Медицина

Біохімія як наука

ПРЕДМЕТ, ЗАДАЧІ, ОСНОВНІ ЕТАПИ ТА СУЧАСНІ НАПРЯМИ РОЗВИТКУ БІОХІМІЇ. БУДОВА, ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ БІЛКІВ ТА ФЕРМЕНТІВ. МЕХАНІЗМ ДІЇ ФЕРМЕНТІВ ТА РЕГУЛЯЦІЯ ЇХ АКТИВНОСТІ. ФУНДАМЕНТАЛЬНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ ОБМІНУ РЕЧОВИН. БІОЕНЕРГЕТИЧНІ ПРОЦЕСИ

 

 

Біологічна хімія – це наука про хімію життя. Суть життя не піддається простому визначенню. Протягом багатьох століть учені вкладали в це слово різний зміст. Відомі достовірно тільки характерні риси життя: ріст, рух, обмін речовин, розмноження та пристосування. Але кожну з цих рис, окремо взяту, можна спостерігати і в неживій природі. Наприклад, кристалики солей ростуть, розмножуються, але вони не належать до живих. Біохімія вивчає хімічні та фізико-хімічні прояви життя. А що таке наука? Під цим терміном розуміють діяльність людини, спрямовану на одержанння достовірних знань про зовнішній світ. Першоджерелами будь-яких наукових відомостей є окремо проведені спостереження або експериментальні дослідження.

Найважливішими біомолекулами є білки. Білки виконують важливі біологічні функції: а) каталітичну - найсуттєвішу, так як переважна більшість перетворень в організмі здійснюється тільки під впливом каталізаторів – ферментів, які є білками; б) структурну - білки у тварин утворюють рогові покриви, є основою сполучення між клітинами (на структурний білок сполучної тканини колаген припадає третина всіх білків організму за масою); в) рухову (скорочувальні білки у всіх живих організмів побудовані і функціонують за спільним принципом, наприклад, актин і міозин у м’язовому волокні); г) транспортну - переносять гази (гемоглобін, міоглобін), залишки жирних кислот (альбумін крові), здійснюють активний транспорт багатьох речовин через мембрану; д) регуляторну - швидкість біохімічних перетворень регулюють зокрема гормони гіпофізу, підшлункової залози, які є білками або похідними амінокислот, нейроолігопептиди забезпечують в головному мозку складні психічні і фізіологічні явища (пептид страху, пам’яті тощо), білки є регуляторами зчитування спадкової інформації з ДНК, рецепторами мембран, які забезпечують трансформацію і передачу в клітину інформації (гормонального сигналу); е) захисну - антитіла, які виробляються у відповідь на появу чужорідних молекул, зв’язують і знешкоджують їх - білки, серед них - інтерферон – єдиний відомий білок, який знешкоджує чужорідну нуклеїнову кислоту; токсини, наприклад бутулізму є захисними молекулами для організму, який їх виділяє; є) енергетичну - при повному окисненні 1 г білка виділяється біля 17 кДж енергії, проте білки не відкладаються про запас, а при їх розщепленні вивільняється токсичний продукт – аміак, на детоксикацію якого витрачається енергія. Половина з амінокислот, які утворюють білки, в організмі людини не синтезується і повинна поступати з їжею, тому використання білків в енергетиці є для організму вимушеним, пов’язаним із незбалансованим вмістом в їжі амінокислот, необхідних для побудови білків.

Відомо 20 a-амінокислот, які генетично кодуються, і декілька їх похідних, що утворюються шляхом ферментативної модифікації. Загальну формулу a-амінокислоти можна зобразити так:

де R- вуглеводневий радикал. Радикал може бути аліфатичний або циклічний, містити різні функціональні групи. Одна із двадцяти a-амінокислот (пролін) є не аміно-, а імінокислотою, тому що її атом азоту входить до складу циклу. Амінокислоти можна класифікувати за різними ознаками. Для вивчення білків зручний поділ за полярністю радикалів на неполярні, полярні незаряджені та полярні заряджені (позитивно або негативно)

Класифікація амінокислот за полярністю радикалу*

Неполярний радикал

Аланін (Aла, Ala, A)    Валін (Вал, Val, V)   Ізолейцин (Ілей, Ile, I)

Лейцин (Лей, Leu, L)   Метіонін (Мет, Met, M)  Пролін (Про, Pro, P)

Фенілаланін (Фен, Phe, P)     Триптофан (Три, Trp, W)

Полярний незаряджений радикал

Гліцин (Глі, Gly, G)  Серин (Сер, Ser, S)     Цистеїн (Цис, Cys, C)

Треонін                      Аспарагін              Глутамін                Тирозин

(Тре, Thr, T)                 (Асн, Asn, N)         (Глн, Gln, Q)        (Тир, Tyr, Y)

Полярний заряджений радикал

Аспарагінова кислота (Aсп, Asp, D) Глутамінова кислота (Глу, Glu, E)

Лізин (Ліз, Lys, K)    Аргінін (Арг, Arg, R)   Гістидин (Гіс, His, H)

* - в дужках подаються скорочені українська і англійська назви і міжнародний символ

Кожна амінокислота, крім гліцину, містить один чи більше асиметричних атомів карбону, тобто проявляє оптичну активність. За абсолютною конфігурацією амінокислоти в організмах належать до L-ряду. Лише у складі пептидів деяких мікроорганізмів зустрічаються D-амінокислоти, наприклад в токсині бутулізму.

Амінокислоти здатні до конденсації при взаємодії карбоксильної групи однієї амінокислоти та аміногрупи - іншої:

Утворена сполука називається пептидом, а зв'язок - пептидним. При сполученні двох амінокислот утворюється дипептид, трьох - трипептид, а багатьох - поліпептид. Пептидний зв'язок міцний, він піддається гідролізу тільки при тривалому кип'ятінні в кислому або лужному середовищі. В пептиді виділяють N-кінець, на якому знаходиться вільна аміногрупа, та С-кінець, на якому міститься незаміщена карбоксильна група. Пептидний зв'язок має специфічну просторову форму. Неподілена пара електронів азоту взаємодіє з p-електронами карбонільної групи, утворюючи делокалізовану систему електронів, розподілену між атомами О, С і N. Тому зв'язок С-О слабший, ніж подвійний, а зв'язок С-N міцніший, ніж одинарний. Навколо зв'язку С-N неможливе вільне обертання груп, оскільки він не одинарний. В одній площині знаходяться атоми С, N, О, Н і a-вуглецеві атоми. Причому атоми О і N знаходяться в транс-положенні. Вільно обертатися можуть лише радикали навколо a-вуглецевих атомів. Така будова пептидного зв’язку обмежує можливості просторових конформацій пептидів.

Наявність пептидного зв'язку визначають біуретовою реакцією.

За хімічною будовою білки є поліпептидами. Внаслідок взаємодії функціональних груп поліпептиду між собою і з оточуючим середовищем він набуває специфічної просторової форми.

Первинна структура

b-13

Первинна структура білків - це порядок розташування амінокислотних залишків в нерозгалуженому поліпептидному ланцюгу:

Вторинна структура

 

b-14

 

b-15

 

 

Вивчення просторової структури білків стало можливим завдяки рентгеноструктурному аналізу. На рентгенограмах кристалів білків спостерігаються спіралізовані ділянки. Утворення їх можливе завдяки водневим зв'язкам, які виникають між пептидними групами: При транс-розташуванні атомів гідрогену і оксигену в пептидній групі кожна така група може утворювати по два водневих зв’язки:

Вторинна структура білка - це регулярна укладка поліпептидного ланцюга, стабілізована водневими зв'язками між пептидними групами. Щільність упаковки цієї структури така ж, як і у кристалів. Тому білки називають аперіодичними кристалами. Для різних білків ступінь і характер спіралізації відрізняються. Л.Поллінг і Р.Корі. на підставі власних даних про будову пептидного зв’язку запропонували у 1951 році дві структурні моделі, які одержали підтвердження в просторово-структурних дослідженнях: модель a-спіралі і b-структури (паралельних і антипаралельних складчастих шарів). В різних білках було показано існування одного з цих типів вторинної структури, або їх поєднання.

a-спіраль можна уявити як ланцюг, закручений навколо уявного циліндра. В білках виявлено правозакручену спіраль. Водневі з’язки утворюються між пептидними групами через три залишки, причому кожна пептидна група утворює по два водневих зв’язки (за рахунок і оксигену, і гідрогену). Таким чином a-спіраль вся пронизана водневими зв’язками. Висота одного витка спіралі - 0,54 нм і на нього припадає З,б амінокислотних залишки. В b-структурі водневі зв’язки утворюються між різними ланцюгами (паралельний складчастий шар), або різними ділянками одного ланцюга (антипаралельний складчастий шар)

Величина радикалів, їх полярність і порядок розташування визначають особливості спіралізації. Спіралізація порушується в місцях поєднання однойменно заряджених або просторово громіздких радикалів. Так, a-спіраль стабілізують ала, вал, лей, фен, три, мет, гіс, глн і дестабілізують глі, глу, асп, іле, тир, ліз, арг, тре, асн, сер.

b-структуру утворюють поліпептиди, до складу яких входять, як правило, неполярні амінокислоти з невеликими радикалами. Вони не заважають утворенню шарової структури. В місцях розташування залишку гліцину, який не має радикалу, ланцюг може змінювати напрямок на 180°, що веде до утворення антипаралельних фрагментів. Спіралізуватись може до 75% всього поліпептидного ланцюга.

 

Третинна структура

 

b-16

Третинна структура – це трьохмірна укладка поліпептидного ланцюга, яка стабілізується внутрішньомолекулярними взаємодіями радикалів амінокислотних залишків. Внаслідок вільного обертання навколо a-вуглецевих атомів радикали можуть по-різному орієнтуватись в просторі, утворюючі зв’язки із спорідненими групами і забезпечуючи термодинамічно вигідну укладку молекули.

В глобулярних білках поліпептидний ланцюг містить багато гідрофільних полярних радикалів, які орієнтуються назовні глобули, до оточуючого водного середовища, утворюючі водневі зв’язки з молекулами води. Утворена компактна кулеподібна структура стабілізується більш міцними йонними та дисульфідними зв’язками:

 

Зв’язки у третинній структурі білка: 1 – водневі, 2 – йонні, 3 – дисульфідні, 4 – гідрофобні.

В компактній глобулі поруч опиняються групи, які в поліпептидному ланцюгу розташовані на значній відстані. Вони утворюють області з просторовою і хімічною специфічністю і забезпечують виконання певних функцій молекули. Такі відносно структурно і функціонально автономні фрагменти третинної структури називаються доменами. Домени виділяються при обережному розщепленні білків і зберігають характерні властивості цілого білку.

Четвертинна структура

b-21

 

Велика кількість білків складається більше, як з одного поліпептидного ланцюга. Четвертинна структура характеризує спосіб об’єднання поліпептидних ланцюгів в молекулі такого білку. Наявність четвертинної структури у того чи іншого білка можна прогнозувати за його кількісним складом. Як правило, окремі поліпептидні ланцюги містять від 100 до 300 залишків амінокислот і мають молекулярну масу 12000 - 36000. Якщо молекулярна маса більша 50000, то можна вважати, що білок складається з декількох поліпептидів.

Білки, які мають четвертинну структуру, називаються олігомерами або мультимерами, а ланцюги, з яких вони утворені, - протомерами або субодиницями.

Вперше четвертинна структура була встановлена для білка гемоглобіну на основі рентгеноструктурного аналізу М. Перутцем та співробітниками (Англія). Робота тривала біля 25 років і була удостоєна Нобелівської премії у 1962 p.

Гемоглобін складається з чотирьох субодиниць. Кожна субодиниця утворена поліпептидним ланцюгом і залізопорфіриновим комплексом. Ланцюги попарно однакові: два a- , які складаються з 141 амінокислотного залишка і два b-ланцюги – з 146 залишків. Кожний ланцюг має третинну структуру, подібну до міоглобіну. Ланцюги об’єднуються попарно, утворюючи контакти за рахунок переважно гідрофобних радикалів.

