МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕПЛИКАЦИИ ДНК. ТРАНСКРИПЦИЯ - БИОСИНТЕЗ РНК. БИОСИНТЕЗ БЕЛКА В РИБОСОМАХ. ЭТАПЫ И МЕХАНИЗМ ТРАНСЛЯЦИИ, РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ. АНТИБИОТИКИ - ИНГИБИТОРЫ ТРАНСКРИПЦИИ И ТРАНСЛЯЦИИ

СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Нуклеиновые кислоты составляют существенную небелковую часть сложного класса органических веществ, получивших название нуклеопротеинов; последние являются основой наследственного аппарата клетки хромосом. Белковые компоненты нуклеопротеинов подвергаются многообразным превращениям, аналогичным метаболизму белков и продуктов их распада – аминокислот. О нуклеиновых кислотах, их структуре и функциях в живых организмах в последнее время накоплен огромный фактический материал, подробно рассмотренный в ряде специальных руководств и монографий. Помимо уникальной роли нуклеиновых кислот в хранении и реализации наследственной информации, промежуточные продукты их обмена, в частности моно-, ди- и трифосфатнуклеозиды, выполняют важные регуляторные функции, контролируя биоэнергетику клетки и скорость метаболических процессов. В то же время нуклеиновые кислоты не являются незаменимыми пищевыми факторами и не играют существенной роли в качестве энергетического материала. Далее детально рассматриваются (помимо краткого изложения вопросов переваривания) проблемы метаболизма нуклеиновых кислот и их производных, в частности пути биосинтеза и распада пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, современные представления о биогенезе ДНК и РНК и их роли в синтезе белка.

Нуклеиновые кислоты представляют линейные полимеры нуклеозидмонофосфатов, то есть полинуклеотиды. Нуклеотиды построены из трех компонентов: пиримидинового или пуринового основания, пентозы и фосфорной кислоты. Нуклеотиды связаны между собой в цепь фосфодиэфирной связью. Она образуется за счет этерификации ОН — группы С—З- пентозы одного нуклеотида и ОН — группы фосфатного остатка другого нуклеотида. В результате один из концов полинуклеотидной цепи заканчивается свободным фосфатом (Р—конец или5-—конец). На другом конце цепи имеется неэтерифицированная ОН — группа у С—З- пентозы (З- — конец).

 

 

Типичный нуклеотид (АМР)

 

СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Нуклеиновые кислоты - это высокомолекулярные соединения, состоящие из мономерных единиц - нуклеотидов, и поэтому их также называют полинуклеотидами

Каждый нуклеотид содержит три различных компонента: азотистое основание (пуриновых или пиримидиновых) пентозу и фосфорную кислоту (рис. 1.)

Рис. 1. Структура аденозинмононуклеотида

Главные азотистые основания - компоненты нуклеиновых кислот: пуриновые - аденин (А) и гуанин (Г), пиримидиновые - урацил (У), цитозин (Ц), тимин (Т) (рис. 2).

Рис. 2. Стоение азотистых оснований.

 

Кроме указанных выше основных пяти азотистых оснований ( двух пуриновых и трех пиримидиновых ) , в состав некоторых нуклеиновых кислот входят в относительно незначительных количествах дополнительные ( минорные ) азотистые основания и соответствующие им минорные нуклеотиды. Наибольшее количество минорных нуклеотидов встречается в молекулах транспортных РНК ( тРНК) - до 5 % общего нуклеотидного состава. К минорным нуклеотидам относятся метилированные производные обычных азотистых оснований, в частности, 1 - метиладенин, 2 - метиладенин, 6- диметиладенин, 1 - метилгуанин, 7- метилгуанин, 1 - метилурацил, 5- оксиметилурацил, 3 - метилцитозин т.п. ДНК человека содержат значительное количество 5- метилцитозину, информационные РНК - N - метилированных производные аденина и гуанина. Нуклеотидом необычной структуры , входящей в состав тРНК , является псевдоуридин - нуклеотид ( рис. 3 ), в котором рибоза присоединена к урацила в 5 - м положении , то есть не азот- карбоновым , а карбон- карбоновым связью. Такие основы в молекулах нуклеиновых килоты во многих случаях являются специфическими сигналами, которые играют важную роль в реализации генетической информации или обеспечении ее хранения. Биологические функции минорных нуклеотидов до конца не выяснены.

Рис. 3. Строение псевдоуридина.

Нуклеотиды в составе ДНК содержат углевод D-2-дезоксирибозу, а в РНК - D-рибозу (рис. 4). Обе пентозы находятся в Р-фуранозных форме:

Рис. 4. Строение пентоз: 1 - D-рибоза, 2 - D-2-дезоксирибоза.

Атомы углерода в пентозах нумеруются цифрами со штрихом, чтобы отличить их от атомов углерода в азотистых основаниях. При соединении рибозы или дезоксирибозы с азотистой основой образуется нуклеозид (рис. 5)

Рис. 5. Структура нуклеозида.

Связь между пентозой и азотистой основой идет от первого атома углерода пентозы к первому атому азота пиримидина или девятого атома азота пурина. Связь называется гликозидной. Нуклеотиды - это фосфорные эфиры нуклеозидов. Связь образуется за счет взаимодействия фосфата с гидроксилом в положении С-5 'пентозы. При гидролизе нуклеиновых кислот могут образовываться и нуклеозид-3'-монофосфата (рис. 6).  

Рис. 6. Структура нуклеозид-3'-монофосфата.

В зависимости от строения пентозы, нуклеотиды делятся на рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотидов. Наличие остатков фосфорной кислоты в составе нуклеотидов придает им кислотных влативостей, поэтому их считают кислотами, как и полимеры - нуклеиновые кислоты.

Далее приведена номенклатура нуклеозидов и нуклеотидов и формулы четырех главных дезоксирибонуклеотидов (структурных единиц ДНК) (рис. 7) и четырех главных рибонуклеотидов (структурных единиц РНК) (рис. 8).

Рис. 7. Строение дезоксирибонуклеотидов

 

Рис. 8. Строение рибонуклеотидов.

В организме, кроме нуклеозидмонофосфатов, находятся нуклеозиддифосфаты и нуклеозидтрифосфат. В синтезе нуклеиновых кислот участвуют именно нуклеозидтрифосфат (рис. 9).

Рис. 9. Строение аденозинтрифосфата.

Система АТФ-АДФ-АМФ играет особую роль в биоэнергетике, во всех живых организмах АТФ выступает как депо для хранения и переноса энергии. Аналогично АТФ, другие нуклеозидтрифосфат также содержат два высокоэнергетические связи между фосфатными остатками и используются в обмене веществ.

Например, ЦТФ имеет отношение к биосинтезу фосфолипидов. УТФ используется для синтеза и взаимопревращений различных углеводов, ГТФ необходим для синтеза белков. В состав коферментов НАД, НАДФ, ФАД, КоА, ФАФС входят адениловые нуклеотиды. Отдельную группу составляют циклические нуклеотиды, в которых фосфатный остаток образует сложноэфирные связи с 3'-и 5'-гидроксильными группами рибозы (рис. 10):

Рис. 10. Строение циклических нуклеотидов.

Циклические аденозинмонофосфат (цАМФ) и гуанозинмонофосфат (цГМФ) играют очень важную роль в обмене веществ, через них реализуется регуляторная роль ряда гормонов. цАМФ и цГМФ образуются из АТФ и ГТФ под действием ферментов аденилатциклазы и гуанилатциклазы.

Отщепление пирофосфата от нуклеозидтрифосфат приводит к замыканию шестичленного кольца. При расщеплении циклических нуклеотидов под действием фосфодиэстеразы образуются соответствующие нециклические нуклеотиды - нуклеозид-5'-монофосфата.

