Медицина

БИОСИНТЕЗ И КАТАБОЛИЗМ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

БИОСИНТЕЗ И КАТАБОЛИЗМ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЕЧНЫХ ПРОДУКТОВ ИХ ОБМЕНА.

СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Нуклеиновые кислоты - это высокомолекулярные соединения, состоящие из мономерных единиц - нуклеотидов, и поэтому их также называют полинуклеотидами

Каждый нуклеотид содержит три различных компонента: азотистое основание (пуриновых или пиримидиновых) пентозу и фосфорную кислоту (рис. 1.)

Описание: Описание: Описание: метаболізм нуклеопротеїнів

Рис. 1. Структура аденозинмононуклеотида

Главные азотистые основания - компоненты нуклеиновых кислот: пуриновые - аденин (А) и гуанин ), пиримидиновые - урацил (У), цитозин (Ц), тимин (Т) (рис. 2).

Рис. 2. Стоение азотистых оснований.

 

Кроме указанных выше основных пяти азотистых оснований ( двух пуриновых и трех пиримидиновых ) , в состав некоторых нуклеиновых кислот входят в относительно незначительных количествах дополнительные ( минорные ) азотистые основания и соответствующие им минорные нуклеотиды. Наибольшее количество минорных нуклеотидов встречается в молекулах транспортных РНК ( тРНК) - до 5 % общего нуклеотидного состава. К минорным нуклеотидам относятся метилированные производные обычных азотистых оснований, в частности, 1 - метиладенин, 2 - метиладенин, 6- диметиладенин, 1 - метилгуанин, 7- метилгуанин, 1 - метилурацил, 5- оксиметилурацил, 3 - метилцитозин т.п. ДНК человека содержат значительное количество 5- метилцитозину, информационные РНК - N - метилированных производные аденина и гуанина. Нуклеотидом необычной структуры , входящей в состав тРНК , является псевдоуридин - нуклеотид ( рис. 3 ), в котором рибоза присоединена к урацила в 5 - м положении , то есть не азот- карбоновым , а карбон- карбоновым связью. Такие основы в молекулах нуклеиновых килоты во многих случаях являются специфическими сигналами, которые играют важную роль в реализации генетической информации или обеспечении ее хранения. Биологические функции минорных нуклеотидов до конца не выяснены.

Рис. 3. Строение псевдоуридина.

Нуклеотиды в составе ДНК содержат углевод D-2-дезоксирибозу, а в РНК - D-рибозу (рис. 4). Обе пентозы находятся в Р-фуранозных форме:

Рис. 4. Строение пентоз: 1 - D-рибоза, 2 - D-2-дезоксирибоза.

Атомы углерода в пентозах нумеруются цифрами со штрихом, чтобы отличить их от атомов углерода в азотистых основаниях. При соединении рибозы или дезоксирибозы с азотистой основой образуется нуклеозид (рис. 5)

Рис. 5. Структура нуклеозида.

Связь между пентозой и азотистой основой идет от первого атома углерода пентозы к первому атому азота пиримидина или девятого атома азота пурина. Связь называется гликозидной. Нуклеотиды - это фосфорные эфиры нуклеозидов. Связь образуется за счет взаимодействия фосфата с гидроксилом в положении С-5 'пентозы. При гидролизе нуклеиновых кислот могут образовываться и нуклеозид-3'-монофосфата (рис. 6).  

Рис. 6. Структура нуклеозид-3'-монофосфата.

В зависимости от строения пентозы, нуклеотиды делятся на рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотидов. Наличие остатков фосфорной кислоты в составе нуклеотидов придает им кислотных влативостей, поэтому их считают кислотами, как и полимеры - нуклеиновые кислоты.

Далее приведена номенклатура нуклеозидов и нуклеотидов и формулы четырех главных дезоксирибонуклеотидов (структурных единиц ДНК) (рис. 7) и четырех главных рибонуклеотидов (структурных единиц РНК) (рис. 8).

Рис. 7. Строение дезоксирибонуклеотидов

 

Описание: Описание: Описание: C:\Users\5\Desktop\Презентация1.jpg

Описание: Описание: Описание: C:\Users\5\Desktop\Презентация1.jpg

Рис. 8. Строение рибонуклеотидов.

В организме, кроме нуклеозидмонофосфатов, находятся нуклеозиддифосфаты и нуклеозидтрифосфат. В синтезе нуклеиновых кислот участвуют именно нуклеозидтрифосфат (рис. 9).

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: bioenergetika-celi-na-prepodavatelq-_html_65eb6f61

Рис. 9. Строение аденозинтрифосфата.

Система АТФ-АДФ-АМФ играет особую роль в биоэнергетике, во всех живых организмах АТФ выступает как депо для хранения и переноса энергии. Аналогично АТФ, другие нуклеозидтрифосфат также содержат два высокоэнергетические связи между фосфатными остатками и используются в обмене веществ.

Например, ЦТФ имеет отношение к биосинтезу фосфолипидов. УТФ используется для синтеза и взаимопревращений различных углеводов, ГТФ необходим для синтеза белков. В состав коферментов НАД, НАДФ, ФАД, КоА, ФАФС входят адениловые нуклеотиды. Отдельную группу составляют циклические нуклеотиды, в которых фосфатный остаток образует сложноэфирные связи с 3'-и 5'-гидроксильными группами рибозы (рис. 10):

Рис. 10. Строение циклических нуклеотидов.

Циклические аденозинмонофосфат (цАМФ) и гуанозинмонофосфат (цГМФ) играют очень важную роль в обмене веществ, через них реализуется регуляторная роль ряда гормонов. цАМФ и цГМФ образуются из АТФ и ГТФ под действием ферментов аденилатциклазы и гуанилатциклазы.

Отщепление пирофосфата от нуклеозидтрифосфат приводит к замыканию шестичленного кольца. При расщеплении циклических нуклеотидов под действием фосфодиэстеразы образуются соответствующие нециклические нуклеотиды - нуклеозид-5'-монофосфата.

Нуклеопротеиды

Нуклеопротеиды - сложные белки, комплексы нуклеиновых кислот с белками. В зависимости от типа нуклеиновой кислоты, нуклеопротеиды делятся на дезоксирибонуклеопротеины и рибонуклеопротеины. Устойчивость нуклеопротеинових комплексов обеспечивается ковалентным взаимодействием. Примером специфического взаимодействия могут служить нуклеопротеиды комплексы рРНК - субъединицы рибосом; неспецифическая электростатическое взаимодействие характерно для хромосомных комплексов ДНК - хроматина с гистонами и комплексов ДНК-протамины головок сперматозоидов некоторых животных. Нуклеопротеиды диссоциируют на белки и нуклеиновые кислоты при действии агентов, разрушающих или ослабляют Нековалентные связи: 1) повышенные концентрации солей или мочевины, увеличивающие ионную силу раствора; 2) ионогенные поверхностно-активные вещества; 3) некоторые полярные органические соединения (формамид и диметилформамид, фенол и др.). При образовании нуклеопротеинов происходят существенные конформационные изменения нуклеиновых кислот и, в некоторых случаях, белков, образующих нуклеопротеиновий комплекс. Эти изменения существенные в случае образования дезоксирибонуклеопротеїнів. В отличие от одноцепочечной РНК, способной образовывать вторичные и третичные структуры за счет антипараллельная комплементарного спаривания смежных отрезков цепи, двухцепочечная ДНК такой возможности не имеет, по сравнению с компактными глобулами РНК. Однако взаимодействие ДНК с белками (гистонами и протамин) за счет электростатического взаимодействия приводит к образованию значительно плотнее упакованных нуклеопротеинових комплексов - хроматина, обеспечивает компактное хранение ДНК и, соответственно, наследственной информации в составе хромосом эукариот. С другой стороны, большая конформационная подвижность РНК и ее каталитические свойства связаны с большим разнообразием рибонуклеопротеинив, выполняющих различные функции.