Багато олігомерів складається з двох - дванадцяти ланцюгів. Однак відомі і значно більші молекули - білок вірусу тютюнової мозаїки містить біля 2200 поліпептидних ланцюгів.

Четвертинну структуру мають білки, які виконують складні біологічні функції і активність яких залежить від дії регулюючих факторів. Відокремлені ланцюги таких білків втрачають свою функцію, або систему її регуляції. Отже, олігомерні білки мають кооперативну узгодженість дії окремих протомерів.

Таким чином, порядок утворення білкової глобули можна уявити схематично так: первинна структура ® вторинна структура (a-спіралі і b-складчасті шари) ® зверхвторинна структура (суперспіраль, система регулярно розташованих шарів) ® домен (автономна компактна система, яка об’єднує декілька сусідніх структурних сегментів) ® третинна структура ® четвертинна структура. Багато білків функціонують лише в складі надмолекулярних комплексів з іншими білками, ліпідами, мембранами. Тому деякі автори виділяють п"ятеринну структуру білка як спосіб його включення в надмолекулярні структури.

 

ФЕРМЕНТИ – БІОЛОГІЧНІ КАТАЛІЗАТОРИ

 

Хімічні процеси в організмі каталізуються особливими речовинами (біокаталізаторами), що називаються ферментами, або ензимами.

Будова  ферментів

За хімічною природою ферменти – це білки, що проявляють каталітичні властивості, тобто вони прискорюють перебіг різних хімічних процесів, які відбуваються в живому організмі. Ферментам притаманні всі фізико-хімічні властивості білків: висока молекулярна маса, розщеплення до амінокислот під час гідролізу, утворення колоїдоподібних розчинів; вони не стійкі до впливу високих температур та солей важких металів, проявляють антигенні властивості, піддаються фракціонуванню. Як і білки, ферменти поділяються на прості й складні. Прості, або однокомпонентні, ферменти містять у своєму складі тільки амінокислоти. Наприклад, пепсин, уреаза, РНКаза та інші. Більшість ферментів є двокомпонентними, тобто складаються з білкової і небілкової (простетичної) частин. Їх називають ще голоферментами, а їх складові, відповідно, апоферментами (білкова частина) і простетичною групою, або коферментом (небілкова частина ферменту) (рис. 1):

 

Рис. 1. Схема будови складного (двокомпонентного ферменту)

 

Простетична група міцно і постійно зв’язана з апоферментом. Якщо небілкова частина ферменту зв’язана з апоферментом непостійно, тобто знаходиться в дисоційованому стані й приєднується до апоферменту тільки під час каталітичного процесу, то її називають коферментом, іноді – кофактором.

Кофермент, або коензим, бере участь у перетворенні субстрату, тоді як апофермент вказує на тип реакції. Коферментом можуть виступати різні за природою низькомолекулярні органічні, а також неорганічні речовини (метали), що здатні зв’язуватись із субстратом і видозмінювати його.

Вітаміни як коферменти

Найчастіше коферментами виступають вітаміни та їх похідні. Наприклад, пірофосфорний ефір вітаміну В1 – ТПФ – є коферментом піруватдегідрогенази, альфа-кетоглутаратдегідрогенази та транскетолази; похідні вітаміну В2 – ФМН, ФАД входять до складу оксидно-відновних ферментів. Сюди ж належать і похідні вітаміну В5 – НАД і НАДФ (рис. 2).

Коферментом переамінування та декарбоксилювання амінокислот є похідні вітаміну В6 – піридоксальфосфат. Вітамін В3 є основою для утворення коферменту А (кофермент ацилювання) та пантотеїнфосфату – коферменту ацилпереносного білка синтезу жирних кислот. 

Вітамін В10 в організмі перетворюється на кофермент ТГФК, що бере участь у перенесенні одновуглецевих фрагментів. Із вітаміну В12 утворюється два коферменти – метилкобаламін та дезоксиаденозил-кобаламін, які разом із ТГФК переносять і видозмінюють одновуглецеві фрагменти під час синтезу нуклеїнових кислот у кровотворних органах.

Порфіринові коферменти

Ці коферменти за своєю структурою подібні або навіть тотожні гему в гемоглобіні. Вони містять іони металів, зокрема заліза, які можуть змінювати свою валентність (Fe+2  → Fe+3) і за рахунок цього брати участь у перенесенні електронів під час окисно-відновних процесів. Порфіринові коферменти входять до складу таких ферментів, як цитохроми (b, с, а1, а3), каталаза, пероксидаза та ін.

 

Більшість ферментів має чотири рівні структурної організації (первинну, вторинну, третинну і четвертинну), тобто є олігомерними білками, що складаються із протомерів. Кожна із субодиниць або окремі їх частини відіграють певну роль у процесі функціонування ферменту. Прості (однокомпонентні) ферменти здійснюють ферментативне перетворення субстрату з участю власне білкової молекули. Безпосередню участь у реакції бере не весь поліпептидний ланцюг ферменту, а тільки незначна його частина, що близько прилягає до субстрату. У ферментативну реакцію включається тільки декілька залишків амінокислот. Ці залишки можуть розташовуватися в поліпептидному ланцюзі як поруч, так і далеко один від одного, але просторово вони повинні бути досить зближені.

Та частина молекули ферменту, яка з’єднується із субстратом, називається активним центром ферменту. Активний центр відповідає за специфічну спорідненість ферменту із субстратом, утворення ферментосубстратного комплексу і каталітичне перетворення субстрату. В активному центрі ферменту умовно розрізняють так звану каталітичну ділянку, де відбувається каталітичне перетворення субстрату, і контактну, або якірну ділянку, що зв’язує фермент із субстратом. Схема розташування складових компонентів активного центру показана на рис. 5.

За утворення активного центру ферменту, як і за його каталітичну дію, відповідає третинна структура білко­вої молекули. Отже, при порушенні третинної структури (денатурація) роз’єднуються просторово поєднані амінокислотні залишки і, як наслідок, фермент втрачає активність. У складі активного центру простого ферменту знаходиться приблизно 15 залишків амінокислот. Активний центр утво­рюють залишки таких амінокислот, як серин, цистеїн, гістидин, тирозин, лізин та деякі інші, що надають ферменту як просторової, так і електричної спорідненості із субстратом. В утворенні тимчасового комплексу між ферментом і субстратом важлива роль належить дисульфідним, іонним, а також слабким зв’язкам (водневі зв’язки, гідрофобна взаємодія).

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: http://studentus.net/pictures/books/11901.files/image076.jpg

Рис. 5. Схема функціональної організації молекули ферменту:

а простий фермент; б двокомпонентний фермент; в алостеричний фермент; А активний центр; S субстрат; R регуляторний, або алостеричний, центр; 1 каталітична ділянка; 2 контактна ділянка; 3 кофактор.

 

Активний центр складних (двокомпонентних) ферментів містить у своєму складі як кофермент, так і ту частину апоферменту, що просторово прилягає до нього. Крім активних центрів, у ферментах можуть бути ще так звані алостеричні центри (від грец. алос – інший, другий; стереос – просторовий, структурний). Алостеричні центри служать місцем впливу на фермент різних регуляторних чинників, тому їх ще називають регуляторними центрами, а речовини, що взаємодіють з алостеричним центром, отримали назву ефекторів.

Ізоферменти (ізоензими)

Ферменти, як і всі інші білки, характеризуються молекулярною гетерогенністю. Зокрема, ті з них, що побудовані з декількох субодиниць, можуть існувати в різних молекулярних формах, утворюючи цілі сімейства ферментів. Такі форми зустрічаються в різних тканинах організму і навіть усередині однієї клітини

Розглянемо множинні ізоформи лактатдегідрогенази (ЛДГ), яка каталізує зворотну реакцію перетворення піровиноградної кислоти в молочну з участю коферменту НАД. На електрофореграмі ЛДГ виявляється 5 ізоформ, кожна з яких містить по 4 субодиниці, але двох різних типів, які умовно позначають «Н»-тип (від heart – серце) і «М»-тип (від muscle – м’яз).

Властивості ферментів як каталізаторів

Ферменти мають ряд властивостей, подібних до небіологічних каталізаторів, але одночасно і відрізняються від них. Спільними для всіх видів каталізаторів є:

1. Вони пришвидшують тільки ті реакції, які можливі з точки зору термодинаміки, тобто ті процеси, що йдуть у напрямку термодинамічної рівноваги, але з малою швидкістю.

2. Вони не змінюють напрямку реакції.

3. Каталізатори збільшують швидкість наближення системи до термодинамічної рівноваги, не змінюючи при цьому точки рівноваги.

4. Відносно не змінюються після реакції, тобто вивільняються і знову можуть реагувати з наступними молекулами субстрату.

5. Усі каталізатори діють у відносно малих концентраціях.

Разом із тим, ферменти як білкові структури мають властивості, від­мінні від властивостей каталізаторів неорганічних. Що це за властивості? Для ферментів характерні: специфічність, чутливість до дії сторонніх чин­ників, залежність дії від рН і t°, ферментам, на противагу іншим каталі­заторам, притаманна значно вища каталітична активність.

Ферменти можуть проявляти відносну (групову), абсолютну та просторову, або стереоспецифічність.

Ферментами з відносною специфічністю можуть служити фосфатази, ліпази, протеази та ін. Спільним для розглянутих вище ферментів є їх дія на однакові зв’язки певної групи субстратів. Велика кількість ферментів характеризується абсолютною специфічністю, тобто здатністю перетворювати тільки якийсь один субстрат. Усій групі ферментів притаманна стереоспецифічність, тобто здатність впливати на один якийсь із стереоізомерів, наприклад на D- або L-ізомер.

Підвищення температури завжди збільшує швидкість хімічних реакцій, зокрема ферментативних.

Оптимальні значення температури для більшості ферментів знаходяться в межах 20-40 °С.

Температура, при якій швидкість ферментативної реак­ції максимальна, називається тем­пературним оптимумом. Низькі температури також впливають на активність ферментів, але на противагу високим температурам, вони інгібують їх дію, не руйнуючи структури.

 

Рис. 8. Вплив рН на швидкість реакції, яка каталізується ферментом (стрілка вказує оптимум рН)

Значення рН, при якому активність ферменту найвища, називається рН-оптимумом ферменту. Звичайно ферменти найактивніші в межах вузької зони рН, яка для більшості з них знаходиться в межах рН 6‑8.

Ферменти, як і інші каталізатори, прискорюють тільки ті реакції, які термодинамічно можливі, тобто ті, що відбуваються самовільно, але з малою швидкістю..

Для пояснення специфічності дії ферментів у 1894 р. Е. Фішер запропонував гіпотезу, яку ще й досі називають гіпотезою «ключа і замка» або гіпотезою «шаблону».

В основі специфічності, за цією гіпотезою, лежить жорстка просторова відповідність субстрату і активного центру ферменту. За Е. Фішером, реакція можлива тільки в тому випадку, якщо просторово субстрат підходить до ферменту, як ключ до замка. Якщо субстрат (ключ) просторово відрізняється від структури активного центру ферменту (замок), то реакція не відбувається.

