яка кількість АТФ синтезується і розпадається за добу? Доросла здорова людина масою 70 кг при сидячій роботі повинна споживати за день їжі калорійністю близько 12 000 кДж. Харчові продукти роз­щеплю­ються у процесі метаболізму, а вільна енергія, що звільняється при цьому, використовується для синтезу АТФ, який далі витрачається на виконання хімічної, механічної, осмотичної й електричної робіт. Ефективність перетворення енергії харчових продуктів у енергію АТФ дорівнює приблизно 50 %. Враховуючи, що при гідролізі АТФ у фізіологічних умовах звільняється 50 кДж/моль вільної енергії, можна визна­чити кількість АТФ, яка утилізується за добу. Але в організмі людини міститься всього близько 50 г АТФ, тому ця кількість АТФ характеризує не загальну масу АТФ, а швидкість обороту АТФ-АДФ. Розраховано, що кожна молекула АТФ розпадається і знову регенерується 2,5 тисячі разів за добу, так що середня трива­лість її життя менша 1 хв. Синтез АТФ із АДФ і Ф_н здійснюється двома шляхами – окиснювальним фосфорилюванням і субстратним фосфорилюванням. У більшості клітин головним процесом є окиснювальне фосфорилювання.

 

Кількісне визначення  піровиноградної  кислоти в сечі за допомогою  колориметричного  методу.

Піровиноградна кислота (ПВК) – один із центральних метаболітів вуглеводного обміну. Вона утворюється внаслідок аеробного окиснення глюкози, перетворення деяких амінокислот, декарбоксилюванні щавлевооцтової кислоти. Значна кількість ПВК використовується в процесі глюконеогенезу, синтезу кето- та амінокислот. У разі анаеробного та аеробного розщеплення вуглеводів ПВК може перетворюватися трьома шляхами:

-     відновлення з утворенням молочної кислоти (анаеробне перетворення вуглеводів);

-     окиснювальне декарбоксилювання з утворенням ацетил-КоА, який вступає в цикл Кребса. Реакцію каталізує піруватдегідрогеназний комплекс, коферментами якого є: тіамінпірофосфат, ліпоєва кислота, коензим А-SН, НАД, ФАД (аеробне перетворення вуглеводів);

-     декарбоксилювання з утворенням оцтового альдегіду, який потім відновлюється з утворенням етилового спирту (спиртове бродіння).

Норма ПВК (за динітрофенілгідразиновим методом) у дорослих становить: у крові – 34,1-102,2 мкмоль/л; у сечі – 45-111 мкмоль/л, 113,7-283,9 мкмоль/добу (10-25 мг/добу). 

Принцип  методу. Піровиноградна кислота, взаємодіючи з 2,4‑динітрофенілгідразином у лужному середовищі, утворює 2,4‑динітрофенілгідразон піровиноградної кислоти коричнево- червоного забарвлення, інтенсивність якого пропорційна концентрації ПВК і визначається фотометрично.

Клініко-діагностичне значення. Підвищена концентрація ПВК у крові і сечі спостерігається під час інтенсивної фізичної праці, при тетанії, епілепсії, В₁-вітамінній недостатності, цукровому діабеті, серцевій декомпенсації, гестозі, тяжких захворюваннях печінки, уремії, отруєннях, гіпоксіях різного походження. У спинномозковій рідині рівень ПВК підвищується при травмах черепа, запальних процесах (менінгіт, абсцес мозку).

 

Дослідження сукцинатдегідрогенази  м’язів.

Сукцинатдегідрогеназа  (СДГ) м’язів  – це залізофлавопротеїн, що каталізує окиснення (дегідрування) бурштинової кислоти у фумарову. Коферментом сукцинатдегідрогенази служить флавінаденіндинуклеотид (ФАД). Активність ферменту залежить від наявності в ньому вільних сульфгідрильних груп та атомів заліза.

Як джерело ферменту використовується відмита м’язова тканина. Дію цього ферменту можна виявити при додаванні до бурштинової кислоти метиленової синьки або 2,6-дихлорфеноліндофенолу (синього кольору), які виступають в якості акцептора водню і, відновлюючись, перетворюються у безбарвну форму:

Принцип методу. Метод ґрунтується на виявленні знебарвлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу в реакції з бурштиновою кислотою при наявності м’язів як джерела ферменту сукцинатдегідрогенази. Конкурентне гальмування активності цього ферменту викликає малонова кислота НООС-СН₂-СООН, яка є структурним аналогом бурштинової кислоти. Час знебарвлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу при наявності бурштинової  кислоти характеризує активність сукцинатдегідрогенази.