Нуклеопротеиды

Нуклеопротеиды - сложные белки, комплексы нуклеиновых кислот с белками. В зависимости от типа нуклеиновой кислоты, нуклеопротеиды делятся на дезоксирибонуклеопротеины и рибонуклеопротеины. Устойчивость нуклеопротеинових комплексов обеспечивается ковалентным взаимодействием. Примером специфического взаимодействия могут служить нуклеопротеиды комплексы рРНК - субъединицы рибосом; неспецифическая электростатическое взаимодействие характерно для хромосомных комплексов ДНК - хроматина с гистонами и комплексов ДНК-протамины головок сперматозоидов некоторых животных. Нуклеопротеиды диссоциируют на белки и нуклеиновые кислоты при действии агентов, разрушающих или ослабляют Нековалентные связи: 1) повышенные концентрации солей или мочевины, увеличивающие ионную силу раствора; 2) ионогенные поверхностно-активные вещества; 3) некоторые полярные органические соединения (формамид и диметилформамид, фенол и др.). При образовании нуклеопротеинов происходят существенные конформационные изменения нуклеиновых кислот и, в некоторых случаях, белков, образующих нуклеопротеиновий комплекс. Эти изменения существенные в случае образования дезоксирибонуклеопротеїнів. В отличие от одноцепочечной РНК, способной образовывать вторичные и третичные структуры за счет антипараллельная комплементарного спаривания смежных отрезков цепи, двухцепочечная ДНК такой возможности не имеет, по сравнению с компактными глобулами РНК. Однако взаимодействие ДНК с белками (гистонами и протамин) за счет электростатического взаимодействия приводит к образованию значительно плотнее упакованных нуклеопротеинових комплексов - хроматина, обеспечивает компактное хранение ДНК и, соответственно, наследственной информации в составе хромосом эукариот. С другой стороны, большая конформационная подвижность РНК и ее каталитические свойства связаны с большим разнообразием рибонуклеопротеинив, выполняющих различные функции.

Дезоксирибонуклеопротеины

Хроматин - комплекс ДНК с гистонами в клетках эукариот. За счет электростатического взаимодействия нить ДНК осуществляет двойной оборот вокруг октамера гистонного комплекса H2a, H2b, H3 и H4, образуя нуклеосомы, соединенные нитью ДНК. При присоединении к комплексу гистона H1 шесть нуклеосом образуют кольцеобразный комплекс, в результате происходит конденсация хроматина с образованием фибриллярные структуры, которая далее при присоединении топоизомеразы II и ряда вспомогательных белков способна конденсироваться в гетерохроматине. ДНК, связанная в таком нуклеопротеиновому комплексе, НЕ транскрибируется. Отдельным важным классом дезоксирибонуклеопротеїнів являются вирусные нуклеопротеиды.

Рибонуклеопротеины

В клетках в основном содержатся следующие типы рибонуклеопротеинов (ГНП): 1) нуклеопротеиды комплексы рибосомных РНП (рРНП) - субъединицы рибосом - органелл, на которых происходит трансляция мРНК. Рибосомы являются агрегатами с двух разных рРНП-субъединиц. 2) Малые ядерные рибонуклеопротеины (мяРНП) - нуклеопротеиды комплексы малых ядерных РНК. 3) нуклеопротеиды комплексы мРНК - матричные рибонуклеопротеины (МРНП).

Переваривание нуклеопротеинов и всасывание продуктов их распада осуществляются в пищеварительном тракте. Под влиянием ферментов желудка, частично соляной кислоты, нуклеопротеины пищи распадаются на полипептиды и нуклеиновые кислоты; первые в кишечнике подвергаются гидролитическому расщеплению до свободных аминокислот. Распад нуклеиновых кислот происходит в тонкой кишке в основном гидролитическим путем под действием ДНК- и РНКазы панкреатического сока. Продуктами реакции при действии РНКазы являются пуриновые и пи-римидиновые мононуклеотиды, смесь ди- и тринуклеотидов и резистентные к действию РНКазы олигонуклеотиды. В результате действия ДНКазы образуются в основном динуклеотиды, олигонуклеотиды и небольшое количество мононуклеотидов. Полный гидролиз нуклеиновых кислот до стадии мононуклеотидов осуществляется, очевидно, другими, менее изученными ферментами (фосфодиэстеразами) слизистой оболочки кишечника. В отношении дальнейшей судьбы мононуклеотидов существует два предположения. Считают, что мононуклеотиды в кишечнике под действием неспецифических фосфатаз (кислой и щелочной), которые гидролизируют фосфоэфирную связь мононуклеотида («нуклеотидазное» действие), расщепляются с образованием нуклеозидов и фосфорной кислоты и в таком виде всасываются. Согласно второму предположению, мононуклеотиды всасываются, а распад их происходит в клетках слизистой оболочки кишечника. Имеются также доказательства существования в стенке кишечника нуклеотидаз, катализирующих гидролитический распад мононуклеотидов. Дальнейший распад образовавшихся нуклеозидов осуществляется внутри клеток слизистой оболочки преимущественно фосфоролитическим, а не гидролитическим путем. Всасываются преимущественно нуклеозиды, и в таком виде часть азотистых оснований может быть использована для синтеза нуклеиновых кислот организма. Если происходит дальнейший распад нуклеозидов до свободных пуриновых и пиримидиновых оснований, то гуанин не используется для синтетических целей. Другие основания, как показывают опыты с меченными по азоту аденином и урацилом, в тканях могут включаться в состав нуклеиновых кислот. Однако экспериментальные данные свидетельствуют, что биосинтез азотистых оснований, входящих в состав нуклеиновых кислот органов и тканей, протекает преимущественно, если не целиком, de novo из низкомолекулярных азотистых и безазотистых предшественников. Таким образом, синтез нуклеиновых кислот, мономерными единицами которых являются мононуклеотиды, будет определяться скоростью синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов; синтез последних в свою очередь зависит от наличия всех составляющих из трех компонентов. Источником рибозы и дезоксирибозы служат продукты превращения глюкозы в пентозофосфатном цикле. Пока не получены доказательства существенной роли пищевых пентоз в синтезе нуклеиновых кислот. Фосфорная кислота также не является лимитирующим фактором, поскольку она поступает в достаточном количестве с пищей. Следовательно, биосинтез нуклеиновых кислот начинается с синтеза азотистых оснований (точнее, мономерных молекул – мононуклеотидов).

Денатурация и ренатурация ДНК

Гибридизация ДНК

 

 

Вторичная структура ДНК стабилизируется лишь слабыми водородными и гидрофобными связями, следовательно, ДНК способна к денатурации (плавлению) при повышении температуры до 80—90^о и ренатурации при последующем охлаждении.

 

Денатурация и ренатурация ДНК

 

При денатурации двухспиральная молекула ДНК разделяется на отдельные цепи. Температура, при которой 50% ДНК денатурировано, называется температурой плавления и зависит от качественного состава ДНК. Так как пары Г—Ц стабилизированы тремя водородными связями, а пары А—Т только двумя, то чем выше доля Г—Ц пар, тем стабильнее молекула. При денатурации ДНК поглощение света при длине волны 260 нм повышается (гиперхромный эффект), что позволяет легко контролировать состояние вторичной структуры ДНК.

 

Структура ДНК

Строение ДНК: А — фрагмент нити ДНК, образованной чередующимися остатками дезоксирибозы и фосфорной кислоты. К первому углеродному атому дезоксирибозы присоединено азотистое основание: 1 — цитозин; 2 — гуанин; Б — двойная спираль ДНК: Д — дезоксирибоза; Ф — фосфат; А — аденин; Т — тимин; Г — гуанин; Ц — цитозин

 

Если раствор денатурированной ДНК медленно охлаждать, то вновь возникают слабые связи между комплементарными цепями и может получиться спиральная структура, идентичная исходной (нативной). На способности ДНК к денатурации и ренатурации основан метод молекулярной гибридизации, который применяют для изучения строения нуклеиновых кислот. Препараты ДНК, выделенные из особей, принадлежащих к разным видам, образуют несовершенные гибриды. Спиральная структура получается не по всей длине молекулы. В неспирализированных участках полинуклеотидные цепи не комплементарны друг другу. Следовательно, ДНК особей неидентична.