 

 

Але і ця гіпотеза (її ще називають гіпотезою відповідності) не може пояснити різні види специфічності, бо важко уявити собі ситуацію, коли декілька ключів (субстратів) підходить до одного замка (ферменту). Тому ця гіпотеза була замінена і доповнена гіпотезою вимушеної співвідповідності (гіпотеза індукованої адаптації ферменту до субстрату). Згідно з цією гіпотезою, конфігурація ферменту і його активного центру є гнучкою й еластичною, що змінюється під впливом субстрату, тобто субстрат індукує у ферменті зміни конфігурації молекул відповідно до власної структури. Іншими словами, «замкова щілина», за Кошландом, виготовлена з еластичного матеріалу і тому набуває форми «ключа» при контакті з ними. Але приєднання субстрату до ферменту може викликати зміни активного центру, при яких він утворює із субстратом неактивний комплекс, і тоді реакція не відбувається. На рис. представлені зміни структури активного центру ферменту, що можуть викликатись субстратом (за Кошландом):

 

Гіпотеза Кошланда про індуковану відповідність

 

Значну роль у вивченні механізму взаємодії ферменту і субстрату відіграли класичні праці Міхаеліса і Ментен, опубліковані в 1913 р., про так звані ферментосубстратні комплекси. Згідно з гіпотезою Міхаеліса-Ментен, ферментативна реакція завжди супроводжується утворенням проміжної короткоіснуючої сполуки – ферментосубстратного комплексу. Процес утворення комплексу описується рівнянням і перебігає у декілька стадій, кожна з яких має свої особливості:

1 стадія – зв’язування субстрату з активним центром ферменту, тобто утворення ферментосубстратного комплексу (ES);

2 стадія – перетворення первинного ферментосубстратного комплексу в один або декілька активних ферментосубстратних комплексів (ЕSx i ESxx);

3 стадія – відокремлення продуктів реакції від активного центру ферменту і вивільнення ферменту та продукту (Е і Р).

1-а стадія за тривалістю найкоротша: вона проходить майже миттєво. За цей час субстрат орієнтується навколо активного центру й утворює з ним короткоіснуючу, неміцну проміжну сполуку. На 2-й стадії, яка перебігає найповільніше, відбуваються розхитування зв’язків у молекулі субстрату, розрив їх та утворення нових із каталітичним центром ферменту. Зни­жується енергія активації субстрату, що зумовлює зростання швидкості його перетворення. 3-я стадія за тривалістю наближається до 1‑ї, і швидкість її перебігу залежить від дифузії продукту в середовище.

Інгібітори (від лат. інгібіціо – затримка, гальмування) – речовини, що, на відміну від активаторів, послаблюють або цілком призупиняють дію ферментів. Деякі інгібітори ферментів є отрутами для живих організмів (наприклад, ціаніди, сірководень, монооксид вуглецю). Ряд лікарських засобів також має виражені інгібуючі властивості щодо певних ферментних систем. Тому інгібітори широко застосовують в експериментальній медицині для з’ясування механізму дії лікарських середників.

 

 

За механізмом дії інгібітори поділяються на дві групи:

1. Інгібітори, що вступають із ферментами у зворотну реакцію.

2. Інгібітори, що реагують із ферментами незворотно.

Незворотний інгібітор утворює з ферментом міцну сполуку за рахунок ковалентних зв’язків. Ці зв’язки виникають між різними функціональними групами, що поєднуються з активним центром ферменту. Такий комплекс не розпадається і не дисоціює на вихідні речовини, наприклад, ціанідна кислота і її похідні, фосфороорганічні, тіолові отрути та ін.

Деякі незворотні інгібітори руйнують структуру молекули ферменту, тому їх ще називають денатурантами. Вони є неспецифічними інгібіторами для всіх ферментів. Сюди відносяться солі важких металів (свинець, ртуть, срібло). Зворотні інгібітори пригнічують реакцію, але не викликають значних змін у структурі молекули ферменту. Розрізняють три типи зворотного інгібування ферментів: конкурентне, неконкурентне і безконкурентне.

Конкурентне інгібування

Конкурентні інгібітори здатні зворотно зв’язуватись з активним центром ферменту і конкурувати із субстратом за активний центр. Такі інгібітори часто є структурними аналогами субстрату і тому комплементарні активному центрові ферменту.

Якщо активний центр ферменту зв’язується з інгібітором, то він не зможе вступати в реакцію із субстратом. При наявності субстрату (S) й інгібітора (І) одночасно відбуваються дві реакції:

                            Е + S Þ ЕS Þ Е + Р

                            Е + І Þ ЕІ

 

Конкурентними інгібіторами (ізостеричними) можуть виступати про­міжні продукти обміну – метаболіти, накопичення яких регулює активність ферментів. Дія багатьох лікарських середників відбувається за принципом конкурентного інгібування. Наприклад, сульфаніламіди, що широко застосовуються для лікування інфекційних захворювань, структурно подібні до параамінобензойної кислоти (ПАБК), яку бактерії використовують для синтезу фолієвої кислоти. Остання входить до складу ферментів, необхідних для їх росту. Сульфаніламіди витісняють ПАБК із комплексу з ферментом, що призводить до гальмування росту бактерій.

 

 

Конкурентну дію проявляють також деякі аналоги вітамінів. На­приклад, дезоксипіридоксин – аналог вітаміну В5 або аміноптерин – аналог фолієвої кислоти. Ці аналоги вітамінів називаються ще антивітамінами.

 

Неконкурентне інгібування

Неконкурентне інгібування викликається речовинами, які не мають структурної спорідненості (подібності) із субстратом і зв’язуються з каталітичними групами активного центру та ділянками, що розташовані поза активним центром. Таке приєднання інгібітора до ферменту змінює конфігурацію активного центру, що пригнічує його взаємодію із субстратом. У цьому випадку утворюється потрійний комплекс: фермент-субстрат-інгібітор:

                                      Е+S+І Þ ESІ.

Цей комплекс не здатний перетворюватися в продукт, тому реакція зупиняється.

 

ФУНДАМЕНТАЛЬНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ ОБМІНУ РЕЧОВИН

 

Обмін речовин включає процеси споживання, нагромадження, перетворення, використання і видалення речовин і енергії, завдяки чому живі організми ростуть, розвиваються, розмножуються в умовах навколишнього середовища, а також пристосовуються до його постійних змін.

Використання терміну «метаболізм» може бути в більш розширеному контексті й означати сукупність усіх реакцій від моменту надходження поживних речовин до утворення та виведення кінцевих продуктів обміну. В цьому випадку метаболізм передбачає такі послідовні стадії (рис. 1):

1)       надходження білків, ліпідів, вуглеводів, неорганічних речовин з продуктами харчування;

2)       перетравлювання органічних речовин до більш простих та їх усмоктування в ШКТ;

3)       транспорт сполук кров’ю від ШКТ до клітин організму;

 

Рис. 1. Стадії обміну речовин. Взаємозвязок обміну речовин і енергії:

1 - травлення; 2, 4 - катаболізм; 3 - анаболізм; 5 - екзергонічні реакції;

6, 7 - ендергонічні реакції; 8 - виділення кінцевих продуктів

 

4)       біохімічні перетворення в клітинах різних органів та систем, у тому числі з утворенням кінцевих продуктів;

5)       екскреція кінцевих продуктів обміну (СО2, NH3, сечовини, сечової кислоти, кон’югатів тощо).

Проте найчастіше під цим поняттям розуміють проміжний обмін (внутрішньоклітинний), що відбувається безпосередньо в клітинах, тобто сукупність усіх хімічних перетворень клітин організму. Так, наприклад, виділяють метаболізм білків, метаболізм вуглеводів, метаболізм нуклеотидів тощо.

Зазначене трактування терміна «обмін речовин» досить умовне. В біохімії людини розглядають як хімічні перетворення, пов’язані з перетравлюванням та всмоктуванням окремих нутрієнтів, так і специфічні реакції, що відбуваються безпосередньо в клітинах.

Для розуміння обміну речовин повинні бути відомими структура речовин, реакції, в які вони вступають, ферменти, які каталізують ці реакції, і регуляторні механізми, що забезпечують нормальний обмін речовин, швидкість послідовних реакцій, при яких відбувається перетворення початкового субстрату в кінцевий продукт. Сукупність таких послідовних реакцій перетворення біомолекули до певного продукту складає метаболічний шлях.

Метаболічний шлях – послідовність біохімічних перетворень, пов’язаних зі специфічним перетворенням сполук у не обхідні продукти.

Метаболіти – проміжні продукти метаболічного шляху.

Наприклад, речовина А перетворюється в кінцевий продукт Е в результаті 6 послідовних ферментативних реакцій.

Ферменти, які каталізують ці послідовні стадії, утворюють мультиферментну систему – продукт першої реакції служить субстратом для наступної реакції, каталізується іншим ферментом тощо. Метаболічні шляхи в основному лінійні, хоч можуть бути і циклічні.

Метаболічні шляхи поділяють не лише за видом послідовності реакцій у них, але й за біологічним значенням для життєдіяльності  організму. Виділяють:

Головні метаболічні шляхи – біохімічні перетворення, що пов’язані з розпадом та синтезом найбільш важливих сполук і є загальними для більшості живих організмів.

Специфічні метаболічні шляхи – біохімічні перетворення окремих індивідуальних сполук, які є специфічними для певного виду обміну.

До головних метаболічних шляхів, наприклад, належать синтез ДНК, РНК, білків, цикл Кребсу, синтез жирних кислот, тощо. До специфічних метаболічних шляхів потрібно віднести метаболізм глюкуронової кислоти, сорбітолу, карнозину, анзерину тощо.

У клітинах організму відбуваються синтез і розпад сполук, тобто процеси, які мають взаємопротилежні напрям і кінцевий результат. Тому в метаболізмі виділяють:

Анаболізм (anabole – від грец. підйом)  – сукупність біохімічних процесів синтезу складних біомолекул з більш простих.

Катаболізм (katabole – від грец. руйнація) – сукупність біохімічних процесів розщеплення складних молекул до більш простих, у тому числі до кінцевих продуктів обміну.

Відповідно всі метаболічні шляхи в організмі поділяють на:

1)       анаболічні – біохімічні перетворення, які спрямовані на синтез білків, ліпідів, вуглеводів тощо.

2)       катаболічні – біохімічні перетворення, які містять реакції розщеплення сполук (гідроліз, окиснення, тощо).

Крім того, існують амфіболічні шляхи, які поєднують процеси катаболізму та анаболізму:

Амфіболізм – процес катаболізму, проміжні метаболіти якого можуть бути використані для синтезу (для анаболізму) інших сполук.

Виходячи з визначення, катаболічний шлях може бути амфіболічним (тобто виконувати амфіболічну функцію) в разі, якщо його проміжні метаболіти вилучаються або використовуються для синтезу інших молекул.

Амфіболічні шляхи надають метаболізму певної гнучкості, що дозволяє здійснювати більш точну регуляцію процесів. Крім того, гіпотетичне існування виключно процесів анаболізму та катаболізму, які мають протилежний напрям реакцій, створювало б цикли (футильні цикли), які б не мали ніякого метаболічного сенсу взагалі, що власне спостерігається при деяких патологічних станах.

Амфіболічні реакції реакції, що застосовують субстрати ЦТК для утворення інтермедіатів, необхідних для біосинтетичних процесів:

1) у ролі амфіболічних можуть виступати реакції, обернені для розглянутих вище перетворень амінокислот в цьому разі дикарбонові кислоти, що утворюються в ЦТК, стимулюють процеси білкового синтезу;

2) важливою реакцією синтезу глюкози (глюконеогенезу) є утворення фосфоенолпірувату з оксалоацетату та ГТФ, тобто фосфоенолпіруваткарбоксикіназна реакція за умов її перебігу в напрямку, зворотному для розглянутого нижче анаплеротичного процесу.

Для підсилення метаболічних шляхів, що необхідно, наприклад, для утворення більшої кількості енергії, в клітинах існують анаплеротичні реакції (поповнювальні). Послідовність таких реакцій продукує метаболіт, який потім може надходити в певний метаболічний процес, робота якого стане більш ефективною, тобто процес буде підсилений.

Утворення субстратів ЦТК в анаплеротичних реащіях:

1.Перетворення амінокислот на дикарбонові кислоти – субстрати ЦТК:

-  утворення α-кетоглутарату в реакціях трансамінування;

-  утворення оксалоацетату в реакціях трансамінування;

-  утворення α-кетоглутарату в глутаматдегідрогеназній реакції;

-  утворення сукциніл-КоА з ізолейцину, валіну, метіоніну, треоніну.