Дезоксирибонуклеопротеины

Хроматин - комплекс ДНК с гистонами в клетках эукариот. За счет электростатического взаимодействия нить ДНК осуществляет двойной оборот вокруг октамера гистонного комплекса H2a, H2b, H3 и H4, образуя нуклеосомы, соединенные нитью ДНК. При присоединении к комплексу гистона H1 шесть нуклеосом образуют кольцеобразный комплекс, в результате происходит конденсация хроматина с образованием фибриллярные структуры, которая далее при присоединении топоизомеразы II и ряда вспомогательных белков способна конденсироваться в гетерохроматине. ДНК, связанная в таком нуклеопротеиновому комплексе, НЕ транскрибируется. Отдельным важным классом дезоксирибонуклеопротеїнів являются вирусные нуклеопротеиды.

Рибонуклеопротеины

В клетках в основном содержатся следующие типы рибонуклеопротеинов (ГНП): 1) нуклеопротеиды комплексы рибосомных РНП (рРНП) - субъединицы рибосом - органелл, на которых происходит трансляция мРНК. Рибосомы являются агрегатами с двух разных рРНП-субъединиц. 2) Малые ядерные рибонуклеопротеины (мяРНП) - нуклеопротеиды комплексы малых ядерных РНК. 3) нуклеопротеиды комплексы мРНК - матричные рибонуклеопротеины (МРНП).

Переваривание нуклеопротеинов и всасывание продуктов их распада осуществляются в пищеварительном тракте. Под влиянием ферментов желудка, частично соляной кислоты, нуклеопротеины пищи распадаются на полипептиды и нуклеиновые кислоты; первые в кишечнике подвергаются гидролитическому расщеплению до свободных аминокислот. Распад нуклеиновых кислот происходит в тонкой кишке в основном гидролитическим путем под действием ДНК- и РНКазы панкреатического сока. Продуктами реакции при действии РНКазы являются пуриновые и пи-римидиновые мононуклеотиды, смесь ди- и тринуклеотидов и резистентные к действию РНКазы олигонуклеотиды. В результате действия ДНКазы образуются в основном динуклеотиды, олигонуклеотиды и небольшое количество мононуклеотидов. Полный гидролиз нуклеиновых кислот до стадии мононуклеотидов осуществляется, очевидно, другими, менее изученными ферментами (фосфодиэстеразами) слизистой оболочки кишечника. В отношении дальнейшей судьбы мононуклеотидов существует два предположения. Считают, что мононуклеотиды в кишечнике под действием неспецифических фосфатаз (кислой и щелочной), которые гидролизируют фосфоэфирную связь мононуклеотида («нуклеотидазное» действие), расщепляются с образованием нуклеозидов и фосфорной кислоты и в таком виде всасываются. Согласно второму предположению, мононуклеотиды всасываются, а распад их происходит в клетках слизистой оболочки кишечника. Имеются также доказательства существования в стенке кишечника нуклеотидаз, катализирующих гидролитический распад мононуклеотидов. Дальнейший распад образовавшихся нуклеозидов осуществляется внутри клеток слизистой оболочки преимущественно фосфоролитическим, а не гидролитическим путем. Всасываются преимущественно нуклеозиды, и в таком виде часть азотистых оснований может быть использована для синтеза нуклеиновых кислот организма. Если происходит дальнейший распад нуклеозидов до свободных пуриновых и пиримидиновых оснований, то гуанин не используется для синтетических целей. Другие основания, как показывают опыты с меченными по азоту аденином и урацилом, в тканях могут включаться в состав нуклеиновых кислот. Однако экспериментальные данные свидетельствуют, что биосинтез азотистых оснований, входящих в состав нуклеиновых кислот органов и тканей, протекает преимущественно, если не целиком, de novo из низкомолекулярных азотистых и безазотистых предшественников. Таким образом, синтез нуклеиновых кислот, мономерными единицами которых являются мононуклеотиды, будет определяться скоростью синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов; синтез последних в свою очередь зависит от наличия всех составляющих из трех компонентов. Источником рибозы и дезоксирибозы служат продукты превращения глюкозы в пентозофосфатном цикле. Пока не получены доказательства существенной роли пищевых пентоз в синтезе нуклеиновых кислот. Фосфорная кислота также не является лимитирующим фактором, поскольку она поступает в достаточном количестве с пищей. Следовательно, биосинтез нуклеиновых кислот начинается с синтеза азотистых оснований (точнее, мономерных молекул – мононуклеотидов).

 

ПЕРЕВАРИВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПИЩИ В ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОМ ТРАКТЕ

Пищевые нуклеопротеины, попадая в организм человека, в желудке отщепляют белковый компонент и денатурируют под действием HCl желудочного сока.

Рис. Переваривание нуклеиновых кислот пищи.

Далее полинуклеотидная часть этих молекул гидролизуется в кишечнике до мононуклеотидов.

В расщеплении нуклеиновых кислот принимают участие ДНК-азы и РНК-азы панкреатического сока, которые, будучи эндонуклеазами, гидролизуют макромолекулы до олигонуклеотидов. Последние под действием фосфодиэстераз панкреатической железы расщепляются до смеси 3'- и 5'-мононуклеотидов. Нуклеотидазы и неспецифические фосфатазы гидролитически отщепляют фосфатный остаток нуклеотидов и превращают их в нуклеозиды, которые либо всасываются клетками тонкого кишечника, либо расщепляются нуклеозидфосфорилазами кишечника с образованием рибозоили дезоксирибозо-1-фосфата, пуриновых и пиримидиновых оснований.

Пищевые пурины и пиримидины не являются незаменимыми пищевыми факторами и очень мало используются для синтеза нуклеиновых кислот тканей. В энтероцитах обнаружена высокая активность ксантиноксидазы - фермента, который большую часть пуринов, поступающих в клетки, превращает в мочевую кислоту, удаляющуюся с мочой. Пиримидиновые основания, не успевшие поступить в энтероциты, под действием микрофлоры кишечника расщепляются до NH3, CO2, β-аланина и β-аминоизобутирата.

В различных клетках организма синтезируется до 90% пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов из простых предшественников de novo.

Введённые в кровь азотистые основания и нуклеозиды, а также основания и нуклеозиды, образующиеся в результате внутриклеточного разрушения нуклеиновых кислот, в небольшом количестве могут использоваться для повторного синтеза нуклеотидов по так называемым «запасным» путям.

Синтез пуриновых нуклеотидов

В 40-50-х годах ХХ столетия опытами с мечеными изотопами удалось выяснить происхождение атомов пуринового ядра при синтезе пуринов de novo. Было установлено, что в формировании кольца принимают участие аминокислоты

Асп, Гли, Глн, СО2 и два одноуглеродных производных тетрагидрофолата: метенил-Н4-фолат и формил-Н4-фолат. Этим способом образуется основное количество пуриновых нуклеотидов, тогда как нуклеотиды, синтезирующиеся за счёт повторного использования азотистых оснований или нуклеозидов, составляют не более 10-20% общего фонда этих соединений.