 

Структура дезоксирибонуклеиновой кислоты, ДНК.

Один полный оборот спирали включает десять пар оснований (пуриновое - пиримидиновое). Расстояние между соседними парами оснований равняется 0,34 нм

 

Биосинтез нуклеиновых кислот

  Проблема биосинтеза нуклеиновых кислот является предметом пристального внимания многих исследователей и целых научных коллективов. Следует прежде всего отметить исключительную трудность решения этой важнейшей проблемы, связанную с неполными представлениями о природе белковых факторов и механизмах регуляции синтеза нуклеиновых кислот. До сих пор не раскрыты в деталях молекулярные механизмы передачи генетической информации, закодированной в нуклеотидной последовательности ДНК. Различают три основных этапа реализации генетической информации.

На первом этапе – этапе репликации происходит образование дочерних молекул ДНК, первичная структура которых идентична родительской ДНК (копирование ДНК). Репликация ДНК является ключевой функцией делящейся клетки и частью таких биологических процессов, как рекомбинация, транспозиция и репарация.

http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0

http://www.youtube.com/watch?v=-mtLXpgjHL0&feature=related

На втором этапе, названном транскрипцией, генетическая информация, записанная в первичной структуре ДНК, переписывается в нуклеотидную последовательность РНК (синтез молекулы РНК на матрице ДНК).

Специальный фермент полимераза подбирает по принципу комплементарности нуклеотиды и соединяет их в единую цепочку. Если в нити ДНК стоит Тимин, то полимераза включает в цепь и-РНК Аденин, если стоит Гуанин - включает Цитозин, если Аденин - то включает Урацил (в РНК нет Тимина). По длине каждая из молекул и-РНК короче ДНК в сотни раз, т.к. она переписывает только некоторые участки цепи ( гены), необходимые для выполнения одной функции.

 

http://www.youtube.com/watch?v=ztPkv7wc3yU

На третьем этапе – этапе трансляции генетическая информация, содержащаяся уже в нуклеотидной последовательности молекулы РНК, переводится в аминокислотную последовательность белка. Далее представлены основные итоги исследований и наши представления о биосинтезе полимерных молекул ДНК, РНК и белка, полученные к середине 1996 г.

Инициация. 1. Узнавание стартового кодона (AUG), сопровождается присоединением тРНК аминоацилированной метионином (М) и сборкой рибосомы из большой и малой субъединиц.

Элонгация. 2. Узнавание текущего кодона соответствующей ему аминоацил-тРНК (комплементарное взаимодействие кодона мРНК и антикодона тРНК увеличено). 3. Присоединение аминокислоты, принесённой тРНК, к концу растущей полипептидной цепи. 4. Продвижение рибосомы вдоль матрицы, сопровождающееся высвобождением молекулы тРНК. 5. Аминоацилирование высвободившейся молекулы тРНК соответствующей ей аминоацил-тРНК-синтетазой. 6. Присоединение следующей молекулы аминоацил-тРНК, аналогично стадии (2). 7. Движение рибосомы по молекуле мРНК до стоп-кодона (в данном случае UAG).
 Терминация. Узнавание рибосомой стоп-кодона сопровождается (8) отсоединением новосинтезированного белка и в некоторых случаях (9) диссоциацией рибосомы.

http://www.youtube.com/watch?v=5bLEDd-PSTQ

http://www.youtube.com/watch?v=-zb6r1MMTkc&feature=related

Биосинтез ДНК

 Прежде чем изложить современные представления о механизме биосинтеза ДНК, следует представить сведения о синтезе этого соединения в бесклеточной системе, которыми располагает биохимия. Известно, что для любого синтеза полимерной органической молекулы, осуществляемого in vitro или in vivo, требуется энергия. Источником энергии в реакциях полимеризации мононуклеотидов является энергия, освобождаемая всеми четырьмя типами дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, участвующих в синтезе ДНК. Образующийся пирофосфат под действием пирофосфатазы также расщепляется на две молекулы ортофосфата, давая дополнительную энергию для биосинтеза ДНК.

Помимо энергии, биогенез ДНК требует наличия специфических ферментов, катализирующих отдельные этапы синтеза, и множества белковых факторов, абсолютно необходимых для регулирования процесса репликации и проявления каталитической активности ферментов.

http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0

Ферментные системы синтеза ДНК у про- и эукариот до конца не выяснены. По имеющимся данным, в репликации ДНК, включающей узнавание точки начала процесса, расплетение родительских цепей ДНК в репликационной вилке, инициацию биосинтеза дочерних цепей и дальнейшую их элонгацию и, наконец, окончание (терминация) процесса, участвует более 40 ферментов и белковых факторов, объединенных в единую ДНК-репликазную систему, называемую реплисомой.

По цепочке ДНК, например, "ездит" фермент ДНК-полимераза, копирующий молекулы ДНК. Ученые пытаются искусственно создавать подобные структуры, однако до сих пор ни одна из них не смогла сравниться с естественным аналогами. Авторы исследования утверждают, что по многим характеристикам их "молекулярная машина" превосходит остальные. Однако новая разработка может запутываться при ходьбе. Сейчас создатели работают над преодолением этой трудности.

http://www.youtube.com/watch?v=qn-JW-M89fo&feature=related

После открытия в 1958 г. А. Корнбергом у Е. coli фермента, катализирующего биосинтез ДНК и названного ДНК-полимеразой I, в течение почти 10 лет считалось, что этот фермент является единственной по-лимеразой, принимающей участие в репликации ДНК in vitro. Однако позже был открыт мутант Е. coli, лишенный ДНК-полимеразы I, но способный синтезировать ДНК с нормальной скоростью. Оказалось, что для репликации ДНК Е. coli необходимо участие нескольких ферментов. ДНК-полимераза I не наделена способностью инициировать синтез цепей ДНК de novo. Одним из хорошо изученных ферментов, участвующих в стадии инициации репликации ДНК, является специфическая клеточная РНК-полимераза, названная праймазой, которая катализирует синтез короткого олигорибонуклеотида (от 10 до 60 нуклеотидов), т.е. праймера, с которого затем начинается синтез ДНК.

РНК-полимераза осуществляет синтез тРНК

     Праймазы различаются как по структуре, так и по специфичности действия. Получены новые данные о существенной роли праймасомы в каталитическом действии фермента. Праймасома представлена ансамблем из 7 различных субъединиц, включающих около 20 полипептидов общей мол. массой 70000. При помощи белка n' праймасома подвергается быстрому перемещению к отстающей цепи ДНК за счет энергии, генерируемой АТФазной активностью белка n'. В состав праймасомы входит также комплекс белков dna В и dna С, который вблизи репликационной вилки периодически участвует в формировании специфической вторичной структуры ДНК, подходящей для узнавания праймазой.

Основным ферментом, катализирующим биосинтез новообразованной ДНК (точнее, стадию элонгации репликации ДНК), является ДНК-полимераза III, представляющая собой мультимерный комплекс собственно ДНК-полимеразы (мол. масса около 900000) и ряда других белков. ДНК-полимераза III из Е. coli состоит минимум из 10 субъединиц. Одна из них – β-субъединица получена в кристаллическом виде, и выяснена ее третичная структура. Имеются доказательства, что в димерной форме ДНК-полимераза III катализирует сопряженный синтез ведущей (лидирующей) и отстающей цепей ДНК при репликации (см. далее). Более точно выяснена также роль ДНК-полимеразы I: она катализирует отщепление затравочного олигорибонуклеотидного праймера и заполнение образующихся после этого пробелов (ниш) дезоксирибонуклеотидами. Известно, что ДНК-полимеразы II из Е. coli (мол. масса 88000) выполняет «ремонтные» функции, исправляя повреждения цепей ДНК. Укажем также, что ДНК-полимераза I в качестве матрицы использует одноцепочечные участки, в то время как ДНК-полимераза III – двухцепочечные ДНК, в которых имеются короткие одноцепочечные последовательности.