2.Утворення оксалоацетату з пірувату в піруваткарбоксилазній реакції.

Коферментом піруваткарбоксилази є біотин (вітамін Н), який в ході реакції зворотно акцептує СО2, утворюючи N-карбоксибіотин.

Піруваткарбоксилаза – алостеричний фермент, позитивним модулятором якого є ацетил-КоА. За умов низької внутрішньоклітинної концентрації ацетил-КоА активність ферменту і, відповідно, швидкість піруваткарбоксилазної реакції низькі. Накопичення ацетил-КоА, що спостерігається при активації катаболічних процесів, стимулює через утворення оксалоацетату інтенсивність ЦТК і активність окиснення його головного субстрату – ацетил-КоА.

Утворення оксалоацетату з пірувату під дією піруваткарбоксилази є найваж-ливішою анаплеротичною реакцією в клітинах печінки та нирок.

3. Утворення оксалоацетату з фосфоенолпірувату:

Реакція каталізується фосфоенолпіруваткарбоксикіназою. При цьому відбувається утворення макроергічного нуклеозидтрифосфату ГТФ за рахунок розщеплення високоенергетичного зв'язку в молекулі фосфоенолпірувату—метаболіту гліколізу.

Фосфоенолпіруваткарбоксикіназна реакція є анаплеротичною реакцією ЦТК, що має місце в міокарді та інших м'язових тканинах. Ця ж реакція, за умов її перебігу у зворотному напрямку використовується в процесі синтезу глюкози.

З термодинамічної точки зору, всі анаболічні процеси є ендергонічними, тобто відбуваються з поглинанням енергії (реакції синтезу та відновлення).

Відповідно катаболічні процеси – це екзергонічні, тобто супроводжуються виділенням енергії, яка акумулюється у високоенергетичних (макроергічних) сполуках (наприклад, АТФ, креатинфосфат тощо); ці сполуки в подальшому використовуються для анаболічних перетворень (рис. 2). Між катаболізмом та анаболізмом існує взаємозв’язок, який реалізується на енергетичному рівні, а також на рівні субстратів. Катаболічні перетворення постачають енергію для реакцій синтезу.

Крім того, в ході катаболізму відбувається утворення простих сполук, які можуть бути використані для синтезу більш складних.

 

Рис. 2. Поєднання ендергонічних процесів з екзергонічними

 

Катаболічні шляхи вивільняють енергію у вигляді АТФ, а також НАДН2, НАДФН2 і ФАДН2. Ця енергія може використовуватись в анаболічних реакціях для синтезу клітинних макромолекул із низькомолекулярних сполук.

У свою чергу, анаболізм постачає складні речовини для катаболізму, реакції якого перетворюють їх у більш прості й проходять з виділенням енергії. Схематично взаємозв’язок анаболізму та катаболізму показано на рис. 3.

Рис. 3. Взаємозв’язок анаболізму та катаболізму на енергетичному рівні

 

 

Звичайно процеси метаболізму ділять на процеси катаболізму (від грец. kata – вниз) й анаболізму (від грец. ana – вгору). Порівняємо основні особливості цих процесів.

 

Катаболізм

Анаболізм

1.  Розпад складних органічних молекул до більш простих кінцевих продуктів.

1. Синтез складних органічних молекул із більш простих.

2.  Важливі ключові реакції – окиснення метаболітів. Використовуються окиснені коферменти, виникають відновлені.

2. Важливі ключові реакції – відновлення. Використовується відновлені форми коферментів, утворюються окиснені.

3.  Виділяється вільна енергія(екзергонічні процеси). Частина її застосовується для утворення АТФ.

3. Затрачається енергія (ендергонічні процеси). Джерело енергії – АТФ, тобто, в кінцевому результаті, катаболічні процеси.

4.  Із різних вихідних речовин утворюються однакові кінцеві продукти.

4. Однакові вихідні речовини утворюють різні кінцеві продукти.

5.  Проміжні продукти (метаболіти) і кінцеві продукти катаболізму можуть служити субстратами (вихідними речовинами) анаболізму.

5. Кінцеві продукти анаболізму служать вихідними речовинами катаболізму.

 

Таким чином, катаболізм і анаболізм – це пов’язані, взаємодоповнювані процеси, що поєднуються через систему АТФ-АДФ, відновлені й окиснені форми коферментів (НАДН+ і НАД+), субстрати і продукти.

Шлях катаболізму певної речовини і протилежний шлях синтезу цієї ж речовини звичайно дещо відрізняються. Наприклад, розпад глюкози до молочної кислоти в м’язах складається з 11 послідовних стадій, що каталізуються специфічними ферментами. Зворотний шлях (синтез глюкози з молочної кислоти) здійснюється в печінці й включає 8 ферментативних стадій, спільних із катаболічним шляхом, і 3 стадії, відмінні від нього.

Аналогічне спостерігається під час синтезу і розпаду жирних кислот, білків, нуклеїнових кислот. Завдяки неідентичності катаболічний і анаболічний шляхи регулюються незалежно один від одного. Протилежно спрямовані катаболічні й анаболічні шляхи відрізняються своєю локалізацією в клітині, що дає їм змогу відбуватись одночасно і використовувати енергію, яка звільняється під час розпаду речовин, для біосинтезу в інших місцях клітини. Наприклад, окиснення жирних кислот відбувається в мітохондріях, а синтез – у цитоплазмі.

Розглянемо катаболізм детальніше. У ньому можна виділити три головні стадії (рис. 4).

 

 

 

Рис. 4. Стадії катаболізму біомолекул

 

У ферментативному розщепленні складних біоорганічних сполук в організмі виділяють три основних стадії (етапи), що є загальними для катаболізму різних біомолекул.

Стадія 1. На першій стадії катаболізму складні молекули (макромолекули вуглеводів, білків, нуклеїнових кислот та молекули ліпідів) розщеплюються до простих компонентів:

-  полісахариди – до моносахаридів (переважно – глюкози, фруктози, галактози);

-  ліпіди (триацилгліцероли) – до жирних кислот та гліцеролу;

-  білки – до амінокислот;

-  нуклеїнові кислоти – до нуклеотидів.

Реакції першої стадії катаболізму є гідролітичними за своїм механізмом і каталізуються гідролазами травного тракту (шлунка, кишечника). Ці реакції не супроводжуються суттєвим вивільненням хімічної енергії.

Стадія 2. На другій стадії катаболізму декілька десятків метаболітів, що утворились на першій стадії, підлягають ферментативним реакціям розщеплення з вивільненням певної кількості хімічної енергії, яка акумулюється у високоенергетичних (макроергічних) зв'язках АТФ.

Реакції другої стадії катаболізму відбуваються внутрішньоклітинно (в цитоплазмі та частково в мітохондріях). Основними з цих реакцій є:

для моносахаридів — гліколіз, кінцевим метаболітом якого є піровиноградна кислота (піруват), що в подальшому окислнюється до активної форми оцтової кислоти — ацетил-коензиму А (ацетил-КоА);

для жирних кислот — β-окиснення, кінцевим продуктом якого є ацетил-КоА;

для гліцеролу — розщеплення до пірувату який перетворюється в ацетил-КоА;

для амінокислот та нуклеотидів — дезамінування з виділенням аміаку та розщепленням безазотистих молекулярних скелетів до дво- і тривуглецевих карбонових кислот та їх похідних; більшість із цих метаболітів у кінцевому підсумку також утворюють ацетильний радикал у формі ацетил-КоА.

Таким чином, ацетил-КоА це загальний кінцевий продукт другої стадії внутрішньоклітинного катаболізму вуглеводів, ліпідів та амінокислот.

Стадія 3. На третій стадії катаболізму відбувається окиснення ацетил-КоА до кінцевих метаболітів — двоокису вуглецю та води. Ця стадія має місце в мітохондріях і складається з двох процесів:

-       циклу трикарбонових кислот (ЦТК, циклу Кребса), в результаті функціонування якого утворюється СО2, а атоми водню використовуються для відновлення коферментів нікотинамідаденіндинуклеотиду (НАД+) та флавінаденіндинуклеотиду (ФАД);

-       системи електронного транспорту в мембранах мітохондрій, в якій атоми водню (протони та електрони) переносяться на кисень з утворенням Н2О; ця система спряжена з окисним фосфорилюванням, в результаті якого енергія реакцій біологічного окиснення використовується для синтезу молекул АТФ — головного безпосереднього постачальника енергіїу всіх біологічних ендергонічних процесах.

Анаболізм також відбувається в декілька стадій, але є відмінності між тваринами, рослинами і бактеріями щодо тих речовин, з яких починаються анаболічні шляхи. Фотосинтезуючі організми будують вуглеводи із СО2 і Н2О. В організмі тварин і людини анаболізм починається з піровиноградної кислоти, ацетил-КоА, з проміжних продуктів циклу лимонної кислоти. Із порівняно невеликої кількості простих молекул-попередників утворюється широкий набір різноманітних макромолекул.

Перетворення білків, ліпідів і вуглеводів складають центральні метаболічні шляхи: потоки метаболітів на цих шляхах досить великі (сотні чи десятки грам). В організмі є ще інші метаболічні шляхи зі значно меншим потоком метаболітів (добовий синтез чи розпад вимірюється міліграмами). Ці шляхи становлять вторинний метаболізм. Роль його полягає в утворенні таких різних біологічно активних речовин, як коферменти, гормони, медіатори, пігменти.

Отже, метаболізм виконує чотири специфічні функції:

1) постачання хімічної енергії, яка отримується шляхом розщеплення багатих енергією харчових речовин, синтезу макроергічних сполук (АТФ та інших), їх використання для виконання різних видів роботи;

2) перетворення молекул харчових речовин у низькомолекулярні метаболіти (будівельні блоки), що застосовуються далі клітиною для побудови макромолекул;

3) синтез білків, ліпідів, полісахаридів, нуклеїнових кислот та інших клітинних компонентів із цих будівельних блоків із використанням енергії АТФ і НАДФН;

4) синтез і розпад низькомолекулярних, біологічно активних речовин, необхідних для виконання будь-яких специфічних функцій.

Усі метаболічні шляхи в кінцевому результаті взаємозв’язані й при порушенні будь-якого з них змін зазнають усі інші.

 

Регуляція обміну речовин

 

Організм здійснює тонку регуляцію метаболізму, забезпечуючи принцип максимальної економії. Швидкість катаболізму визначається не наявністю в організмі клітинного палива (глюкози, жиру), а потребою в енергії. Білки, нуклеїнові кислоти та їх структурні компоненти синтезуються тільки тоді, коли вони потрібні, й у такій кількості, яка необхідна. Надлишок харчових речовин відкладається в організмі тварин і людини. Такими запасними речовинами є глікоген і жир, а білки і нуклеїнові кислоти в запас не відкладаються.

Є декілька видів регуляторних механізмів:

1) регуляція швидкості надходження метаболітів у клітину;

2) регуляція синтезу ферментів шляхом індукції і репресії;

3) регуляція активності наявних ферментів шляхом алостеричної регуляції, ковалентної модифікації, активації проферментів.

В організмі людини клітини різних органів і тканин диференційовані для виконання специфічних біохімічних і фізіологічних функцій. Тому існують системи, які узгоджують і координують роботу різних органів і тканин. Таку інтегруючу роль відіграють гормональна (ендокринна) і ­нервова системи (рис. 5), а також судинна система, яка служить для перенесення всіх хімічних речовин в організмі. У нормі ці системи взаємодіють, доповнюючи одна одну.

Дорослий здоровий організм знаходиться в стаціонарному стані й головним фактором, який визначає баланс процесів обміну речовин, є співвідношення між споживанням їжі й витратою енергії.