БИОСИНТЕЗ И КАТАБОЛИЗМ ПУРИНОВЫХ РИБОНУКЛЕОТИДОВ. ЗАБОЛЕВАНИЯ, СВЯЗАННЫЕ С НАРУШЕНИЕМ ИХ МЕТАБОЛИЗМА

1. Реакции образования пуриновых нуклеотидов начинаются с синтеза 5-фосфорибозил-1-дифосфата (ФРДФ), являющегося общим донором фосфорибозы в синтезе пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. ФРДФ образуется из рибозо-5-фосфата и АТФ в реакции, катализируемой ФРДФ-синтетазой:

2. Основным путем образования пуриновых нуклеотидов является синтез из простых предшественников (de novo).

В этом метаболическом пути свободное азотистое основание не образуется, а пуриновое кольцо формируется на остатке рибозо-5-фосфата при участии глицина, амидного азота Глн, а-NН2-группы Асп, СО2 и одноуглеродных производных: метенил- и формил-Н4-фолата (рис.).

Рис. Происхождение атомов С и N в пуриновом основании

Синтез первого пуринового нуклеотида - инозин-5'-монофосфата (ИМФ) включает 10 стадий и идет с затратой шести молекул АТФ. Все реакции протекают в цитозоле большинства клеток организма. Двумя последовательными реакциями ИМФ может превращаться в АМФ или ГМФ соответственно (рис.).

Рис. Синтез пуриновых нуклеотидов и его регуляция.

 

Регуляторной и скорость-лимитирующей стадией процесса является перенос амидной группы Глн на ФРДФ с образованием 5-фосфорибозил-1- амина, которую катализирует ФРДФ-амидофосфорибозилтрансфераза.

Ткани, не способные к синтезу пуринов: эритроциты, полиморфноядерные лейкоциты и частично мозг - обеспечиваются нуклеотидами за счет их синтеза в печени.

3. Синтез нуклеозиддифосфатов (НДФ) и нуклеозидтрифосфатов (НТФ) происходит при участии АТФ и ферментов нуклеозидмонофосфат- или нуклеозиддифосфаткиназ (НМФ- и НДФ-киназы соответственно) (рис.).

Рис. Синтез пуриннуклеозидди- и -трифосфатов

Перенос амидной группы Глн на ФРДФ и образование 5-фосфорибозил-1-амина катализирует ФРДФ-амидофосфорибозилтрансфераза. Затем с аминогруппой 5-фосфорибозил-1-амина последовательно взаимодействуют остаток Гли, N5N10- метенил-Н4-фолат, еще одна амидная группа Глн, диоксид углерода, аминогруппа Асп и формильный радикал N10-формил-Н4-фолата. Синтезируется первый пуриновый нуклеотид - инозин-5'-монофосфат (ИМФ). На этом этапе метаболический путь раздваивается и ИМФ становится общим предшественником АМФ и ГМФ, каждый из которых получается в двух последовательных реакциях. В процессе синтеза АМФ из ИМФ используется энергия молекулы ГТФ, а при синтезе ГМФ - энергия АТФ. ФРДФ-амидофосфорибозилтрансфераза, аденилосукцинатсинтетаза и ИМФ-дегидрогеназа - аллостерические ферменты, и их активность регулируется по механизму отрицательной обратной святи.

4. Регуляция процесса. АМФ, ГМФ, ИМФ, ди- и трифосфаты адениловых и гуаниловых нуклеотидов ингибируют ключевые реакции своего синтеза аллостерически по механизму отрицательной обратной связи.

Первые два фермента - ФРДФ-синтетаза и ФРДФ-амидофосфорибозилтрансфераза определяют скорость синтеза пуриновых нуклеотидов по основному пути, и их ингибирование происходит лишь при одновременном повышении концентрации АМФ и ГМФ. Активность аденилосукцинатсинтетазы и ИМФ-дегидрогеназы, находящихся на разветвлении метаболического пути, снижается при увеличении количества конечного продукта, образующегося в каждой из ветвей. АМФ ингибирует превращение ИМФ в аденилосукцинат, а ГМФ - превращение ИМФ в ксантозин-5'-монофосфат (КМФ). Превращение ИМФ в аденилосукцинат в ходе синтеза АМФ требует ГТФ, а превращение КМФ в ГМФ - АТФ. Перекрестная регуляция путей использования ИМФ служит для того, чтобы снизить синтез одного пуринового нуклеотида при дефиците другого и обеспечить сбалансированное содержание адениловых и гуаниловых нуклеотидов.

5. Запасные пути синтеза. Пуриновые нуклеотиды синтезируются «запасными» путями из азотистых оснований и нуклеозидов. Эти пути имеют вспомогательное значение, давая от 10 до 20% общего количества нуклеотидов. При этом используются азотистые основания и нуклеозиды, образующиеся в процессе катаболизма нуклеиновых кислот («путь спасения»). Эти реакции катализируют ферменты:

Еще один «запасной» путь включает фосфорилирование пуриновых нуклеозидов с помощью АТФ. Так, аденозинкиназа катализирует фосфорилирование аденозина до АМФ или дезоксиаденозина до дАМФ:

6. Катаболизм пуриновых нуклеотидов. Гиперурикемия, подагра. Мононуклеотиды теряют фосфатный остаток гидролитически под действием фосфатаз или нуклеотидаз с образованием нуклеозидов. Дальнейшие превращения в мочевую кислоту сопровождаются гидролитическим дезаминированием с участием аденозиндезаминазы или гуаназы и отщеплением рибозы, которое ускоряется пуриннуклеозидфосфорилазой (рис.).

Рис. Катаболизм пуриновых нуклеотидов. Образование мочевой кислоты.

Мононуклеотиды под действием фосфатаз или нуклеотидаз теряют фосфатный остаток и превращаются в нуклеозиды. Аденозин дезаминируется, отщепляет рибозу и образует гипоксантин. Гуанозин в результате сходных реакций превращается в ксантин. Под действием ксантиноксидазы гипоксантин и ксантин окисляются в мочевую кислоту

Последние стадии процесса катализирует фермент ксантиноксидаза, участвующая в превращении азотистых оснований в конечный продукт. Она окисляет гипоксантин в ксантин и ксантин в мочевую кислоту с участием молекулярного кислорода. Образование мочевой кислоты происходит главным образом в печени и кишечнике. У человека мочевая кислота является конечным продуктом обмена пуринов и выводится из организма с мочой и немного через кишечник.

В норме содержание мочевой кислоты в сыворотке крови составляет 0,15-0,47 ммоль/л, или 3-7 мг/дл, а в суточной моче - 400-600 мг/дл.

Частым нарушением катаболизма пуринов является гиперурикемия, которая возникает, когда в плазме крови концентрация мочевой кислоты превышает норму.

На фоне гиперурикемии развивается подагра - заболевание, при котором мочевая кислота и ураты из-за плохой растворимости начинают кристаллизоваться и откладываться в суставных хрящах, связках и мягких тканях с образованием подагрических узлов или тофусов, вызывая воспаление суставов и почечнокаменную болезнь. Подагрой страдает от 0,3 до 1,7% населения земного шара. У мужчин сывороточный фонд уратов в 2 раза выше, чем у женщин, поэтому они болеют подагрой в 20 раз чаще, чем женщины.