Важную функцию соединения двух цепей ДНК или замыкания двух концов одной цепи ДНК в процессе репликации либо репарации ДНК выполняет особый фермент – ДНК - лигаза, катализирующая за счет энергии АТФ образование фосфодиэфирной связи между 3'-ОН-группой де-зоксирибозы одной цепи и 5'-фосфатной группой другой цепи ДНК. Функцию раскручивания (расплетения) двойной спирали ДНК в репли-кационной вилке, происходящего за счет энергии гидролиза АТФ

 

Расщепление молекул ДНК рестриктазой BamHI и соединение полученных фрагментов ДНК-лигазой.

Выполняет специфический rep-белок, названный хеликазой (мол. масса 300000). Образовавшиеся на определенное время одноцепочечные участки ДНК служат в качестве матрицы при репликации и стабилизируются при помощи особых белков, связывающихся с одноцепочечной ДНК (ДНК-связывающие белки) и препятствующих обратному комплементарному взаимодействию цепей ДНК (мол. масса 75600). В связи с этим их иногда называют дестабилизирующими двойную спираль белками. Имеются, кроме того, особые ферменты топоизомеразы (у прокариот одна из них названа ДНК-гиразой), которые играют особую роль в сверхспирализации, обеспечивая как репликацию, так и транскрипцию ДНК. Эти ферменты наделены способностью не только создавать супервитки, но и уничтожать суперспирализацию путем сшивания образующихся разрывов или разрезания ДНК. Наконец, открыты специальные ферменты

, «редактирующие» ДНК, т.е. осуществляющие вырезание и удаление ошибочно включенных нуклеотидов или репарирующие повреждения ДНК, вызванные физическими или химическими факторами (рентгеновское излучение, УФ-лучи, химический мутагенез и др.). Из клеток животных выделено несколько ДНК-полимераз, и в разных лабораториях они получили различные наименования. К настоящему времени у эукариот, как и у бактерий, открыто несколько ДНК-полимераз. В репликации ДНК эукариот участвуют два главных типа полимераз – α и δ. Показано, что ДНК-полимераза α состоит из 4 субъединиц и является идентичной по структуре и свойствам во всех клетках млекопитающих, причем одна из субъединиц оказалась наделенной праймазной активностью. Самая крупная субъединица ДНК-полимеразы а (мол. масса 180000) катализирует реакцию полимеризации, преимущественно синтез отстающей цепи ДНК, являясь составной частью праймасомы. ДНК-полимераза δ состоит из 2 субъединиц и преимущественно катализирует синтез ведущей цепи ДНК. Открыта также ДНК-полимераза ε, которая в ряде случаев заменяет δ-фермент, в частности при репарации ДНК (исправление нарушений ДНК, вызванных ошибками репликации или повреждающими агентами). Следует отметить, что в эукариотических клетках открыты два белковых фактора репликации, обозначаемых RFA и RFC. Фактор репликации А выполняет функцию белка – связывание одноцепочечной ДНК (наподобие белковых факторов связывания разъединенных цепей ДНК при репликации у Е. coli), фактор С – функцию стабилизатора всего репликационного комплекса. В генетической инженерии с целью получения белков в достаточных количествах и с заданными свойствами (например, для генотерапии наследственных и соматических болезней) широкое применение получили эндо-нуклеазы рестриктазы, катализирующие расщепление молекулы двух-цепочечной ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям внутри цепи. Рестриктазы узнают определенные 4–7-членные последовательности, вызывая, таким образом, разрывы в определенных сайтах цепи ДНК. При этом образуются не случайные последовательности, а фрагменты ДНК строго определенной структуры с липкими концами (рекомбинантные ДНК), используемые далее для конструирования гибридных молекул и получения генно-инженерной, биотехнологической продукции (например, инсулина, гормона роста, интерферона, вакцин против вируса гепатита В, СПИДа и др.).

 

Реализация генетической информации во всех живых клетках осуществляется в два этапа: транскрипцию и трансляцию.

 

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД

Генетическая информация, содержащаяся в ДНК и в иРНК, заключена в последовательности расположения нуклеотидов в молекулах. Каким же образом иРНК кодирует (шифрует) первичную структуру белков, т. е. порядок расположения аминокислот в них? Суть кода заключается в том, что последовательность расположения нуклеотидов в иРНК определяет последовательность расположения аминокислот в белках. Этот код называют генетическим, его расшифровка - одно из великих достижений науки. Носителем генетической информации является ДНК, но так как непосредственное участие в синтезе белка принимает иРНК - копия одной из нитей ДНК, то генетический код записан на «языке» РНК.  Код триплетен. В состав РНК входят 4 нуклеотида: А, Г, Ц, У. Если бы мы попытались обозначить одну аминокислоту одним нуклеотидом, то можно было бы зашифровать лишь 4 аминокислоты, тогда как их 20 и все они используются в синтезе белков. Двухбуквенный код позволил бы зашифровать 16 аминокислот (из 4 нуклеотидов можно составить 16 различных комбинаций, в каждой из которых имеется 2 нуклеотида). В природе же существует трехбуквенный, или триплетный, код. Это означает, что каждая из 20 аминокислот зашифрована последовательностью 3 нуклеотидов, т. е. триплетом, который получил название кодон. Из 4 нуклеотидов можно создать 64 различные комбинации, по 3 нуклеотида в каждой (43=64). Этого с избытком хватает для кодирования 20 аминокислот и, казалось бы, 44 триплета являются лишними. Однако это не так. Почти каждая аминокислота шифруется более чем одним кодоном (от 2 до 6). Это видно из таблицы генетического кода.

 
 

Код однозначен. Каждый триплет шифрует только одну аминокислоту. У всех здоровых людей в гене, несущем информацию об одной из цепей гемоглобина, триплет ГАА или ГАГ, стоящий на шестом месте, кодирует глутаминовую кислоту. У больных серповидноклеточной анемией второй нуклеотид в этом триплете заменен на У. Как видно из таблицы генетического кода, триплеты ГУА или ГУГ, которые в этом случае образуются, кодируют аминокислоту валин.. Между генами имеются знаки препинания. Каждый ген кодирует одну полипептидную цепочку. Поскольку в ряде случаев иРНК является копией нескольких генов, они должны быть отделены друг от друга. Поэтому в генетическом коде существуют три специальные триплета (УАА, УАГ, УГА), каждый из которых обозначает прекращение синтеза одной полипептидной цепи. Таким образом эти триплеты выполняют функцию знаков препинания. Они находятся в конце каждого гена.

 

Генетический код триплетен

СВОЙСТВА ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА

1. Генетический код триплетен. Каждая аминокислота кодирует­ся группой из трех нуклеотидов.

 2. Вырожденность генетического кода. Одна аминокислота мо­жет кодироваться не одним, а несколькими определенными трип­летами нуклеотидов.

 3. Однозначность генетического кода. Каждому кодону соответ­ствует только одна аминокислота, т. е. триплет шифрует только одну аминокислоту.

  4. Неперекрываемость генетического кода. Процесс считыва­ния генетического кода не допускает возможности перекрыва­ния кодонов. Начавшись на определенном кодоне, считывание следующих идет без пропусков, т. е. внутри гена нет знаков пре­пинания. Например, при выпадении одного или двух нуклеоти­дов из цепи, при считывании образуется белок, не имеющий ничего общего с тем белком, который кодировался нормаль­ным геном.

 5. Универсальность генетического кода. Генетическая информация для всех организмов, обладающих разным уровнем организа­ции (от ромашки до человека), кодируется одинаково.