 

Рис. 5. Регуляція обміну речовин

 

Недостатнє харчування швидко призводить до зворотної мобілізації енергії із депонованих продуктів, однак тривале голодування чи неповноцінне харчування викликає незворотний розпад тканин. Процеси катаболізму часто переважають в умовах патології. А в період одужання після захворювань, у процесі загоювання ран, у молодому організмі, який росте, та під час вагітності переважає анаболізм. Патологічно виражена перевага анабо­лізму може призвести до надмірного росту гігантизму (рис. 6), чи ожиріння .

Для біохімічної діагностики захворювань використовують той факт, що регуляторні механізми підтримують концентрацію ряду важливих метаболітів у певних межах (рівень норми), а при патології концентрація їх змінюється, причому ці зміни часто бувають специфічними для тієї чи іншої хвороби. Оскільки концентрація метаболітів змінюється і внаслідок споживання їжі, переходу від спокою до фізичної роботи, то дослідження проводять звичайно натще, після нічного сну.

 

Окиснювальне декарбоксилювання піровиноградної кислоти

 

Процес окиснювального декарбоксилювання пірувату включає реакції дегідрування і декарбоксилювання, коли карбоксильна група пірувату вивільняється у вигляді СО2, а ацетильний залишок, тобто залишок оцтової кислоти, переноситься на коензим А.

Каталізує цю сукупність реакцій складний піруватдегідрогеназний комплекс, локалізований у мітохондріях. Тому спочатку піруват переходить із цитоплазми, де відбувається гліколіз, у матрикс мітохондрій.

Піруватдегідрогеназний комплекс складається з 3 різних ферментів: піруватдегідрогенази, дигідроліпоатацетилтрансферази і дигідроліпоатдегідрогенази. До його складу входять 5 коферментів: тіамін-дифосфат (ТДФ), коензим А (КоА), ліпоєва кислота, НАД і ФАД. ТДФ – це похідне вітаміну В1 (тіаміну), КоА – вітаміну В3 (пантотенової кислоти), НАД – вітаміну РР (нікотинаміду), ФАД – вітаміну В2 (рибофлавіну), а ліпоєва кислота є вітаміноподібною сполукою. При нестачі цих вітамінів окиснювальне декарбоксилювання піровиноградної кислоти і ряду інших альфа-кетокислот гальмується; накопичення пірувату і лактату зумовлює ацидоз. У хворих із спадковою недостністю піруватдегідрогенази також може розвинутись ацидоз, особливо після навантаження глюкозою.

Кожний із ферментів піруватдегідрогеназного комплексу каталізує певний етап сумарної реакції, причому ультраструктура комплексу, компактне розміщення всіх компонентів забезпечують ефективну роботу без звільнення проміжних продуктів до завершення процесу. На рис. 11, 12 схематично наводиться послідовність реакцій.

На 1-й стадії піруватдегідрогеназа (Е1) каталізує декарбоксилювання пірувату з утворенням гідроксіетильного похідного, приєднаного до коферменту ТДФ. Цей проміжний продукт на 2-й стадії взаємодіє з ліпоєвою кислотою – простетичною групою другого ферменту комплексу дигідроліпоатацетилтранс­ферази (Е2). Ліпоєва кислота може існувати в окисненій (дисульфідній), відновленій (дигідроліпоєва кислота) і відновленій ацильованій формах.

При взаємодії дисульфідної форми ліпоєвої кислоти з гідроксі­етильною групою остання окиснюється до ацетильної групи і зв’язу­ється з атомом сірки відновленої ліпоєвої кислоти. Ця окисно-відновна реакція супроводжується утворенням макроергічного тіоефірного зв’язку.

 

 

 

 

Рис. 11. Стадії окиснювального декарбоксилювання піровиноградної кислоти

 

Дигідроліпоатацетилтрансфераза каталізує перенесення ацетильного залишку з ацетилліпоєвої кислоти на КоА з утворенням ацетил-КоА і дигідро­ліпоєвої кислоти (3-я стадія).

Таким чином, перші три реакції здійснюють перетворення пірувату і КоА в продукти – ацетил-КоА і СО2.

Дві наступні стадії необхідні для отримання вихідної окисненої форми ліпоєвої кислоти. Дигідроліпоатдегідрогеназа, яка містить простетичну групу ФАД, окиснює дигідроліпоєву кислоту (4-а стадія) і далі передає 2 атоми водню з ФАДН2 на НАД+ (5-а стадія).

Після завершення процесу три коферменти (ТДФ, ліпоєва кислота і ФАД), зв’язані з ферментами, знаходяться у своїй вихідній формі й можуть брати участь у наступному циклі. Два інші коферменти дисоцію­ють з комплексу. Коензим А поставляє ацетильну групу в цикл ­лимонної кислоти, а НАДН, Н+ передає водень на мітохондріальний дихальний ланцюг.

 

 

 

Рис. 12. Схема піруватдегідрогеназного комплексу

 

Процес окиснювального декарбоксилювання пірувату супроводжується значним зменшенням стандартної вільної енергії і практично незворотний. Активність піруватдегідрогеназного комплексу регулюється двома способами. По-перше, продукти реакції – ацетилКоА і НАДН – є алостеричними інгібіторами комплексу. І тоді, коли окиснення ацетил-КоА в циклі лимонної кислоти відстає від утворення його пірувату чи жирних кислот, активність піруватдегідрогеназного комплексу гальмується. Такий же ефект має місце при накопиченні НАДН внаслідок перевантаження дихального ланцюга. Активує комплекс фруктозо-1,6-дифосфат – проміжний продукт гліколізу. Алостеричні ефекти проявляються дуже швидко.

Другий механізм регуляції (повільніший) – це переходи між активною і неактивною формами ферменту внаслідок фосфорилювання і дефосфорилювання (рис. 13).

 

 

 

Рис. 13. Регуляція піруватдегідрогеназного комплексу

 

Фосфорильована форма піруватдегідрогенази неактивна, а нефосфорильована – активна. Реакцію фосфорилювання ферменту під дією АТФ каталізує кіназа піруватдегідрогенази, яка активується при високому рівні НАДН і АТФ.

Отже, в таких умовах піруватдегідрогеназний комплес виключається. Протилежний процес активації піруватдегідрогенази шляхом дефосфорилювання каталізує фосфатаза, яка активується іонами Са+2. Рівень їх у клітині завжди зростає при збільшенні потреби в АТФ. Кіназа і фосфатаза входять до складу піруватдегідрогеназного мультиферментного комплексу.

 

РЕАКЦІЇ ЦИКЛУ ЛИМОННОЇ КИСЛОТИ

Цикл Кребса виконує такі функції:

1)    інтегративну  – поєднує шляхи метаболічних перетворень ліпідів, вуглеводів, білків: вказані паливні молекули можуть розщеплюватися до інтермедіатів циклу і синтезуватися з них;

2)    енергетичну – в циклі Кребса є одна реакція субстратного фосфорилювання, в якій утворюється 1 молекула ГТФ; потім ГТФ бере участь в утворенні 1 молекули АТФ (тобто енергетичний баланс самого циклу, без подальших перетворень відновних еквівалентів, становить 1 АТФ);

3)        воденьгенеруючу – цикл є головним генератором Н+ для роботи дихального ланцюга, тому що в циклі Кребса відбувається відновлення НАД+ до НАДН.Н+ та ФАД до ФАДН2; далі НАДН.Н+ та ФАДН2 окиснюються в дихальному ланцюзі, робо-та якого приводить до синтезу АТФ (тому сумарний енергетичний баланс одного циклу більше ніж 1 АТФ і становить 12 молекул АТФ – розрахунок буде наведений нижче);

4)    амфіболічну – інтермедіати цього катаболічного процесу можуть бути використані для синтезу інших сполук. Виведення проміжних метаболітів з циклу повинно бути пов’язане з високою катаболічною активністю циклу Кребса для продукції АТФ.

Під час виведення інтермедіатів циклу лимонної кислоти для синтетичних процесів їх концентрація не повинна суттєво знижуватися, тому що це може нашкодити процесу генерації енергії. Тому в клітині існують «запобіжні клапани», які допомагають підтримувати концентрацію проміжних метаболітів циклу на необхідному рівні – це анаплеротичні реакції.

До таких реакцій належить:

-       піруваткарбоксилазна реакція, яка каталізує утворення оксалоацетату з пірувату (одна з основних анаплеротичних реакцій);

-       аспартат-амінотрансферазна реакція, яка каталізує утворення оксалоацетату з аспартату;

-       глутаматдегідрогеназна реакція, яка каталізує утворення α-кетоглутарату з глутамату;

-        утворення сукциніл-КоА з пропіоніл-КоА, який, у свою чергу, утворюється при катаболізмі амінокислот з розгалуженим ланцюгом (Вал, Іле) та жирних кислот з непарним числом атомів вуглецю (один з основних анаплеротичних процесів);

-       утворення фумарату при катаболізмі ароматичних амінокислот (Фен, Тир);

-       γ-амінобутиратний шунт – процес, який відбувається в мозку і пов’язаний з утворенням ГАМК (гамма-аміномасляної кислоти) – важливого нейромедіатора гальмування, та  її катаболізмом до сукциніл-КоА.

10% глюкози мозку використовується для функціонування цього процесу, тобто він є вкрай важливим для нормальної роботи мозку.

Таким чином, на рівні циклу Кребса відбувається ефективна координація катаболічних та анаболічних процесів, що можливо завдяки існуванню численних високоточних регуляторних механізмів.

Цикл лимонної кислоти включає послідовно 8 реакцій, у результаті яких ацетильна група (СН3СО-) ацетил-КоА розпадається з утворенням СО2 і атомів водню, які передаються на окиснені форми коферментів НАД і ФАД. Послідовність не лінійна, а циклічна, оскільки починається з конденсації двовуглецевої ацетильної групи з щавлевооцтовою кислотою (з чотирма атомами вуглецю). В результаті виникає лимонна кислота (з шістьма атомами вуглецю), далі в реакції декарбоксилювання виділяються 2 молекули СО2 і в останній реакції циклу знову утворюється щавлево­оцтова кислота (рис. 14).

 

 

 

Рис. 14. Схема циклу лимонної кислоти

1.    Проміжні продукти циклу можна назвати як кислоти і як аніони кислот.

2.    Цифрами вказано число атомів вуглецю у сполуках (в ацетил-КоА і сукциніл-КоА – без вуглецевих атомів коензиму А).

 

Ацетил-КоА утворюється не тільки з пірувату, а й із жирних кислот, амінокислот, тому цикл лимонної кислоти розглядається як загальний, кінцевий шлях катаболізму вуглеводів, жирів і амінокислот. Усі реакції циклу відбуваються в мітохондріях. Відновлені НАДН і ФАДН2, які утворюються у реакціях дегідрування циклу, окиснюються шляхом переносу протонів і електронів по дихальному ланцюгу внутрішньої мембрани мітохондрій на кисень.

1. Реакцію конденсації ацетил-КоА з оксалоацетатом з утворенням цитрату каталізує цитрат-синтаза.

 

 

Реакція не вимагає затрати АТФ, а необхідна енергія забезпечується гідролізом тіоефірного зв’язку ацетил-КоА. Цитрат-синтаза – регуляторний фермент циклу, активність його гальмується АТФ, НАДН і проміжним продуктом циклу – сукциніл-КоА.

2. Цитрат ізомеризується в ізоцитрат двохетапною реакцією під дією аконітази. При відщепленні молекули води утворюється цис-аконітова кислота, яка, не відділяючись від активного центру ферменту, приєднує ту ж молекулу води іншим способом. Реакція зворотна:

 

 

3. Ізоцитрат окиснюється шляхом дегідрування й одночасно декарбоксилюється під дією ізоцитратдегідрогенази:

 

 

Для дії ферменту потрібні іони Мg2+ чи Мn2+. Алостеричні активатори ізоцитратдегідрогенази – АДФ і НАД+, інгібітори – АТФ і НАДН. У цитоплазмі клітин відкрита НАДФ-залежна ізоцитратдегідрогеназа.