Заболевание генетически детерминировано и вызвано:

•  дефектами ФРДФ-синтетазы, связанными с гиперактивацией фермента, либо его устойчивостью к ингибированию конечными продуктами синтеза;

•  частичной потерей активности гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы, которая обеспечивает повторное использование пуринов.

При полной потере активности гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы развивается тяжелая форма гиперурикемии - синдром Леша-Нихена, при котором наблюдаются неврологические и психические отклонения. В первые месяцы жизни детей неврологические расстройства еще не наблюдаются, но на пеленках обнаруживаются розовые и оранжевые пятна, вызванные повреждением мочевыводящих путей кристаллами мочевой кислоты. Болезнь наследуется как рецессивный признак, сцепленный с Х-хромосомой, и встречается только у мальчиков.

Лечат подагру диетой, ограничивающей потребление мясных продуктов, и аллопуринолом - структурным аналогом гипоксантина. Ксантиноксидаза окисляет препарат в оксипуринол, который прочно связывается с активным центром фермента и останавливает катаболизм пуринов на стадии гипоксантина, который в 10 раз лучше растворим в жидкостях организма, чем мочевая кислота.

БИОСИНТЕЗ И КАТАБОЛИЗМ ПИРИМИДИНОВЫХ РИБОНУКЛЕОТИДОВ. ОРОТАЦИДУРИЯ

1. УМФ является общим предшественником всех остальных пиримидиновых нуклеотидов: ЦМФ и ТМФ. Синтез УМФ de novo включает шесть последовательных стадий (рис. 10.5) и протекает главным образом в цитозоле клеток при участии трех ферментов, два из которых полифункциональны:

•  первый полифункциональный фермент - КАД-фермент содержит домены, проявляющие активности карбамоилфосфатсинтетазы II (КФСН), аспартаттранскарбамоилазы (ATK), дигидрооротазы и катализирующие три первые реакции этого метаболического пути;

•  митохондриальная NAD-зависимая дигидрооротатдегидрогеназа которая окисляет дигидрооротат в оротат;

•  превращение азотистого основания - оротата в нуклеотид и его последующее декарбоксилирование до УМФ катализирует второй полифункциональный фермент - УМФ-синтаза, обладающая оротатфосфорибозилтрансферазной и ОМФ-декарбоксилазной активностями.

Рис. Синтез пиримидиновых нуклеотидов и его регуляция: 1-3 - КАД-фермент (1-карбамоилфосфатсинтетаза, КФС11); 2 - аспартаттранскарбамоилаза (АТК); 3 -дигидрооротаза; 4 - дигидрооротатдегидрогеназа; 5, 6 - УМФ-синтаза (5-оротатфосфорибозилтрансфераза; 6 - ОМФ-декарбоксилаза); 7 - НМФ-киназа; 8 - НДФ-киназа; 9 - ЦТФ-синтетаза.

Аллостерически регулируются по механизму отрицательной обратной связи карбамоилфосфатсинтетазная и аспататтранскарбамоилазная активности КАД-фермента конечными продуктами метаболического пути - УМФ и ЦТФ, тогда как ФРДФ активизирует КФС11, а АТФ - АТК

Пиримидиновое кольцо «собирается» из простых предшественников - глутамина, аспартата и СО2 - и после окисления превращается в азотистое основание - оротат. Превращение оротата в нуклеотид - оротидин-5'- монофосфат (ОМФ) - осуществляется с использованием ФРДФ. УМФ образуется при декарбоксилировании ОМФ.

Превращение УМФ в полифосфорные производные за счет переноса γ-фосфатного остатка АТФ на УМФ с образованием УДФ и УТФ катализируют НМФ- и НДФ-киназы.

Синтез ЦТФ из УТФ осуществляет ЦТФ-синтетаза, используя амидную группу Глн и энергию АТФ для аминирования пиримидинового кольца.

2. Регуляция процесса. Активность ферментов синтеза пиримидиновых нуклеотидов регулируется аллостерически по механизму отрицательной обратной связи конечными продуктами УМФ и ЦТФ:

•  в составе КАД-фермента: УМФ ингибирует, а ФРДФ активирует КФС II, тогда как активность аспартаттранскарбамоилазы ингибирует ЦТФ, но активирует АТФ;

•  УМФ и ЦМФ снижают активность второго полифункционального фермента - УМФ-синтазы;

•  накопление ЦТФ снижает активность ЦТФ-синтетазы.

Синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов строго координируется: ФРДФ активирует оба синтеза, а накопление пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов ингибирует образование ФРДФ по механизму отрицательной обратной связи.

 

ОБРАЗОВАНИЕ 5-ФОСФОРИБОЗИЛ-1-ДИФОСФАТА

Фосфорибозилдифосфат (ФРДФ), или фос-форибозилпирофосфат (ФРПФ) занимает центральное место в синтезе как пуриновых, так и пиримидиновых нуклеотидов (рис.).

Рис. Образование 5-фосфорибозил-1-дифосфата.

 

Он образуется за счёт переноса β,γ-пирофосфатного остатка ATФ на рибозо-5-фосфат в реакции, катализируемой ФРДФ-синтетазой.

Источниками рибозо-5-фосфата могут быть: пентозофосфатный путь превращения глюкозы или катаболизм нуклеозидов, в ходе которого под действием нуклеозидфосфорилазы первоначально образуется рибозо-1-фосфат, а затем с помощью соответствующей мутазы фосфатный остаток переносится в 5-положение.

ФРДФ участвует не только в синтезе пуриновых и пиримидиновьгх нуклеотидов из простых предшественников (т.е. de novo), но используется на образование пуриновых нуклеотидов по «запасному» пути и в синтезе нуклеотидных коферментов.

 

БИОСИНТЕЗ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ DE NOVO

Сборка пуринового гетероцикла осуществляется на остатке рибозо-5-фосфата при участии различных доноров углерода и азота (рис.).

 

Рис. Происхождение атомов С и N в пуриновом кольце.

 

Включение простых предшественников в пуриновое кольцо с образованием ИМФ

Первая специфическая реакция образования пуриновых нуклеотидов - перенос амидной группы Глн на ФРДФ с образованием 5-фосфорибозил-1-амина (рис.).

Рис. Синтез пуриновых нуклеотидов de novo.

 

Эту реакцию катализирует фермент амидофосфорибозилтрансфераза. При этом формируется β-Ν-гликозидная связь. Затем к аминогруппе 5-фосфорибозил-1-амина присоединяются остаток глицина, N5, N10-мете-нил-Н4-фолата ещё одна амидная группа глута-мина, диоксид углерода, аминогруппа аспартата и формильный остаток N10-формил Н4-фолата.

Результатом этой десятистадийной серии реакций является образование первого пуринового нуклеотида - инозин-5'-монофосфата (ИМФ), на синтез которого затрачивается не менее шести молекул АТФ. В отличие от прокариотов, у которых каждую стадию этого процесса катализирует отдельный фермент, у эукариотов за счёт слияния генов возникли полифункциональные ферменты, каждый из которых катализирует несколько реакций. В синтезе пуриновых нук-леотидов de novo это реакции 3, 4 и 6, 7-8 и 10-11 соответственно.