 6. Линейность генетического кода. Кодоны прочитываются последовательно в направлении закодированной записи от 5 ‘-конца к 3′-концу. «До научные» представления о передаваемых по наследству признаках у человека существовали уже в античные времена. Такие со­общения встречаются в трудах Гиппократа, Аристотеля, Платона и других древнегреческих врачей и философов. Примечателен тот факт, что они не только описывали случаи наследования отдельных при­знаков, но и предлагали теоретические объяснения и даже меры по улучшению человеческой природы. Например, Гиппократу принад­лежит теория пангенезиса, согласно которой семя производится всеми частями тела — больными и здоровыми и, соответственно, больное семя производит больные части тела, а здоровое — здо­ровые.

Транскрипция - биосинтез рибонуклеиновой кислоты (РНК) на матрице - дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК). Транскрипция - один из фундаментальных биологических процессов, первый этап реализации генетической информации, записанной в ДНК в виде линейной последовательности 4 типов мономерных звеньев - нуклеотидов. Она осуществляется специальными ферментами, работа которых определяется так называемыми транскрипционными факторами.

Ученые остановили свой исследовательский взгляд на проблеме транскрипции молекулы ДНК, т.е. на изучении механизмов переписывания информации с ДНК на молекулу РНК, с которой уже происходит синтез белков. Процесс этот начинается с "включения" энзима РНК-полимераза (RNAP). Этот энзим синтезирует новую цепочку РНК, химически "копируя" каждый нуклеотид ДНК. При этом он перемещается вниз по молекуле до конца определенного гена, оставляя за собой новую синтезированную копию РНК. "РНКп - один из самых важных в природе энзимов, - говорит Блок. - Поэтому понимание того, как происходит копирование ДНК, очень важно для молекулярной биологии, генной инженерии и медицины. Без РНК не было бы синтеза белков, а без него - жизни вообще".

Уже много лет известно, что РНК синтезируется постепенно - в одну единицу времени синтезируется один нуклеотид. Но остается открытым вопрос: как при этом перемещается вдоль молекулы ДНК энзим РНК-полимераза. То ли он скользит вдоль нуклеотидов, то ли перепрыгивает от одного к другому. Этот последний процесс был назван дискретным перемещением. Ученые приводят пример с чтением книги: когда глаза скользят по строке, то взгляд не останавливается на отдельных буквах, а "глотает" слова целиком, перепрыгивая от одного к другому.  Нуклеотиды А, Т, Г или Ц в молекуле ДНК разделены промежутком в 3.4 ангстрема, поэтому современные микроскопы с пределом разрешения в 10 ангстрем не могли помочь узнать, как происходит перемещение энзима. Работа по улучшению "оптического пинцета" микроскопа велась исследователями почти десятилетие.

В результате транскрипции образуется один из 4 типов РНК, выполняющих различные функции: 1) информационные, или матричные, РНК, выполняющие роль матриц при синтезе белка рибосомами (трансляция); 2) рибосомальные РНК, являющиеся структурными компонентами рибосом; 3) транспортные РНК, являющиеся основными элементами, осуществляющими при синтезе белка перекодирование информации, заключённой в информационной РНК, с языка нуклеотидов на язык аминокислот; 4) РНК, играющие роль затравки репликации ДНК. Число копий разных участков ДНК зависит от потребности клеток в соответственных белках и может меняться в зависимости от условий среды или в ходе развития организма.

КРАТКАЯ ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ мРНК

В начале 50-х годов Ф. Крик сформулировал свою знаменитую центральную догму молекулярной биологии, согласно которой генетическая информация от ДНК к белкам передается через РНК по схеме ДНК РНК белок. Процесс синтеза РНК на матрице ДНК называется транскрипцией, процесс синтеза белка на матрице РНК - трансляцией. В 1956-1957 годах А.Н. Белозерский и А.С. Спирин показали, что при существенных различиях в нуклеотидном составе ДНК из разных организмов нуклеотидный состав суммарных РНК весьма сходен. На основании этих данных они пришли к сенсационному заключению о том, что суммарная РНК клетки не может выступать в качестве переносчика генетической информации от ДНК к белкам, поскольку не соответствует ей по своему составу. Вместе с тем они заметили, что при значительном изменении нуклеотидного состава ДНК при переходе от организма к организму наблюдается некоторый небольшой сдвиг нуклеотидного состава РНК в ту же сторону. Это позволило предположить существование минорной фракции РНК, которая полностью соответствует по своему нуклеотидному составу ДНК и которая может быть истинным переносчиком генетической информации от ДНК к белкам. Целенаправленный поиск такой РНК, предпринятый сразу в нескольких ведущих лабораториях мира, увенчался успехом в 1961 году. В том году С. Бреннер, Ф. Жакоб и М. Месельсон, с одной стороны, и Ф. Гро и Дж. Уотсон с сотрудниками - с другой, обнаружили ДНК-подобную РНК у бактерий. В течение последующих двух-трех лет аналогичная РНК была найдена в самых разных эукариотических организмах. Для ее обозначения был предложен термин "информационная, или матричная, РНК (мРНК)".

НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА мРНК

Рибосома в процессе синтеза белка.

По своим свойствам мРНК про- и эукариот существенно различаются. Бактериальные мРНК очень нестабильны. Период их полураспада составляет всего несколько минут. Эти мРНК обычно не претерпевают существенных модификаций после синтеза и могут начинать транслироваться в белок еще до полного завершения их транскрипции. Быстрое вовлечение в белковый синтез, с одной стороны, и нестабильность мРНК бактерий - с другой, обеспечивают оперативный контроль белкового синтеза на уровне транскрипции. Содержание мРНК в бактериальной клетке составляет всего 1-2% общего количества РНК в клетке.

Транскрипция и трансляция мРНК прокариот (а); транскрипция, процессинг и трансляция мРНК эукариот

Эукариотические мРНК довольно стабильны. Период их полураспада измеряется часами и даже сутками. Их транскрипция и трансляция пространственно разобщены. Транскрипция протекает в ядре, а трансляция - в цитоплазме (рис. ). Эукариотические мРНК синтезируются в виде предшественников и проходят в своем биогенезе стадию довольно сложного созревания, или процессинга. Процессинг включает в себя: 1) кэпирование 5'-конца, заключающееся в присоединении к этому концу мРНК так называемой шапочки (кэп

-структуры), 2) полиаденилирование 3'-конца и, наконец, 3) сплайсинг - вырезание протяженных внутренних участков мРНК, так называемых интронов, и ковалентное воссоединение оставшихся фрагментов (экзонов) через обычную фосфодиэфирную связь (подробнее см. в статье: Гвоздев В.А. Регуляция активности генов при созревании клеточных РНК. Все перечисленные стадии созревания происходят в клеточном ядре, и в цитоплазму поступают уже процессированные, зрелые мРНК. Транспорт мРНК из ядра в цитоплазму осуществляется через ядерные поры. Все стадии процессинга и транспорта - регулируемые процессы. Время от начала синтеза мРНК до ее выхода в цитоплазму составляет не менее десяти минут. Высокая стабильность мРНК и сравнительно длительное время от начала синтеза до выхода в цитоплазму делают невозможной оперативную регуляцию белкового синтеза на уровне транскрипции. В связи с этим в клетках эукариот существенно возрастает роль регуляции белкового синтеза на посттранскрипционном уровне, а эукариотические клетки содержат значительно больше мРНК, чем бактериальные. Часть таких мРНК может находиться в неактивном (репрессированном или маскированном) состоянии. мРНК прокариот очень часто являются полицистронными, то есть содержат информацию для нескольких полипептидных (белковых) цепей. Зрелые эукариотические мРНК, как правило, моноцистронны и кодируют только одну полипептидную цепь. Те части молекулы мРНК, в которых закодированы белки, называются транслируемыми областями. Однако помимо транслируемых областей в мРНК имеются достаточно протяженные последовательности, не кодирующие белок. Общая длина этих нетранслируемых областей порой может достигать или даже превышать длину транслируемых областей. Нетранслируемые области находятся на обоих концах молекул мРНК и соответственно называются 5'- и 3'-НТО. В прокариотических полицистронных мРНК имеются также внутренние межцистронные нетранслируемые области, располагающиеся между транслируемыми областями. Наряду с информацией о последовательности аминокислот в белке молекулы мРНК содержат информацию, определяющую их поведение в клетке (активность и время жизни, внутриклеточное распределение). Эта информация находится в основном в нетранслируемых областях мРНК.