4. Окиснювальне декарбоксилювання альфа-кетоглутарату до сукциніл-КоА каталізує альфа-кетоглутаратдегідрогеназний комплекс, що, як і піруват­дегідрогеназний комплекс, включає 3 ферменти і 5 коферментів – ТДФ, ліпоєву кислоту, КоА, ФАД і НАД+. Механізм реакції також аналогічний до окиснювального декарбоксилювання пірувату. Частина енергії, що вивільняється в реакції окиснення, зберігається в макроергічному тіоефір­ному зв’язку сукциніл-КоА. Активність альфа-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу гальмують АТФ і продукти реакції – НАДН і сукциніл-КоА.

 

 

5. У наступній реакції розрив макроергічного зв’язку сукциніл-КоА при перетворенні у вільний сукцинат поєднаний з утворенням гуанозинтрифосфату, так що енергія макроергічного зв’язку зберігається:

 

 

Отже, ця реакція субстратного фосфорилювання аналогічна реакціям синтезу АТФ у процесі гліколізу. Каталізує її сукциніл-тіокіназа. Синтезований ГТФ може передати свою кінцеву фосфатну групу на АДФ з утворенням АТФ при дії нуклеозиддифосфаткінази.

6. Сукцинат окиснюється до фумарату. Сукцинатдегідрогеназа, яка каталізує цю реакцію, містить простетичну групу ФАД, що відновлюється до ФАДН2, і залізо-сірчані центри:

 

 

 

Конкурентним інігібітором сукцинатдегідрогенази є малонова кислота. Серед ферментів циклу лимонної кислоти тільки сукцинатдегідрогеназа локалізована на внутрішній мембрані мітохондрій, а інші знаходяться в їх матриксі.

7. Стереоспецифічний фермент фумараза (фумаратгідратаза) ката­лізує гідратацію фумарової кислоти в L-яблучну (малат):

 

 

8. Малат окиснюється НАД-залежною малатдегідрогеназою до оксалоацетату:

 

 

Молекула оксалоацетату може з’єднуватись із новою молекулою ацетил-КоА і починати новий оберт циклу.

 

1. У цикл входить двовуглецева ацетильна група (в складі ацетил-КоА), а виходять 2 молекули СО2.

2. У чотирьох реакціях дегідрування від проміжних продуктів циклу відриваються 4 пари атомів водню. Із них 3 пари використовуються на відновлення НАД+, а одна пара – ФАД.

3. Частина атомів кисню, необхідних для утворення СО2, і атомів водню – для відновлення коферментів, постачаються молекулами води, які застосовуються в реакціях циклу.

 

 

 

 

Рис. 15. Цикл Кребса

 

4. Молекула оксалоацетату, що потрапляє в цикл, у результаті ­одного оберту циклу регенерується. Таким чином, оксалоацетат у циклі не ви­тра­чається і наново не утворюється (як і інші проміжні продукти циклу).

5. Один раз у циклі має місце реакція субстратного фосфорилювання, коли за рахунок макроергічного зв’язку субстрату утворюється молекула ГТФ (АТФ).

Для нових обертів циклу відновлені коферменти повинні окиснитись, що відбувається шляхом переносу електронів і протонів по дихальному ланцюгу внутрішньої мембрани мітохондрій на молекулярний кисень з утворенням молекул води. Саме тому цикл лимонної кислоти є аеробним киснезалежним шляхом, хоч у жодній реакції циклу молекулярний кисень не використовується. За рахунок окиснювального фосфорилювання, поєднаного з переносом електронів і протонів по дихальному ланцюгу, забезпечується синтез основної кількості АТФ. Враховуючи, що окиснення однієї молекули НАДН призводить до утворення 3 молекул АТФ, окиснення однієї молекули ФАДН2 – 2 АТФ, загальний вихід АТФ при окисненні однієї молекули ацетил-КоА складає 12 АТФ.

 

Енергетичний баланс циклу трикарбонових кислот

Біохімічний підсумок циклу трикарбонових кислот полягає в утворенні двох молекул СО2 (в ізоцитратдегідрогеназній та α-кетоглутаратдегідрогеназній реакціях) та чотирьох пар атомів водню, три з яких акцептуються НАД та одна – ФАД. Відновлені коферменти окислюються в дихальному ланцюзі мітохондрій, утворюючи за рахунок окисного фосфорилювання по 3 молекули АТФ на кожну молекулу НАДН і по 2 молекули АТФ на кожну молекулу ФАДН2. Крім того, одна молекула АТФ утворюється в субстратному фосфорилюванні при перетворенні сукциніл-КоА в сукцинат.

 Таким чином, при повному окисненні однієї молекули ацетил-КоА до СО2 та Н2О в циклі трикарбонових кислот генерується 12 молекул АТФ.

 

Участь вітамінів у роботі циклі лимонної кислоти

Для роботи циклу потрібні п’ять вітамінів:

1)       В1 (тіамін) у вигляді тіаміндифосфату (ТДФ) є коферментом α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу;

2)       В2 (рибофлавін), коферментна форма якого – ФАД, є складовою α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу та сукцинатдегідрогенази;

3)       РР (ніацин) у вигляді НАД входить до складу трьох дегідрогеназ ЦЛК (ізоцитратдегідрогенази, α-кетоглута-ратдегідрогеназного комплексу, малатдегідрогенази);

4)       В5 (пантотенова кислота) входить до складу коферменту А (КоА), який бере участь в активації ацильних залишків і утворює ацетил-КоА та сукциніл-КоА;

5)       ліпоєва кислота – дві молекули цієї кислоти у вигляді аміду входять до складу α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу (другого ферменту комплексу Е2 ).

Тобто у складі α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу функціонують  В1, В2, РР, ліпоєва кислота.

 

Роль циклу лимонної кислоти в анаболізмі

Як розглянуто вище, цикл лимонної кислоти служить для окиснення до СО2 і Н2О ацетил-КоА і, таким чином, є заключним етапом катаболізму вуглеводів, жирних кислот і амінокислот. Але, крім того, цикл відіграє значну роль і в біосинтезі основних класів біомолекул. Так, субстрат і проміжні продукти можуть виходити з циклу і використовуватись як попередники для біосинтезу різних сполук. Зокрема, альфа-кетоглутарат, оксалоацетат, а також тісно зв’язаний із циклом лимонної кислоти піруват використовуються для синтезу амінокислот. Оксалоацетат є проміжним продуктом глюконеогенезу – процесу синтезу глюкози з невуглеводних попередників (лактату і пірувату, амінокислот).

Таким чином, будь-який проміжний продукт циклу лимонної кислоти, переходячи в оксалоацетат, може застосовуватись для синтезу глюкози і глікогену. Ацетил-КоА є вихідною речовиною для синтезу жирних кислот, який здійснюється в цитоплазмі. І оскільки ацетил-КоА утворюється в мітохондріях, а через мітохондріальну мембрану прямо не переноситься, транспортною системою є сама лимонна кислота. Тобто в умовах, які сприяють використанню ацетил-КоА для синтезу жирних кислот, мітохондріальна цитрат-синтаза каталізує утворення лимонної кислоти, яка не починає цикл, а виходить у цитоплазму, де під дією ферменту цитратліази розпадається на ацетил-КоА й оксалоацетат. Ще один проміжний продукт циклу лимонної кислоти – сукциніл-КоА – використовується для синтезу гему.

При застосуванні проміжних продуктів циклу лимонної кислоти (від цитрату до оксалоацетату) для біосинтезу різних речовин у клітині знижується вміст оксалоацетату і в результаті активність циклу повинна би зменшуватись аж до зупинки його. Така вірогідність запобігається реак­ціями, які покривають втрати проміжних продуктів циклу. Основною з них є перетворення в мітохондріях пірувату в оксалоацетат під дією піруваткарбоксилази:

 

 

У піруваткарбоксилазі коферментом виступає вітамін Н (біотин). За рахунок розщеплення АТФ утворюється проміжний комплекс – фермент-біотин-СОО-, з якого карбоксильна група переноситься на піруват. Активатором піруваткарбоксилази є ацетил-КоА. Таким чином, при на­явності ацетил-КоА і недостачі оксалоацетату стимулюється піруваткарбоксилазна реакція, в результаті утворюється більше оксалоацетату, що забезпечує синтез лимонної кислоти і функціонування циклу. Використання проміжних продуктів циклу лимонної кислоти з біосинтетичною метою повинно супроводжуватись катаболічною активністю циклу для утворення АТФ, який необхідний для здійснення реакцій анаболізму. Таким чином, цикл повинен одночасно виконувати обидві функції. Зазначимо, що окиснення ацетил-КоА в циклі, тобто катаболічна функція, не вимагає одночасного застосування проміжних продуктів для синтезу біомолекул.

Отже, цикл лимонної кислоти разом із тканинним диханням і окиснювальним фосфорилюванням забезпечує утворення основної кількості АТФ у клітині, об’єднує процеси метаболізму всіх основних класів біомолекул, зв’язує процеси катаболізму й анаболізму.

 

Регуляція циклу лимонної кислоти

Цикл лимонної кислоти регулюється рядом факторів. По-перше, концентрацією субстратів – ацетил-КоА і оксалоацетату. Ацетил-КоА утворюється при катаболізмі вуглеводів і жирних кислот, його рівень визначається активністю піруватдегідрогеназної реакції і ­окисненням жирних кислот. Концентрація в мітохондріях оксалоацетату, який утворюється в піруваткарбоксилазній реакції, а також з аспарагінової кислоти, досить низька і залежить від метаболічних умов. Використовується оксалоацетат у різних метаболічних шляхах:

1) у циклі лимонної кислоти;

2) для глюконеогенезу;

3) для утворення аспарагінової кислоти, яка застосовується для синтезу пуринів, піримідинів, аргініну і сечовини;

4) для компенсації втрат із циклу лимонної кислоти інших проміжних продуктів (цитрату, альфа-кетоглутарату, сукциніл-КоА).

У нормальних умовах баланс між кількістю ацетил-КоА й оксалоацетату досягається завдяки активації ацетил-коензимом А піруваткарбоксилазної реакції. Баланс порушується під час голодування, коли внаслідок окиснення тканинного жиру в печінці накопичується надлишок ацетил-КоА, і при цукровому діабеті, коли порушується катаболізм глюкози і внаслідок недостачі пірувату не утворюється достатня кількість оксало­ацетату. У цих випадках відносна нестача оксалоацетату, порівняно з рівнем ацетил-КоА, гальмує цикл лимонної кислоти, зумовлює підвищений синтез з ацетил-КоА кетонових тіл і розвиток кетозу.

Крім цитратсинтази, регуляторними ферментами циклу лимонної кислоти є ізоцитратдегідрогеназа й альфа-кетоглутаратдегідрогеназа. Усі вони чутливі до співвідношення концентрацій у клітині АТФ/АДФ, НАДН/НАД+ (табл. 4).

 

Таблиця 4. Активатори й інгібітори регуляторних ферментів циклу Кребса

 

Фермент

Інгібітор

Активатори

Цитратсинтаза

АТФ, НАДН, сукциніл-КоА

 

Ізоцитратдегідрогеназа

АТФ, НАДН

АДФ, АМФ

α-кетоглутаратдегідрогеназа

АТФ, НАДН, сукциніл-КоА

 

 

При високих значеннях цих відношень активність регуляторних ферментів циклу пригнічується. Таким чином, коли в клітині є високий рівень АТФ, робота циклу припиняється, а при використанні АТФ і зростанні рівня АДФ – стимулюється. Інгібітором цитратсинтази й альфа-кето­глутаратдегідрогенази служить також сукциніл-КоА – проміжний продукт циклу.

 

БІОЕНЕРГЕТИЧНІ ПРОЦЕСИ

 

Розділ біохімії, що займається питаннями перетворення і використання енергії у живих системах, називається біоенергетикою. Біоенергетика грунтується на процесах окиснення органічних речовин.