ИМФ в основном используется на синтез АМФ или ГМФ. Небольшое количество этого продукта обнаруживается также в тРНК в качестве одного из минорных нуклеотидов.

Превращение ИМФ в АМФ и ГМФ в обоих случаях включает 2 стадии и идёт с затратой энергии (рис.).

Аденилосукцинатсинтетаза, используя энергию ГТФ, присоединяет аспартат к ИМФ с образованием аденилосукцината, который в реакции, катализируемой аденилосукциназой, отщепляет фумарат и превращается в АМФ.

Второй пуриновый нуклеотид (ГМФ) образуется также в 2 стадии. Сначала ИМФ окисляется NАD+-зависимой ИМФ-дегидрогеназой с образованием ксантозин-5 -монофосфата (КМФ). Последующее трансамидирование гидроксиль-ной группы при С2-пуринового кольца КМФ катализирует ГМФ-синтетаза с использованием амидной группы Глн и энергии АТФ.

При образовании пуриновых нуклеотидов ГТФ расходуется на синтез АМФ, а АТФ - на синтез ГМФ. Перекрёстное использование пу-риновых нуклеозидтрифосфатов на образование конечных продуктов синтеза помогает поддерживать в клетках баланс адениловых и гуаниловых нуклеотидов.

Печень - основное место образования пуриновых нуклеотидов, откуда они могут поступать в ткани, не способные к их синтезу: эритроциты, ПЯЛ и частично мозг.

Образование нуклеозидди- и трифосфатов

В образовании нуклеиновых кислот, некоторых коферментов и во многих синтетических процессах нуклеотиды используются в виде ди-и трифосфатов, синтез которых катализируют ферменты класса трансфераз. АМФ и ГМФ превращаются в нуклеозиддифосфаты (НДФ) с помощью специфичных к азотистому основанию нуклеозидмонофосфаткиназ (НМФ-киназ) и АТФ. Так, аденилаткиназа катализирует реакцию:

амф + атф → 2 адф, а гуанилаткиназа:

гмф + атф → гдф + адф.

Аденилаткиназа особенно активна в печени и мышцах, где высок уровень энергоёмких процессов. Функция этого фермента заключается в том, чтобы поддерживать в тканях равновесие фонда адениловых нуклеотидов: AMФ, AДФ и ATФ.

Взаимопревращения нуклеозиддифосфатов и нуклеозидтрифосфатов осуществляет нуклео-зиддифосфаткиназа. Этот фермент в отличие от НМФ-киназ обладает широкой субстратной специфичностью и, в частности, может катализировать реакцию:

гдф + атф → гтф + адф.

Превращение AДФ в ATФ происходит, в основном, за счёт окислительного фосфорилирования или в реакциях субстратного фосфо-рилирования гликолиза или цитратного цикла.

«ЗАПАСНЫЕ» ПУТИ СИНТЕЗА ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ (РЕУТИЛИЗАЦИЯ АЗОТИСТЫХ ОСНОВАНИЙ И НУКЛЕОЗИДОВ)

Огромные затраты энергии для синтеза пуриновых нуклеотидов de novo не способны полностью обеспечить субстратами синтез нуклеиновых кислот в период гаструляции и раннего роста ребёнка.

 

Рис. Синтез АМФ и ГМФ из ИМФ. 1 - аденилосукцинатсинтетаза; 2 - аденилосукциназа; 3 - ИМФ-дегидрогеназа; 4 - ГМФ-синтетаза.

Потребность в большом количестве нуклеотидов привела к развитию «запасных» путей синтеза этих «дорогих» молекул. Наибольшее значение в этом процессе имеют ферменты, осуществляющие превращение пуринов в мононуклеотиды с использованием ФРДФ как донора остатка фосфорибозы.

Синтез АМФ и ГМФ из аденина и гуанина

ФРДФ-зависимое фосфорибозилирование пуринов катализируют 2 фермента.

Аденинфосфорибозилтрансфераза, ответственная за образование АМФ (рис.). Гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза, катализирующая образование ИМФ и ГМФ из гипоксантина и гуанина соответственно (рис.).

Однако в организме при любых ситуациях этот путь синтеза пуриновых нуклеотидов, получивший название «путь спасения», имеет вспомогательное значение.

Рис. Фосфорибозилирование аденина в АМФ.

Рис. Фосфорибозилирование гипоксантина и гуанина с образованием ИМФ и ГМФ.

Нуклеозидкиназы

Нуклеозиды, получающиеся при катаболизме нуклеиновых кислот из нуклеотидов под действием нуклеотидаз, могут повторно фосфори-лироваться, образуя нуклеозид-5 -монофосфаты за счёт переноса γ-фосфатного остатка АТФ на соответствующий субстрат. У млекопитающих такой путь пополнения запасов пуриновых нук-леотидов в клетке не имеет существенного значения. Основным ферментом этой группы является аденозинкиназа, которая ускоряет реакцию:

Аденозин + АТФ → АМФ + АДФ.

Из всех способов реутилизации пуринов наиболее активна гипоксантин-гуанинфосфори-бозилтрансферазная реакция, поскольку ИМФ, образующийся в этой реакции, вовлекается в синтез АМФ и ГМФ. Использование гипоксан-тина и гуанина по запасному пути становится жизненно важным событием в клетках, не способных к синтезу пуриновых нуклеотидов de novo. Значение аденинфосфорибозилтранс-феразы в повторном использовании аденина менее существенно. По сравнению с аденозином количество аденина в клетках мало, а первый возвращается в фонд нуклеотидов с помощью аденозинкиназы.

РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

Основным показателем, от которого зависит синтез пуриновых нуклеотидов, служит концентрация ФРДФ, которая, в свою очередь, зависит от скорости его синтеза, утилизации и разрушения. Количество ФРДФ определяется доступностью рибозо-5-фосфата и активностью ФРДФ син-тетазы - фермента, чувствительного к концентрации фосфата и пуриновых нуклеотидов.

Внутриклеточная концентрация ФРДФ строго регулируется и обычно низкая. ФРДФ синтета-за - аллостерический фермент. Он активируется неорганическим фосфатом (Pi) и ингибируется пуриновыми нуклеозидмоно-, ди- и трифосфатами, которые по эффективности ингибиро-вания распределяются в следующем порядке: НМФ > НДФ > НТФ (рис. 10-8). ФРДФ служит не только субстратом, но и аллостерическим активатором второй реакции синтеза пури-нонуклеотидов de novo, которую катализирует амидофосфорибозилтрансфераза.

Пуриновые нуклеотиды, особенно АМФ и ГМФ по механизму отрицательной обратной связи ингибируют амидофосфорибозилтрансфе-разу, которая катализирует первую специфическую реакцию синтеза пуриновых нуклеотидов de novo.

 

Рис. Регуляция синтеза пуриновых нуклеотидов. 1 - ФРДФ синтетаза; 2 - амидофосфорибозил-трансфераза; 3 - ИМФ дегидрогеназа; 4 - аденило-сукцинатсинтетаза.

Метаболическая цепь образования АМФ и ГМФ de novo регулируется также в месте её разветвления: АМФ ингибирует аденилосукци-натсинтетазу, а ГМФ - реакцию образования ксантиловой кислоты, которую катализирует ИМФ дегидрогеназа. Перекрёстная регуляция путей использования ИМФ служит для того, чтобы снизить синтез одного пуринового нук-леотида при дефиците другого.