Трансляция – процесс биосинтеза полипептидных цепей белков в живых клетках. Заключается в «считывании» генетической информации, «записанной» в виде последовательности нуклеотидов в молекулах информационных (матричных) рибонуклеиновых кислот (иРНК, или мРНК), причём нуклеотидная последовательность иРНК определяет последовательность аминокислот в синтезируемых белках.

.

Общая схема процесса трансляция. Трансляция осуществляется особыми внутриклеточными частицами - рибосомами, с которыми связываются иРНК и активированные аминокислотные производные транспортных РНК (ак-тРНК). При этом ак-тРНК «узнают» в иРНК определённые тройки нуклеотидов (кодоны), соответствующие связанным с ними аминокислотам. Узнавание происходит за счёт комплементарного взаимодействия кодона иРНК с антикодоном (3 нуклеотидных остатка, комплементарных кодону) тРНК. Все стадии Трансляции катализируются специфическими белковыми факторами и гуанозинтрифосфатом (ГТФ). Кроме клеточных и РНК, их роль в процессе трансляции могут выполнять вирусные РНК и синтетические полинуклеотиды, что широко используется при изучении механизма биосинтеза белка в бесклеточных системах.

Посттрансляционные модификации белков

Многие белки и секретируемые пептиды претерпевают различные структурные изменения в результате котрансляционных и посттрансляционных модификаций, т.е. во время или после завершения их синтеза рибосомами. Описано более 100 различных посттрансляционных модификаций белков . Роль большинства этих модификаций не выяснена; некоторые из них случайны и, по-видимому, не имеют функционального значения, но есть и такие, которые важны для жизни клетки, так как они тщательно контролируются специфическими ферментами. Модификации происходят в ЭР и аппарате Гольджи . В этих органеллах , например, ферменты гликозилирования добавляют к белкам сложные цепи остатков сахаров, образуя гликопротеины. Единственный известный случай гликозилирования в цитозоле клеток млекопитающих - это добавление к белкам N-ацетилглюкозамина.

Однако множество других ковалентных модификаций протекает в первую очередь именно в цитозоле. Некоторые из них стабильны и необходимы для активности белка, например, ковалентное присоединение коферментов (биотина, липоевой кислоты или пиридоксальфосфата).

Среди известных в настоящее время модификаций описана одна, чрезвычайно важная для доставки белков к месту назначения. Присоединение жирной кислоты к белку направляет его к определенным мембранам, обращенным в цитозоль. Важной функцией фосфоинозитидов является так называемая якорная функция - к ним прикрепляются многочисленные белки наружной поверхности клетки. 

Для фосфоинозитидов, служащих якорем мембранных белков, характерно высокое содержание миристиновой кислоты. В якорных фосфоинозитидах инозитольная часть липида гликолизирована. Связь белков с фосфоинозитидгликанами осуществляется через концевой этаноламин.

Определенные ковалентные модификации, происходящие в цитозоле, обратимы и служат для регуляции активности многих белков. Многие клеточные процессы регулируются путем обратимого фосфорилирования-дефосфорилирования белков.

Посттрансляционные модификации включают в себя фосфорилирование факторов транскрипции протеинкиназами , гликозилирование остатков Asn в последовательностях Asn-X- [SerThr], N-концевое ацилирование, циклизацию N-концевого остатка Glu с образованием пироглутаминовой кислоты, C-концевое амидирование последовательностей освобождающихся пептидов, гидроксилирование остатков Lys и Pro, метилирование различных остатков аминокислот.

Многие из перечисленных модификаций являются критическими для биологической активности пептидов. В частности, карбоксиамидирование C-концевого Gly активирует окситоцин и вазопрессин , а перенос сульфогруппы на остаток Tyr в холецистокинине-8 оказывается критическим для проявления его активности в поджелудочной железе. N-Ацетилирование бета-эндорфина блокирует его опиоидную активность, тогда как ацетилирование меланоцитстимулирующего гормона усиливает его влияние на синтез меланинов. Поскольку большинство этих модификаций - тканеспецифические, пептиды, обладающие различной биологической активностью, должны быть доставлены к различным тканям в виде предшественников, где они претерпевают специфический процессинг.

Ингибиторы синтеза белка

Один из путей выяснения тонких молекулярных механизмов синтеза нуклеиновых кислот и белков в клетках – использование таких лекарственных препаратов, которые могли бы избирательно тормозить эти процессы у бактерий, не влияя на клетки организма человека. Некоторые препараты, действительно, оказывают такое избирательное действие, взаимодействуя с белками рибосом прокариот и выключая бактериальный синтез белка. Однако многие из них являются токсичными и для человека. В настоящее время в медицинской практике применяются многие антибиотики, часть из которых будет рассмотрена с целью выяснения молекулярного механизма их действия на ключевые химические реакции синтеза белка и нуклеиновых кислот.

Один из мощных ингибиторов белкового синтеза – пуромицин. Он представляет собой аналог концевого участка аминоацил-тРНК адениловой кислоты и поэтому легко взаимодействует с А-центром пептидил-тРНК с образованием пептидил-пуромицина

Пептидил-пуромицин не несет на себе триплета антикодона и поэтому тормозит элонгацию пептидной цепи, вызывая обрыв реакции, т.е. преждевременную терминацию синтеза белка. При помощи пуромицина было доказано, например, что гормональный эффект в ряде случаев зависит от синтеза белка de novo. Укажем также, что пуромицин оказывает тормозящее действие на синтез белка как у прокариот, так и у эукариот.

Белковый синтез тормозится актиномицином D, обладающим противоопухолевым эффектом, однако вследствие высокой токсичности препарат применяется редко. Он тормозит синтез всех типов клеточной РНК, особенно мРНК. Данное свойство объясняется тормозящим влиянием актиномицина D на ДНК-зависимую РНК-полимеразу, поскольку он связывается с остатками дезоксигуанозина цепи ДНК, выключая матричную функцию последней; это дает основание считать, что актиномицин D ингибирует транскрипцию ДНК.

Другим антибиотиком, также тормозящим синтез клеточной РНК, является используемый при лечении туберкулеза рифамицин. Этот препарат тормозит ДНК-зависимую РНК-полимеразу, связываясь с ферментом. Наиболее чувствительной к нему оказалась бактериальная РНК-полиме-раза. На организм животных этот антибиотик оказывает незначительное влияние. По механизму действия он резко отличается от актиномицина D. Следует указать, кроме того, на недавно открытое противовирусное действие рифамицина; в частности, он успешно используется при лечении трахомы, которая вызывается ДНК-содержащим вирусом. Это дает основание предположить, что данный антибиотик найдет применение в клинической онкологии при лечении опухолей, вызываемых вирусами.

Структурная формула рифампицина

Одним из мощных ингибиторов синтеза вирусной РНК оказался азидотимидин (3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин), синтезированный еще в 1964 г. в надежде на его противоопухолевый эффект. Было показано, что вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) содержит РНК-й геном, в составе которого имеются как стандартные гены ретровирусов, так и необычные небольшие гены со множеством функций. Последние, в частности, подвержены мутациям с высокой скоростью вследствие низкой точности репликации, вызванной свойствами обратной транскриптазы. Эта вирусная обратная транскриптаза иммунодефицита человека оказалась наделенной значительно большим сродством к азидотимидину, чем к природному дезокситимидинтрифосфату (dTТФ). Азидотимидин конкурентно тормозит связывание dTТФ, вызывая тем самым терминацию (окончание) синтеза вирусной РНК.