 

Рис. 1. Поєднання ендергонічних процесів з екзергонічними

 

В біології міцно закріпилось уявлення, що дихання в організмі (окиснення) за своєю суттю є процесом “горіння", яке відбувається дуже повільно. Отже, поживні речовини, що потрапили в організм з їжею, є “паливом", яке згорає в організмі шляхом приєднання кисню повітря. Разом з тим, було звернуто увагу на той факт, що повільне “го­ріння" органічних речовин в організмі істотно відрізняється від такого, що проходить поза організмом: по-перше, воно відбувається при низькій температурі, по-друге, – при відсутності полум'я і, по-третє, – за наявності води, вміст якої в тканинах досить високий.

Біологічне окиснення – це сума всіх окисно-відновних процесів, включаючи анаеробні, що відбуваються в клітинах організму (цитоплазмі, мітохондріях, ендоплазматичному ретикулумі). Основними субстратами біологічного окиснення є вуглеводи та ліпіди, саме їх катаболізм дає найбільшу кількість хімічної енергії, що акумулюється у високоенергетичних зв’язках макроергів.

 

Функції біологічного окиснення:

1.    Забезпечення клітин енергією;

2.    Забезпечення клітин пластичним матеріалом для відтворення структур організму;

3.    Знешкодження токсичних речовин.

Біологічне окиснення каталі­зується ферментами  і може відбуватися такими шляхами:

1) приєднання кисню до субстрату окиснення;

2) відщеплення водню від субстрату (дегідрування);

3) відщеплення електронів.

Біоенергетика включає 3 вузлові питання:

1) джерела енергії;

2) способи перетворення і нагромадження енергії;

3) шляхи використання енергії.

 

        

Шляхи синтезу АТФ в клітинах: субстратне та окисне фосфорилювання, їх відмінності.

 

Синтез АТФ із АДФ і фосфату (фосфорилювання  АДФ) відбувається в організмі за двома шляхами, котрі відрізняються  один від іншого джерелом енергії  для утворення макроергічного зв’язку :

Окисне фосфорилювання (головний шлях синтезу):  здійснюється за рахунок енергії окиснення електронів і протонів водню, відщеплених від різноманітних сполук (метаболітів або  субстратів окиснення), який відбувається за участю дихального ланцюга мітохондрій за рахунок електрохімічного потенціалу внутрішньої мембрани. Реакції цього процесу відбуваються виключно в аеробних умовах. Основна кількість АТФ в організмі  утворюється саме в реакціях окисного фосфорилювання.

Субстратне фосфорилювання  - процес синтезу АТФ, який відбувається як результат окиснення субстратів без участі дихального ланцюга мітохондрій. У цьому разі перетворення субстрату в продукт супроводжується фосфорилюванням АДФ з утворенням АТФ. В організмі є три реакції субстратного фосфорилювання (дві – в гліколізі, одна – в ЦТК). Кожна з цих реакцій супроводжується утворенням лише одної молекули АТФ. Цей процес можливий як в аеробних, так і анаеробних умовах і відбувається в цитоплазмі і матриксі мітохондрій.

Отже, процес біологічного окиснення субстратів – проміжних продуктів метаболізму вуглеводів, жирів і амінокислот – відбувається не за рахунок приєднання атомів кисню до молекули речовини, а шляхом відщеплення атомів водню (дегідрування) і багатоетапного перенесення електронів і протонів на молекулярний кисень.

 

Основні компоненти дихального ланцюга

Мітохондрії – органели клітини, функціонування яких для будь-якої обізнаної людини чітко асоціюється з продукуванням енергії. Дійсно в матриксі мітохондрій локалізовані різноманітні ферменти, що необхідні для окиснення субстратів. Крім того, внутрішня мембрана мітохондрій містить систему білків-переносників електронів, які забезпечують термінальний етап окиснення субстратів і створюють умови для синтезу АТФ (рис. 11).

 

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/7b/Animal_mitochondrion_diagram_uk.svg/320px-Animal_mitochondrion_diagram_uk.svg.png

 

Рис. 11. Структура  мітохондрії

 

 

Рис. 12. Молекулярна організація ланцюга перенесення електронів

 

Саме така послі­довність компонентів не є випадковою, а зумовлена величинами їх окисно-відновного потенціалу (Ео).

 

Табл. 1. Окисно-відновні потенціали компонентів дихального ланцюга

Значення Ео в послідовності від НАД+ до О2 поступово зро­стає. При повному переході двох електронів від ОВ пари ­НАДН/НАД+о=‑0,32 В) до ОВ пари Н2О/1/2О2о =+0,82 В) зміна вільної енергії дорівнює 220 кДж (52,6 ккал). Кожний акт переходу електронів між ­проміжними компонентами дихального ланцюга супроводжу­ється виді­лен­­ням певної порції вільної енергії  (рис. 13).

 

Рис.  13.  Вивільнення енергії в ланцюгу біологічного окиснення

 

Таким чином, завдя­ки на­­яв­нос­ті в ланцюгу перенесення електронів від субстратів до О2 великої кіль­кості проміжних переносників енергія виділяється порціями і може бути використана для синтезу декількох молекул АТФ. Синтез АТФ із АДФ і Фн у стандартних умовах потребує 34,5 кДж/моль (8,3 ккал/моль), а в умовах живої клітини – приблизно 50 кДж/моль (12 ккал/моль). Перепад енергії між НАДН/НАД+ і Н2О / 1/2О2 (220 кДж/моль) достатній для синтезу не менше 4 молекул АТФ. Але експериментальні дослідження показали, що синтезується максимум 3 молекули АТФ. Саме на 3 ділянках дихального ланцюга перенесення електронів від одного компонента до наступного супроводжується перепадом вільної енергії, достатнім для синтезу АТФ.

Усі учасники ланцюга перенесення електронів структурово об’єднані в чотири окисно-відновні системи – мультиферменті комплекси IIV.

Процес окиснення починається з перенесення протонів і електронів з субстрату, що окиснюється, на  НАД+  або  ФАД. Це залежить від природи субстрату. Кожен із комплексів здатний каталізувати певну частину повної послідовності реакцій ланцюга .

Комплекс IНАДН-дегідрогеназа – флавопротеїн, що містить ФМН. Цей фермент окиснює  НАДН і передає два атоми водню (2Н+ 2е-) на коензим Q. Комплекс також містить FeS-білки. Комплекс II – сукцинатдегідрогеназа – флавопротеїн, що містить ФАД. Цей фермент окиснює сукцинат і транспортує  два атоми водню (2Н+ 2е-) на коензим Q. У складі  комплекса присутні  FeS-белки. У матриксі мітохондрій також містяться й інші  ФАД-залежні  дегідрогенази, котрі окиснюють відповідні  субстрати (гліцерол-3-фосфат, ацил-КоА) та далі передають атоми  водню на коензим Q. Потоки атомів водню обєднуються  на стадії утворення відновленого КоQН2 .

Коензим Q є останнім компонентом ланцюгу, котрий здатний транспортувати не тільки   протони, але й електрони (2Н+ 2е-). Далі протони (2Н+) переходять із внутрішньої поверхні мембрани мітохондрії на зовнішню, а електрони  (2е-) крізь ланцюг   цитохромів переносяться на кисень.

Комплекс III – убіхінондегідрогеназа – це ферментний комплекс, котрий включає цитохром b, FeS-білок і цитохром с1. Цей комплекс транспортує електрони 2е- від відновленого убіхінону КоQН2 на цитохром с (невеликий за розмірами водорозчинний білок, що міститься на зовнішній стороні  внутрішньої мембрани).

Комплекс IV – цитохром с-оксидаза – ферментний комплекс, що складається з цитохромів а й а3. Ці ферменти здійснюють останню стадію біологічного окиснення – відновлення електронами ( 2е- ) молекулярного кисню:

2е + 1/2О2 = О2-

 

Відновлений кисень  О2- реагує з вільними  протонами (2Н+ )   матриксу. В результаті реакції утворюється ендогенна, або метаболічна вода (рис. 15):

 

 

Рис. 15. Утворення метаболічної води в результаті реакції відновленого кисню О2, який реагує з вільними протонами 2Н+ матриксу

 

При проходженні по дихальному ланцюгу пари електронів вивільняється енергія, більша частина  котрої (60%) розсіюється у вигляді тепла, а інша акумулюється у макроергічниз зв’язках АТФ,  а саме поглинається в реакції синтезу АТФ-окисному  фосфорилюванні (рис. 16) .   

 

 

Рис. 16. Вивільнення енергії при проходженні по дихальному ланцюгу пари електронів

 

Це фосфорилювання називається окисним, тому що енергія, що необхідна  для утворення макроергічного зв’язку, генерується у процесі окиснення, тобто руху протонів і електронів по мітохондріальному ланцюгу транспорту електронів

Перша така ділянка – це НАД ®ФМН, друга – цитохром b ®ци­то­­хром с1, третя – цитохром аа3 ® кисень. Ці ділянки називають пунк­тами фосфорилювання. Термін “пункт фосфорилювання” чи “ділянка фос­форилювання” не треба розуміти як конкретну стадію, на якій без­посередньо відбувається утворення АТФ. Ідеться про те, що потік електронів через ці три ділянки ланцюга якимось чином поєднаний з утворенням АТФ (перепад ОВП тут достатній для синтезу 1 моле­кули АТФ).

При окисненні субстратів ФАД-залежними дегідрогеназами (наприклад, сукцинату сукцинатдегідрогеназою) потік електронів від ФАДН2 до кисню не проходить через перший пункт фосфорилювання. У цих випадках синтезується на 1 молекулу АТФ менше, тобто дві.

 

Механізм поєднання перенесення електронів і окиснювального фосфорилювання

Синтез АТФ із АДФ і Фн за рахунок енергії, що звільнюється при перенесенні електронів по дихальному ланцюгу, називається окиснювальним фосфорилюванням (ОФ). Існує декілька доказів поєднання цих процесів. По-перше, окиснення НАДН чи ФАДН2 у мітохондріях дійсно су­проводжується одночасним синтезом АТФ. По-друге, при наявності інгібіторів дихального ланцюга утворення АТФ зменшується. По-третє, відкриті хімічні речовини, які роз'єднують процеси переносу електронів і синтезу АТФ, не порушуючи перенесенні електронів по дихальному ланцюгу.

Тканинне дихання й ОФ поєднані не тільки енергетично, а і просторово на внутрішній мембрані мітохондрій. У ній локалізовані компоненти дихального ланцюга і ферменти, які каталізують реакцію синтезу АТФ. Через зовнішню мембрану мітохондрій легко проникають майже всі молекули й іони невеликих розмірів, тоді як внутрішня мембрана для більшості іонів невеликого розміру є непроникною. У ній є спеціальні транспортні системи, які переносять із цитоплазми в матрикс мітохондрій піруват та інше клітинне паливо, а також АДФ і неорганічний фосфат, а з мітохондрій у цитоплазму – АТФ. Матрикс містить піруватдегідрогеназну систему, ферменти циклу лимонної кислоти (циклу Кребса), ферменти окиснення жирних кислот тощо. Саме НАД- та ФАД-залежні ­дегідрогенази цих метаболічних шляхів переносять атоми водню на ­дихальний ланцюг. Компоненти дихального ланцюга утворюють у внутрішній мембрані високоупорядкований ансамбль. Точна локалізація всіх компонентів поки що не вивчена, але встановлено, що деякі білки розміщені на одному боці внутрішньої мембрани, а інші – на протилежному. Крім того, деякі білки дихального ланцюга пронизують мембрану наскрізь. Фермент, який каталізує синтез АТФ (АТФ-синтаза або ­Н+‑АТФаза), складається з двох компонентів: Fо і F1 (рис.17).

 

Рис. 17. Схема окисного фосфорилювання за хеміосмотичною теорією

 

http://www.youtube.com/watch?v=YndC0gS3t6M&feature=related

Компонент F1 нагадує шапочку гриба і повернений у бік матрикса мітохондрій. За допомогою ніжки він прикріплений до компонента Fo, який фіксується у мембрані й пронизує її наскрізь.