Помимо ферментов основного пути синтеза пуриновых нуклеотидов de novo, регулируется также активность ферментов «запасных» путей: аденинфосфорибозилтрансфераза ингибируется АМФ, а гипоксантин-гуанинфосфорибозил-трансфераза - ИМФ и ГМФ.

Катаболизм пуринових нуклеотидов

У человека основной продукт катаболизма пуриновых нуклеотидов - мочевая кислота.

 

Её образование идёт путём гидролитического отщепления фосфатного остатка от нуклеотидов с помощью нуклеотидаз или фосфатаз, фос-форолиза N-гликозидной связи нуклеозидов пуриннуклеозидфосфорилазой, последующего дезаминирования и окисления азотистых оснований (рис.).

Рис. Катаболизм пуриновых нуклеотидов до мочевой кислоты.

 

От АМФ и аденозина аминогруппа удаляется гидролитически аденозиндезаминазой с образованием ИМФ или инозина. ИМФ и ГМФ превращаются в соответствующие нуклеозиды: инозин и гуанозин под действием 5 -нуклеотида-зы. Пуриннуклеозидфосфорилаза катализирует расщепление N-гликозидной связи в инозине и гуанозине с образованием рибозо-1-фосфата и азотистых оснований: гуанина и гипоксантина.

Гуанин дезаминируется и превращается в ксантин, а гипоксантин окисляется в ксантин с помощью ксантиноксидазы, которая катализирует и дальнейшее окисление ксантина в мочевую кислоту.

Ксантиноксидаза - аэробная оксидоредук-таза, простетическая группа которой включает ион молибдена, железа (Fe3+) и FAD. Подобно другим оксидазам, она окисляет пурины молекулярным кислородом с образованием перок-сида водорода. В значительных количествах фермент обнаруживается только в печени и кишечнике.

Мочевая кислота удаляется из организма главным образом с мочой и немного через кишечник с фекалиями. У всех млекопитающих, кроме приматов и человека, имеется фермент уриказа, расщепляющий мочевую кислоту с образованием аллантоина, хорошо растворимого в воде (рис.).

Рис. Превращение мочевой кислоты в аллантоин.

Амфибии, птицы и рептилии, подобно человеку, лишены уриказы и экскретируют мочевую кислоту и гуанин в качестве конечных продуктов обмена.

Мочевая кислота является слабой кислотой. Содержание недиссоциированной формы и солей (уратов) зависит от рН раствора. При физиологических значениях рН у мочевой кислоты может диссоциировать только один протон из трёх (рК = 5,8), поэтому в биологических жидкостях присутствует как недиссоциированная кислота в комплексе с белками, так и её натриевая соль.

В сыворотке крови в норме содержание мочевой кислоты составляет 0,15-0,47 ммоль/л или 3-7 мг/дл. Ежесуточно из организма выводится от 0,4 до 0,6 г мочевой кислоты и уратов.

Нарушения обмена пуриновых нуклеотидов

Ураты значительно более растворимы, чем мочевая кислота: так, в моче с рН 5,0, когда мочевая кислота не диссоциирована, её растворимость в 10 раз меньше, чем в моче с рН 7,0, при котором основная часть мочевой кислоты представлена солями. Реакция мочи зависит от состава пищи, но, как правило, она слабокислая, поэтому большинство камней в мочевыводящей системе - кристаллы мочевой кислоты.

 

ГИПЕРУРИКЕМИЯ И ПОДАГРА

Когда в плазме крови концентрация мочевой кислоты превышает норму, то возникает гиперурикемия.

Вследствие гиперурикемии может развиться подагра - заболевание, при котором кристаллы мочевой кислоты и уратов откладываются в суставных хрящах, синовиальной оболочке, подкожной клетчатке с образованием подагрических узлов, или тофусов. К характерным признакам подагры относят повторяющиеся приступы острого воспаления суставов (чаще всего мелких) - так называемого острого подагрического артрита. Заболевание может прогрессировать в хронический подагрический артрит.

 

Поскольку лейкоциты фагоцитируют кристаллы уратов, то причиной воспаления является разрушение лизосомальных мембран лейкоцитов кристаллами мочевой кислоты. Освободившиеся лизосомальные ферменты выходят в цитозоль и разрушают клетки, а продукты клеточного катаболизма вызывают воспаление.

Общий фонд сывороточных уратов в норме составляет ~ 1,2 г у мужчин и 0,6 г у женщин. При подагре без образования тофусов (т.е. подагрических узлов, в которых накапливаются ураты натрия и мочевая кислота) количество уратов возрастает до 2-4 г, а у пациентов с тяжёлой формой болезни, сопровождающейся ростом тофусов, может достигать 30 г.

Подагра - распространённое заболевание, в разных странах ею страдают от 0,3 до 1,7% населения. А поскольку сывороточный фонд уратов у мужчин в 2 раза больше, чем у женщин, то они и болеют в 20 раз чаще, чем женщины.

Как правило, подагра генетически детерминирована и носит семейный характер. Она вызвана нарушениями в работе ФРДФ синтетазы или ферментов «запасного» пути: гипоксантингуанинили аденинфосфорибозилтрансфераз.

Подагра - тофусы

К другим характерным проявлениям подагры относят нефропатию, при которой наблюдают образование уратных камней в мочевыводящих путях.

Полиморфные варианты ФРДФ синтетазы

Активность ФРДФ синтетазы, катализирующей образование ФРДФ, строго контролируется пу-риновыми нуклеотидами. Мутации в гене ФРДФ синтетазы привели к появлению полиморфных вариантов фермента, которые характеризуются аномальным ответом на обычные регуляторные факторы: концентрацию рибозо-5-фосфата и пуриннуклеотидов. Как правило, наблюдается суперактивация фермента. Пуриновые нуклеотиды синтезируются со скоростью, почти независимой от нужд клетки. Это вызывает ингибиро-вание запасных «путей спасения», усиление катаболизма избыточного количества нуклеоти-дов, повышение продукции мочевой кислоты, гиперурикемию и подагру (табл. ).

Примерно у 40% больных одной из форм гликогеноза - болезнью Гирке (недостаточностью глюкозо-6-фосфатазы) сопутствующей патологией является подагра. Снижение способности печени секретировать глюкозу в кровь увеличивает использование глюкозо-6-фосфата в пентозофосфатном пути. Образуются большие количества рибозо-5-фосфата, которые могут стимулировать избыточный синтез, а следовательно, и катаболизм пуриновых нуклеотидов.

НЕДОСТАТОЧНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ «ЗАПАСНЫХ ПУТЕЙ» СИНТЕЗА ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ. СИНДРОМ ЛЁША-НИХЕНА

В ряде случаев причиной гиперурикемии, избыточной экскреции пуринов с мочой и подагры являются нарушения в работе ферментов «пути спасения» пуриновых оснований (табл.).

Таблица Гиперурикемия, вызванная дефектами в работе ферментов обмена пуриннуклеотидов

 

 

Гипоксантингуанин фосфорибозилтрансфераза катализирует реакцию превращения гуанина и гипоксантина в соответствующие нук-леотиды (рис.). Обнаружены полиморфные варианты гипоксантин-гуанинфосфорибозил-трансферазы со сниженной ферментативной активностью, что:

•  уменьшает повторное использование пури-новых оснований, и они превращаются в мочевую кислоту;

•  увеличивает синтез пуриновых нуклеотидов de novo из-за слабого использования ФРДФ в реакциях реутилизации и увеличения его концентрации в клетке. Адениловые и гуаниловые нуклеотиды образуются в количествах, превышающих потребности клеток, а это способствует усилению их катаболизма.