Выяснены некоторые детали механизма действия ряда других антибиотиков, используемых при лечении тифозных инфекций. Так, хлорам-феникол оказывает ингибирующее влияние на пептидилтрансферазную реакцию (на стадии элонгации) синтеза белка в 70S рибосоме бактерий; на этот процесс в 80S рибосоме он не действует. Тормозит синтез белка в 80S рибосоме (без поражения процесса в 70S рибосоме) циклогексимид – специфический ингибитор транслоказы.

Весьма интересен молекулярный механизм действия дифтерийного токсина. Он оказался наделенным способностью катализировать реакцию АДФ-рибозилирования фактора элонгации эукариот (eEF-2), выключая тем самым его из участия в синтезе белка. Резистентность многих животных к дифтерийному токсину, вероятнее всего, обусловлена трудностью или полным отсутствием проникновения (транспорта) токсина через мембрану клеток.

Противотуберкулезные и антибактериальные антибиотики, в частности стрептомицин и неомицин, действуют на белоксинтезирующий аппарат чувствительных к ним штаммов бактерий. Было высказано предположение, что эти антибиотики обусловливают ошибки в трансляции мРНК, приводящие к нарушению соответствия между кодонами и включаемыми аминокислотами: например, кодон УУУ вместо фенилаланина начинает кодировать лейцин, в результате чего образуется аномальный белок, что приводит к гибели бактерий.

Стрептомицин

Широко применяемые в клинике тетрациклины также оказались ингибиторами синтеза белка в 70S рибосоме (меньше тормозится синтез в 80S рибосоме). Они легко проникают через клеточную мембрану. Считают, что тетрациклины тормозят связывание аминоацил-тРНК с аминоацильным центром в 50S рибосоме. Возможно, что тетрациклины химически связываются с этим центром, выключая тем самым одну из ведущих стадий процесса трансляции.

Тетрациклин

Пенициллины не являются истинными ингибиторами синтеза белка, однако их антибактериальный эффект связан с торможением синтеза гексапептидов, входящих в состав клеточной стенки. Механизм их синтеза отличается от рибосомного механизма синтеза белка. Эритромицин и олеандомицин тормозят активность транслоказы в процессе трансляции, подобно циклогексимиду, исключительно в 80S рибосомах, т.е. тормозят синтез белка в клетках животных.

Полученные к настоящему времени данные о механизме действия антибиотиков на синтез белка с учетом стадии и топографии процесса трансляции суммированы в табл. 14.2 .

Следует еще раз подчеркнуть, что нарушение или выпадение любого звена, участвующего в синтезе белка, почти всегда приводит к развитию патологии, причем клинические проявления болезни будут определяться природой и функцией белка, синтез которого оказывается нарушенным (структурный или функциональный белок). Иногда синтезируются так называемые аномальные белки как результат действия мутагенных факторов и соответственно изменения генетического кода (например, гемоглобин при серповидно-клеточной анемии). Последствия этих нарушений могут выражаться в развитии самых разнообразных синдромов или заканчиваться летально.

Следует отметить, однако, что организм располагает мощными механизмами защиты. Подобные изменения генетического аппарата быстро распознаются специфическими ферментами – рестриктазами, измененные последовательности вырезаются и вновь замещаются соответствующими нуклеотидами при участии полимераз и лигаз.

РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКА

Клетки живых организмов обладают способностью синтезировать огромное количество разнообразных белков. Однако они никогда не синтезируют все белки. Количество и разнообразие белков, в частности ферментов, определяются степенью их участия в метаболизме. Более того, интенсивность обмена регулируется скоростью синтеза белка и параллельно контролируется аллостерическим путем. Таким образом, синтез белка регулируется внешними и внутренними факторами и условиями, которые диктуют клетке синтез такого количества белка и такого набора белков, которые необходимы для выполнения физиологических функций. Все это свидетельствует о весьма сложном, тонком и целесообразном механизме регуляции синтеза белка в клетке.

Общую теорию регуляции синтеза белка разработали французские ученые, лауреаты Нобелевской премии Ф. Жакоб и Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к «выключению» или «включению» генов как функционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию на синтез специфических белков. Эта теория, доказанная в опытах на бактериях, получила широкое признание, хотя в эукариотических клетках механизмы регуляции синтеза белка, вероятнее всего, являются более сложными (см. далее). У бактерий доказана индукция ферментов (синтез ферментов de novo) при добавлении в питательную среду субстратов этих ферментов. Добавление конечных продуктов реакции, образование которых катализируется этими же ферментами, напротив, вызывает уменьшение количества синтезируемых ферментов. Это последнее явление получило название репрессии синтеза ферментов. Оба явления — индукция и репрессия — взаимосвязаны.

Согласно теории Ф. Жакоба и Ж. Моно, в биосинтезе белка у бактерий участвуют по крайней мере 3 типа генов: структурные гены, ген-регулятор и ген-оператор. Структурные гены определяют первичную структуру синтезируемого белка. Именно эти гены в цепи ДНК являются основой для биосинтеза мРНК, которая затем поступает в рибосому и, как было указано, служит матрицей для биосинтеза белка. Регуляция синтеза белка путем индукции представлена на рис. 14.12.

Синтез мРНК на структурных генах молекулы ДНК непосредственно контролируется определенным участком, называемым геном-оператором. Он служит как бы пусковым механизмом для функционирования структурных генов. Ген-оператор локализован на крайнем отрезке структурного гена или структурных генов, регулируемых им. «Считывание» генетического кода, т. е. формирование мРНК, начинается с промотора — участка ДНК, расположенного рядом с геном-оператором и являющегося точкой инициации для синтеза мРНК, и распространяется последовательно вдоль оператора и структурных генов. Синтезированную молекулу мРНК, кодирующую синтез нескольких разных белков, принято называть полигенным (полицистронным) транскриптом. Координированный одним оператором одиночный ген или группа структурных генов образует оперон.

В свою очередь деятельность оперона находится под контролирующим влиянием другого участка цепи ДНК, получившего название гена-регулятора. Структурные гены и ген-регулятор расположены в разных участках цепи ДНК,  поэтому связь между ними,  как предполагают Ф. Жакоб и Ж. Моно, осуществляется при помощи вещества-посредника, оказавшегося белком и названного репрессором. Образование репрессора происходит в рибосомах ядра на матрице специфической мРНК, синтезированной на гене-регуляторе (рис. 14.13). Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Образование такого комплекса приводит к блокированию синтеза мРНК и, следовательно, синтеза белка, т. е. функция гена-регулятора состоит в том, чтобы через белок-репрессор прекращать (запрещать) деятельность структурных генов, синтезирующих мРНК. Репрессор, кроме того, обладает способностью строго специфически связываться с определенными низкомолекулярными веществами, называемыми индукторами, или эффекторами. Если такой индуктор соединяется с репрессором, то последний теряет способность связываться с геном-оператором, который, таким образом, выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК. Это типичный пример отрицательной формы контроля, когда индуктор, соединяясь с белком-репрессором, вызывает изменения его третичной структуры настолько, что репрессор теряет способность связываться с геном-оператором. Процесс этот аналогичен взаимоотношениям алло-стерического центра фермента с эффектором, под влиянием которого изменяется третичная структура фермента и он теряет способность связываться со своим субстратом.

Механизм описанной регуляции синтеза белка и взаимоотношения репрессора со структурными генами были доказаны в опытах с Е. coli на примере синтеза Р-галактозидазы (лактазы) — фермента, расщепляющего молочный сахар на глюкозу и галактозу. Дикий штамм Е. coli обычно растет на глюкозе. Если вместо глюкозы в питательную среду добавить лактозу (новый источник энергии и углерода), то штамм не будет расти, пока не будут синтезированы соответствующие ферменты (адаптивный синтез). При поступлении в клетку лактозы (индуктор) молекулы ее связываются с белком-репрессором и блокируют связь между репрессором и геном-оператором. Ген-оператор и структурные гены при этом начинают снова функционировать и синтезировать необходимую мРНК, которая «дает команду» рибосомам синтезировать Р-галактозидазу. Одновременно ген-регулятор продолжает вырабатывать репрессор, но последний блокируется новыми молекулами лактозы, поэтому синтез фермента продолжается. Как только молекулы лактозы будут полностью расщеплены, репрессор освобождается и, поступив в ДНК, связывает ген-оператор и блокирует синтез мРНК, а следовательно, синтез Р-галактозидазы в рибосомах.