Існують три основні гіпотези про механізм поєднання (спряження) дихання й ОФ: хімічна, хеміосмотична і конформаційна. Згідно з хімічною гіпотезою, енергія, що виділяється при перенесенні електронів по дихальному ланцюгу, використовується для утворення високоенергетичного проміжного комплексу. Далі цей проміжний продукт розщеплюється і передає енергію на утворення АТФ. Але всі спроби відкрити проміжний ­висо­коенергетичний комплекс не дали результату.

Гіпотеза конформа­ційного поєднання припускає, що виділення енергії при транспорті електронів зумовлює зміни конформації біл­ко­вих компонентів внут­рішньої мембрани мітохондрій. Зміни конформації передаються на АТФ-синтазу, що призводить до її активації.

 

Основні постулати теорії Мітчелла:

1) внутрішня мембрана мітохондрій непроникна для іонів та малих молекул (за винятком молекул води);

2) дихальний ланцюг працює як «помпа», що викачує протони з матриксу в міжмембранний простір – рух 2 електронів від субстрату на кисень призводить до перенесення 8-10 Н+ (протони транспортуються через I, III та IV комплекси) через мембрану;

3) робота дихального ланцюга створює електрохімічний градієнт протонів (∆μН+), оскільки вони вільно через внутрішню мітохондріальну мембрану повернутися в матрикс не можуть і будуть накопичуватись у міжмембранному просторі; ∆μН+ - це проміжна форма зберігання енергії окиснення субстратів;

4) енергію протонного градієнта використовує Н+-АТФ- синтаза (V комплекс) для синтезу АТФ, коли через одну з її субодиниць протони повертаються в матрикс;

5) існують сполуки - роз’єднувачі окисного фосфорилювання, які порушують електрохімічний градієнт протонів і знижують ефективність роботи Н+-АТФ-синтази.

На рис 18 наведена структура протонної АТФ-синтази+-АТФ-синтази, Н+-АТФ-аза), яка безпосередньо використовує енергію протонного градієнта, що був створений дихальним ланцюгом, для синтезу АТФ.

 

 

Рис. 18. Структура Н+-АТФ-синтази

 

Протонна АТФ-синтаза – це олігомерний білок, який вмонтований у внутрішню мембрану мітохондрії і за будовою нагадує гриб. Вона містить дві субодиниці:

Foпротонний канал (о - від «олігоміцин»); лише через цей канал протони можуть повернутися в матрикс;

F1 – фермент, який використовує енергію, що вивільняється при транспорті протонів через Fo  для синтезу АТФ з АДФ та Фн.

         П. Мітчелл у своїй теорії теоретично віддав функцію спряження окиснення та фосфорилювання саме Н+-АТФ-азі (рис. 19).

 

 

Рис. 19. Спряження роботи дихального ланцюга  із синтезом АТФ (за теорією П.Мітчелла)

 

На сьогодні відомо, що при транспорті протонів через Fo-субодиницю відбуваються конфірмаційні зміни в активному центрі F1-субодиниці, які призводять до її активації і відповідно до синтезу АТФ та її вивільнення. Молекули АТФ, що синтезуються, транспортуються у цитозоль за допомогою транслокази.

Для синтезу молекули АТФ, її вивільнення та транспорту у цитозоль потрібна енергія 4 протонів (40% цієї енергії іде на синтез АТФ, 60% виділяється у вигляді тепла). Кількість молекул неорганічного фосфату, яке перейшло у зв’язану форму (тобто у АТФ) у перерахунку на один атом кисню має назву коефіцієнт окисного фосфорилювання і позначається Р/O (коефіцієнт фосфорилювання).

Коефіцієнт Р/O чисельно дорівнює кількості молекул АТФ, що синтезувалися в результаті транспорту 2 ē на один атом кисню. Тому для субстратів, що окислюються під дією НАД-залежних дегідрогеназ Р/O=3 (наприклад, для пірувату, α-кетоглутарату, ізоцитрату, малату). Для субстратів, які окислюються за допомогою ФАД-залежних дегідрогеназ, цей коефіцієнт дорівнює 2 (наприклад, для сукцинату, ацил-КоА, гліцерил-3-фосфату).

Згідно з цією теорі­єю, перенесення елек­тро­­нів по дихальному ланцюгу су­про­во­­джу­ється вика­чу­ван­ням протонів із ма­т­риксу через внут­ріш­­ню мембрану у водне середовище між­мем­бран­ного простору (рис. 20).

 

 

Рис. 20. Схема орієнтованого розташування оксидно-відновних петель, які забезпечують перекачування протонів із матриксу в міжмембранний простір в дихальному ланцюгу

 

Припускають, що асиметрично розміщені в мембрані компоненти дихального ланцюга утво­­­рюють три петлі, які пере­носять через мембрану протони, тобто служать протонними пом­­пами. З кожною парою елек­тронів, що передаються від субстрату до кисню, ці три петлі транспортують із матриксу мітохондрій шість протонів (за новими даними, не менше 9). Таким чином, енергія, яка виділяється при перенесенні електронів, затрача­ється на перекачування іонів Н+ проти градієнта концентрації. Внаслідок викачування іонів Н+ із матриксу внутріш­ній бік внутрішньої мембрани мітохондрій стає електронегативним, а зовнішній – елек­тропозитивним, тобто вини­кає градієнт концентрації іонів водню: їх менше в матриксі й більше – в зовнішній водній фазі. Сумарний електрохімічний протонний потенціал позначається ∆μН+. Він складається із 2-х компонентів: ∆μН=∆рН і ∆V (рис. 21).

 

 

Рис. 21.  Дві складові електрохімічного протонного градієнта, що виникають  на внутрішній мітохондріальній мембрані

 

Внутрішня мембрана мітохондрій непроникна для іонів Н+, а також іонів ОН-, К+, Nа+, СI-, але мембранний білок Fo АТФази утворює канал, по якому іони Н+ повертаються в матрикс за градієнтом концентрації, вільна енергія, яка при цьому виділяється, використовується F1-компонентом АТФази для синтезу АТФ з АДФ і Фн.

Таким чином, згідно з хемі­осмотичною ­теорією, перенесення електронів по дихальному ланцюгу створює градієнт концентраціїї іонів Н+, який служить рушійною силою синтезу АТФ. Специфічний білок-переносник, аденіннуклеотид-транслоказа переносить новосинтезований АТФ із матриксу в цитоплазму в обмін на АДФ. Ця сама транспортна система переносить у матрикс мітохондрій фосфат.

 

Дихальний  контроль – це співвідношення АТФ/АДФ:  При його зменшенні підвищується інтенсивність дихання. Процес синтезу АТФ залежить від енергетичного статусу клітини, який, у свою чергу знаходить своє вираження у кількісному співвідношенні АТФ/АДФ. При зростанні потреб клітини в енергії підвищується концентрація АДФ і значення цього співвідношеня знижується. Це супроводжується активацією тканинного дихання і, відповідно, окисного фосфорилювання.

Процес залежності дихання клітин від вмісту аденілових нуклеотидів був вивчений in vitro. Результати дослідження показали, що за наявності в середовищі всіх компонентів, за винятком АДФ, поглинання кисню клітиною не відбувається. Внесення в інкубаційну суміш АДФ стимулює дихання, активність якого знижується при зростанні концентрації АТФ. Швидкість дихання знижується до нуля, коли вся АДФ перетворюється в АТФ. Тому залежність роботи дихального ланцюга від  співвідношення АТФ/АДФ отримала назву дихальний контроль. Механізм дихального контролю відрізняється високою точністю і швидко реагує навіть на невеликі зміни концентрацій АТФ та АДФ. Незначне підвищення концентрації АДФ призводить до активації дихання та фосфорилювання.          Зниження синтезу АТФ призводить до розвитку гіпоенергетичного стану в організмі.

Синтез АТФ знижується при:

1) гіпоксії;

2) голодуванні, дефіциті деяких вітамінів (В1, В2, РР) та мінералів (Fe, Cu);

3) наявності інгібіторів дихального ланцюга та інгібіторів окисного фосфорилювання;

4) наявності роз’єднувачів окиснення та фосфорилювання.

 

Інгібітори та роз’єднувачі окисного фосфорилювання

 

                Робота протонної АТФ-синтази може бути порушена за наявності в клітині сполук – роз’єднувачів окисного фосфорилювання. Так, наприклад, олігоміцин пригнічує роботу Fo субодиниці і, таким чином, робить неможливим використання енергії протонного градієнта для синтезу АТФ.

Роз»єднувачі – це сполуки ліпофільні, легко дифундують через внутрішню мембрану мітохондрій, можуть зв’язувати протони та переносити їх у матрикс за градієнтом концентрацій Н+ (тому вони належать до сполук протонофорів).

У разі наявності в клітині роз’єднувача окиснення субстратів відбувається дуже активно, дихальний ланцюг мітохондрій працює і намагається створити електрохімічний градієнт протонів, але цього не відбувається. Пояснення в тому, що молекули роз’єднувача захоплюють протони з міжмембранного простору і транспортують їх у матрикс. За таких умов окиснення субстратів не приводить до створення протонного градієнта і, відповідно, до синтезу АТФ. Енергія окиснення перетворюється в теплову енергію, тобто коефіцієнт окисного фосфорилювання знижується і спостерігається виділення тепла (пірогенна дія).

Прикладом роз’єднувача служить 2,4-динітрофенол. Механізм токсичної дії 2,4-динітрофенолу полягає у блокуванні окиснювального фосфорилювання, що викликає утворення енергії шляхом гліколізу з використанням значної кількості кисню. Оскільки вказана енергія не накопичується в макроенергічних сполуках фосфору, вона виділяється у вигляді тепла, викликаючи гіпертермію.

Крім 2,4-динітрофенолу до синтетичних роз’єднувачів потрібно віднести деякі похідні вітаміну К, анестетики, антибіотики валіноміцин та граміцидин, ацетилсаліцилову кислоту, гербіциди. До природних роз’єднувачів належать продукти перикисного окиснення ліпідів, довголанцюгові жирні кислоти, великі дози териоїдних гормонів.

До активаторів відносяться: глюкоза, фруктоза, амінокислоти, кислоти циклу Кребса (лимонна, яблучна, янтарна), різні поживні суміші, наприклад препарати гідролізатів білків (гідролізат казеїну). Вони поліпшують енергетичний обмін у тканинах організму, залучаючись до окиснювально-відновних реакцій мітохондрій, і тому знайшли застосування в медичній практиці.

Третя група інгібіторів дихання (ціаніди (NaCN, KCN), азиди (NaN3), оксид вуглецю (II) та ін.) блокують цитохромоксидазу й унеможливлюють сам процес дихання. Ці речовини викликають кисневе голодування для дихального ланцюга мітохондрій, хоча кисень наявний у великій кількості (блокується процес перекидання електронів на кисень). Тому вимикається утворення протонного потенціалу й поєднане з ним фосфорилювання - припиняється життєдіяльність клітин. Перелічені інгібітори цитохромоксидази є найсильнішими отрутами, отруєння якими викликає швидку загибель організму.

Розглянутий вище різновид біологічного окиснення, при якому кисень використовується на утворення води та вироблення енергії в дихальному ланцюзі, називається оксидазним, або енергозабезпечувальним. На нього припадає 80-90 % спожитого кисню. Крім цього, існує ще кілька видів реакцій, які відбуваються із споживанням кисню. Вклад їх у загальне споживання кисню організмом порівняно невеликий (приблизно 10 %), але значення важливе. У більшості реакцій атоми кисню безпосередньо включаються в молекулу субстрату з утворенням гідроксильної групи, рідше – карбоксильної й інших кисневмісних груп. Ці реакції зустрічаються на різних шляхах синтезу і розпаду, особливо в метаболізмі ароматичних і стероїдних сполук, простагландинів і лейкотрієнів. Крім того, реакції окиснення мають значення для метаболізму лікарських препаратів, знешкодження сторонніх речовин.