Синдром Лёша-Нихена - тяжёлая форма гиперурикемии, которая наследуется как рецессивный признак, сцепленный с Х-хромосомой, и проявляется только у мальчиков.

 

Болезнь вызвана полным отсутствием активности гипоксантин-гуанинфосфорибозилтранс-феразы и сопровождается гиперурикемией с содержанием мочевой кислоты от 9 до 12 мг/дл, что превышает растворимость уратов при нормальном рН плазмы. Экскреция мочевой кислоты у больных с синдромом Лёша-Нихена превышает 600 мг/сут и требует для выведения этого количества продукта не менее 2700 мл мочи.

У детей с данной патологией в раннем возрасте появляются тофусы, уратные камни в моче-выводящих путях и серьёзные неврологические отклонения, сопровождающиеся нарушением речи, церебральными параличами, снижением интеллекта, склонностью к нанесению себе увечий (укусы губ, языка, пальцев).

В первые месяцы жизни неврологические расстройства не обнаруживаются, но на пелёнках отмечают розовые и оранжевые пятна, вызванные присутствием в моче кристаллов мочевой кислоты. При отсутствии лечения больные погибают в возрасте до 10 лет из-за нарушения функции почек.

Полная потеря активности аденинфосфо-рибозилтрансферазы не столь драматична, как отсутствие гипоксантин-гуанинфосфорибозил-трансферазы, однако и в этом случае нарушение повторного использования аденина вызывает гиперурикемию и почечнокаменную болезнь, при которой наблюдается образование кристаллов 2,8-дигидроксиаденина.

ЛЕЧЕНИЕ ГИПЕРУРИКЕМИИ

Основным препаратом, используемым для лечения гиперурикемии, является аллопуринол - структурный аналог гипоксантина (рис.).

Аллопуринол оказывает двоякое действие на обмен пуриновых нуклеотидов:

• ингибирует ксантиноксидазу и останавливает катаболизм пуринов на стадии образования гипоксантина, растворимость которого почти в 10 раз выше, чем мочевой кислоты. Действие препарата на фермент объясняется тем, что сначала он, подобно гипоксантину, окисляется в гидроксипуринол, но при этом

• остаётся прочно связанным с активным центром фермента, вызывая его инактивацию; с другой стороны, будучи псевдосубстратом, аллопуринол может превращаться в нуклео-тид по «запасному» пути и ингибировать ФРДФ синтетазу и амидофосфорибозил-трансферазу, вызывая торможение синтеза пуринов de novo. При лечении аллопуринолом детей с синдромом Лёша-Нихена удаётся предотвратить развитие патологических изменений в суставах и почках, вызванных гиперпродукцией мочевой кислоты, но препарат не излечивает аномалии в поведении, неврологические и психические расстройства.

ГИПОУРИКЕМИЯ

Гипоурикемия и возросшая экскреция гипоксантина и ксантина может быть следствием недостаточности ксантиноксидазы, вызванной нарушениями в структуре гена этого фермента, либо результатом повреждения печени.

Биосинтез пиримидиновых нуклеотидов

Фонд пиримидиновых нуклеотидов, подобно пуриновым нуклеотидам, в основном синтезируется из простых предшественников de novo, и только 10-20% от общего количества образуется по «запасным» путям из азотистых оснований или нуклеозидов.

ОБРАЗОВАНИЕ ПИРИМИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ DE NOVO

В отличие от синтеза пуринов, где формирование гетероциклического основания осуществляется на остатке рибозо-5-фосфа- та, пиримидиновое кольцо синтезируется из простых предшественников: глутамина, СО2 и аспарагиновой кислоты и затем связывается с рибозо-5-фосфатом, полученным от ФРДФ.

 

Рис. Строение аллопуринола и гипоксантина.

Процесс протекает в цитозоле клеток. Синтез ключевого пиримидинового нуклеотида - УМФ идёт с участием 3 ферментов, 2 из которых полифункциональны.

Образование дигидрооротата

У млекопитающих ключевой, регуляторной реакцией в синтезе пиримидиновых нуклеотидов является синтез карбамоилфосфата из глута-мина, СО2 и АТФ, в реакции катализируемой карбамоилфосфатсинтетазой II (КФС II), которая протекает в цитозоле клеток (рис. 10-12). В реакции NH2-группа карбамоилфосфата образуется за счёт амидной группы глутамина, что отличает эту реакцию от реакции синтеза карбамоилфосфата в митохондриях в процессе синтеза мочевины из CO2, NH3 и АТФ с участием КФС I.

Карбамоилфосфат, использующийся на образование пиримидиновых нуклеотидов, является продуктом полифункционального фермента, который наряду с активностью КФС II содержит каталитические центры аспартаттранскарбамои-лазы и дигидрооротазы. Этот фермент назвали «КАД-фермент» - по начальным буквам ферментативных активностей, которыми обладают отдельные каталитические домены этого белка. Объединение первых трёх ферментов метаболического пути в единый полифункциональный комплекс позволяет использовать почти весь синтезированный в первой реакции карбамо-илфосфат на взаимодействие с аспартатом и образование карбамоиласпартата, от которого отщепляется вода и образуется циклический продукт - дигидрооротат (рис. 10-13).

Отщепляясь от КАД-фермента, дигидрооротат подвергается дегидрированию NAD-зависимой дигидрооротатдегидрогеназой и превращается в свободное пиримидиновое основание - оротовую кислоту, или оротат.

Образование УМФ

В цитозоле оротат становится субстратом бифункционального фермента - УМФ-синта-зы, которая обнаруживает оротатфосфорибо-зилтранс-феразную и ОМФ-декарбоксилазную активности. Первоначально фосфорибозильный остаток от ФРДФ переносится на оротат и образуется нуклеотид - оротидин-5 -монофосфат (ОМФ), декарбоксилирование которого даёт уридин-5 -монофосфат (УМФ).

Таким образом, шесть последовательных реакций синтеза пиримидиновых нуклеотидов осуществляются тремя ферментами, которые кодируются в геноме человека тремя различными структурными генами.

Биосинтез УДФ, УТФ и цитидиловых нуклеотидов

УМФ под действием специфических нуклео-зидмонофосфат (НМФ) и нуклеозиддифосфат (НДФ) киназ превращается в УДФ и УТФ в результате переноса γ-фосфатного остатка АТФ на соответствующий субстрат.

НМФ-киназа катализирует следующую реакцию:

умф + атф → удф + адф, а НДФ-киназа:

удф + атф → утф + адф.

ЦТФ синтетаза катализирует амидирование УТФ (рис. 10-14), осуществляя АТФ-зависимое замещение кетогруппы урацила на амидную группу глутамина с образованием цитидин-5 -трифосфата (ЦТФ).

Рис. Синтез карбамоилфосфата.

Рис. 10-13. Биосинтез УМФ de novo.

Рис. Синтез ЦТФ из УТФ.