Таким образом, биосинтез мРНК, контролирующий синтез белка в рибосомах, зависит от функционального состояния репрессора. Этот реп-рессор представляет собой тетрамерный белок с общей мол. массой около 150000. Если он находится в активном состоянии, т. е. не связан с индуктором, то блокирует ген-оператор и синтеза мРНК не происходит. При поступлении метаболита — индуктора — в клетку его молекулы связывают репрессор, превращая его в неактивную форму (или, возможно, снижают его сродство к гену-оператору). Структурные гены выходят из-под запрещающего контроля и начинают синтезировать нужную мРНК.

Как было указано, концентрация ряда ферментов в клетках резко снижается при повышении содержания отдаленных конечных продуктов, образующихся в цепи последовательных ферментативных реакций. Такой эффект, получивший название репрессии ферментов, часто наблюдается при реакциях биосинтеза. В этих случаях молекулы репрессора, также образующиеся в рибосомах ядра по «команде» гена-регулятора, являются неактивными и сами по себе не обладают способностью подавлять деятельность гена-оператора и, следовательно, всего оперона, но приобретают такую способность после образования комплекса с конечным или  одним  из  конечных  продуктов  биосинтетического  процесса (см. рис. 14.13).

Конечный продукт выступает, таким образом, в качестве корепрес-сора. Имеются данные, что в качестве корепрессоров в синтезе ферментов обмена аминокислот, по-видимому, выступает не только свободная аминокислота как конечный продукт биосинтетической реакции, но и комплекс ее с тРНК — аминоацил-тРНК.

В регуляции экспрессии структурных генов специфическое участие принимает особый белок — катаболитный генактивирующий белок (от англ. catabolite gene activation protein, сокращенно CAP). Этот белок, взаимодействующий с цАМФ, образует комплекс, способствующий прикреплению РНК-полимеразы к промоторному участку генома. В присутствии комплекса САР-цАМФ фермент может начать транскрипцию оперона, включая структурные гены, т. е. в клетках имеется еще один, дополнительный САР-цАМФ-регулятор, действующий, скорее всего, в качестве положительного регулятора, поскольку его присутствие необходимо для начала экспрессии гена.

Таким образом, концепция Ф. Жакоба и Ж. Моно о механизме проявления (экспрессии) активности генов признана одним из блестящих достижений молекулярной биологии. Она явилась логическим развитием многочисленных исследований, проведенных генетиками и биохимиками в предшествующие десятилетия.

Регуляция экспрессии активности генов у эукариот осуществляется значительно более сложным путем, поскольку процессы транскрипции и трансляции разделены не только пространственно ядерной биомембраной, но и во времени. Эта регуляция базируется как минимум на 6 уровнях сложных биологических процессов, определяющих скорость синтеза и распада генетического продукта (рис. 14.14).

Для большинства эукариотических клеток, как и клеток прокариот, стадия инициации транскрипции является основной, главной регуляторной точкой экспрессии активности генов. Тем не менее имеются существенные различия: во-первых, место процессов транскрипции (в ядре) и трансляции (в цитоплазме); во-вторых, активирование транскрипции у эукариот связано с множеством сложных изменений структуры хроматина в транскрибируемой области; в-третьих, в эукариотических клетках превалируют положительные регуляторные механизмы над отрицательными.

Положительная или отрицательная регуляция определяется типом белков, вовлеченных в механизм регуляции. Получены доказательства существования минимум 3 типов белков, участвующих в регуляции процесса инициации транскрипции, опосредованного через РНК-полимеразу: специфические факторы, репрессоры и активаторы. Первые вызывают изменение специфичности РНК-полимеразы к данному промотору или группе промоторов; репрессоры связываются с промотором, блокируя тем самым доступ РНК-полимеразы к промотору; активаторы, напротив, связываются вблизи промоторного участка, повышая связывание промотора и РНК-полимеразы.

В многоклеточных организмах среднее число регуляторных сайтов для одного гена минимум равно пяти; положительные регуляторные белки связываются со своими специфическими последовательностями в структуре ДНК (вероятнее всего, посредством водородных связей между амидной группой Глн или Асн и пуриновыми и пиримидиновыми основаниями нуклеотидов). Следует указать еще на один момент, почему эукариотическая клетка использует положительные механизмы регуляции экспрессии генов. Подсчитано, что в геноме человека содержится около 100000 генов, соответственно каждая клетка при отрицательном механизме регуляции могла бы синтезировать 100000 разных репрессоров, причем в достаточных количествах. При положительном механизме регуляции большинство генов в принципе неактивно, соответственно молекула РНК-полимеразы не связывается с промотором и клетка синтезирует ограниченный и избирательный круг активаторных белков, необходимых для инициации транскрипции.

У эукариот выделены и охарактеризованы также пять регуляторных белков, получивших название транскрипционных факторов (TF: 11А, 11В, IID, 11Е и IIF). Они необходимы для узнавания участка (сайта) ДНК, названного TATA (concensus последовательности, ТАТАААА). Детальный молекулярный механизм действия факторов транскрипции пока не раскрыт.

Более подробно в структурном и функциональном отношении у эукариот изучена группа белков, получивших название белков—активаторов транскрипции. Эти белки имеют специфические структурные домены для связывания с другими, но определенными регуляторными нуклеотидными последовательностями в молекуле ДНК. В частности, они содержат домен, специфически связывающийся с ДНК, и один или несколько доменов, необходимых для активирования или взаимодействия с другими регуляторными белками. Среди этих белков — активаторов транскрипции имеются белки, содержащие богатые глутамином домены (до 25%) и богатые пролином домены. Следует отметить, однако, что некоторые из них или почти все регуляторные белки активируют транскрипцию не прямо, а опосредованно—через промежуточные белки, названные коактиваторами. Происхождение и механизм действия последних также не выяснены.

Рассмотрим кратко вопрос о регуляции процессов дифференцировки клеток высших организмов. ДНК, присутствующая во всех соматических клетках, вероятнее всего, имеет одинаковую первичную структуру у данного организма и соответственно располагает информацией для синтеза любых или всех белков тела. Тем не менее клетки печени, например, синтезируют сывороточные белки, а клетки молочной железы — белки молока. Нет сомнения в том, что в дифференцированных клетках имеется весьма тонкий механизм контроля деятельности ДНК в разных тканях, обеспечивающий синтез многообразия белков.

Механизмы, лежащие в основе этой регуляции, пока неизвестны. Для их объяснения существует ряд гипотез. Предполагают, что контроль осуществляется на уровне транскрипции по аналогии с индукцией ферментов у бактерий и что в этом случае в клетках животных должны функционировать аналогичные репрессоры. С молекулой ДНК у эукариот связаны гистоны, поэтому считается, что именно эти белки выполняют роль репрессоров. Прямых доказательств их роли в качестве репрессоров не получено, хотя, как было показано, в клетках эукариот открыт класс регуляторных белков процесса транскрипции. Высказано предположение, что в ядре синтезируется высокомолекулярная молекула мРНК, содержащая информацию для синтеза широкого разнообразия белков, но в цитоплазму попадает только небольшая часть зрелой мРНК, а основная часть ее распадается. Неясны, однако, биологический смысл и назначение этого механизма избирательного распада и соответственно траты огромной массы молекулы мРНК.

Существует еще одно предположение, что на ДНК клетки синтезируются все мыслимые, возможные мРНК, которые поступают в цитоплазму, и процесс трансляции регулируется путем специфического и избирательного  взаимодействия  рибосом  с  определенными молекулами мРНК.