 

«ЗАПАСНЫЕ» ПУТИ СИНТЕЗА ПИРИМИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

Использование пиримидиновьгх оснований и нуклеозидов в реакциях реутилизации препятствует катаболизму этих соединений до конечных продуктов с расщеплением пиримидинового кольца. В ресинтезе пиримидинов участвуют некоторые ферменты катаболизма нуклеотидов. Так, уридинфосфорилаза в обратимой реакции может рибозилировать урацил с образованием уридина.

Урацил + Рибозо-1-фосфат → Уридин + Н3РО4.

Превращение нуклеозидов в нуклеотиды катализирует уридин-цитидинкиназа.

Часть ЦМФ может превращаться в УМФ под действием цитидиндезаминазы и пополнять запасы уридиловых нуклеотидов.

ЦМФ + H2O → УМФ + NH3.

Регуляция синтеза пиримидиновых нуклеотидов

Регуляторным ферментом в синтезе пири-мидиновых нуклеотидов является полифункциональный КАД-фермент. УМФ и УТФ ал-лостерически ингибируют, а ФРДФ активирует его карбамоилсинтетазную активность, тогда как активность аспартаттранскарбамоилазного домена ингибирует ЦТФ, но активирует АТФ (рис. 10-15).

Рис. Регуляция синтеза пиримидиновых нуклеотидов. КАД-фермент катализирует реакции 1, 2, 3; дигидрооротатдегидрогеназа - реакцию 4; УМФ син-тетаза - реакции 5 и 6; НМФ киназа - реакцию 7; НДФ киназа - реакцию 8; ЦТФ синтетаза - реацию 9.

Этот способ регуляции позволяет предотвратить избыточный синтез не только УМФ, но и всех других пиримидиновых нуклеотидов и обеспечить сбалансированное образование всех четырёх основных пуриновых и пиримидино-вых нуклеотидов, необходимых для синтеза РНК.

КАТАБОЛИЗМ ПИРИМИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

Уже говорилось о том, что цитидиловые нук-леотиды могут гидролитически терять аминогруппу и превращаться в УМФ. Когда от УМФ при участии нуклеотидазы (или фосфатазы) и уридинфосфорилазы отщепляются неорганический фосфат и рибоза, то остаётся азотистое основание - урацил. Аналогично расщепляются дезоксирибонуклеотиды, и из dЦМФ образуется урацил, а из dТМФ – тимин.

Пиримидиновые основания при участии ди-гидропиримидиндегидрогеназы присоединяют 2 атома водорода по двойной связи кольца с образованием дигидроурацила или дигидроти-мина. Оба гетероцикла могут взаимодействовать с водой в реакции, катализируемой дигидро-пиримидинциклогидролазой, и дигидроурацил превращается в β-уреидопропионовую кислоту, а дигидротимин - в β-уреидоизомасляную кислоту. Оба β-уреидопроизводных под действием общего для них фермента уреидопропионазы расщепляются с образованием СО2, NH4+ и β-аланина или β-аминоизомасляной кислоты соответственно.

β-Аланин обнаруживают в плазме крови и многих тканях. Он используется в мышцах на образование дипептидов: карнозина и анзерина. Под действием бактериальной микрофлоры кишечника β-аланин включается в пантотеновую кислоту, которая всасывается и используется на образование KoA.

Часть β-аланина и β-аминоизобутирата тран-саминируется с α-кетоглутаратом и даёт малонил полуальдегид или метилмалонил полуальдегид соответственно, которые превращаются в ма-лонил-КоА и сукцинил-КоА и используются в соответствующих метаболических путях, либо окисляются до СО2 и Н2О. Частично β-амино-изобутират экскретируется с мочой.

 

НАРУШЕНИЯ ОБМЕНА ПИРИМИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

Описано несколько нарушений, связанных со снижением активности ферментов обмена пиримидиновых нуклеотидов. Одно из них - оро-тацидурия - вызвано дефектом в работе второго бифункционального фермента синтеза нуклеоти-дов de novo - УМФ-синтазы, два других обнаружены в процессе катаболизма пиримидинов.

А. ОРОТАЦИДУРИЯ

Это единственное нарушение синтеза пирими-динов de novo. Оно вызвано снижением активности УМФ-синтазы, которая катализирует образование и декарбоксилирование ОМФ. Поскольку в эмбриогенезе от образования пиримидинов de novo зависит обеспечение синтеза ДНК субстратами, то жизнь плода невозможна при полном отсутствии активности этого фермента. Действительно, у всех пациентов с оротацидурией отмечают заметную, хотя и очень низкую активность УМФ-синтазы. Установлено, что содержание оротовой кислоты в моче пациентов (1 г/сут и более) значительно превосходит количество оро-тата, которое ежедневно синтезируется в норме (около 600 мг/сут). Снижение синтеза пирими-диновых нуклеотидов, наблюдающееся при этой патологии, нарушает регуляцию КАД-фермента по механизму ретроингибирования, из-за чего возникает гиперпродукция оротата.

Клинически наиболее характерное следствие оротацидурии - мегалобластная анемия, вызванная неспособностью организма обеспечить нормальную скорость деления клеток эритро-цитарного ряда. Её диагностируют у детей на том основании, что она не поддаётся лечению препаратами фолиевой кислоты.

Недостаточность синтеза пиримидиновых нуклеотидов сказывается на интеллектуальном развитии, двигательной способности и сопровождается нарушениями работы сердца и ЖКТ. Нарушается формирование иммунной системы, и наблюдается повышенная чувствительность к различным инфекциям.

Гиперэкскреция оротовой кислоты сопровождается нарушениями со стороны мочевы-водящей системы и образованием камней. При отсутствии лечения больные обычно погибают в первые годы жизни. При этом оротовая кислота не оказывает токсического эффекта. Многочисленные нарушения в работе разных систем организма вызваны «пиримидиновым голодом».

Рис. Катаболизм пиримидиновых оснований. 1 - дигидропиримидиндегидрогеназа; 2 - дигидропи-римидинциклогидролаза; 3 - уреидопропионаза.

Для лечения этой болезни применяют уридин (от 0,5 до 1 г/сут), который по «запасному» пути превращается в УМФ.

Уридин + АТФ → УМФ + АДФ.

Нагрузка уридином устраняет «пиримидино-вый голод», а поскольку из УМФ могут синтезироваться все остальные нуклеотиды пиримиди-нового ряда, то снижается выделение оротовой кислоты из-за восстановления механизма рет-роингибирования КАД-фермента. Для больных оротацидурией лечение уридином продолжается в течение всей жизни, и этот нуклеозид становится для них незаменимым пищевым фактором.

Кроме генетически обусловленных причин, оротацидурия может наблюдаться:

•  при гипераммониемии, вызванной дефектом любого из ферментов орнитинового цикла, за исключением карбамоилфосфатсинтетазы I. В этом случае карбамоилфосфат, синтезированный в митохондриях, выходит в цитозоль клеток и начинает использоваться на образование пиримидиновых нуклеоти-дов. Концентрация всех метаболитов, в том числе и оротовой кислоты, повышается. Наиболее значительная экскреция оротата отмечается при недостаточности орнитин-карбамоилтрансферазы (второго фермента орнитинового цикла);

•  в процессе лечения подагры аллопурино-лом, который превращается в оксипури-нолмононуклеотид и становится сильным ингибитором УМФ-синтазы. Это приводит к накоплению оротовой кислоты в тканях и крови.

НАРУШЕНИЯ КАТАБОЛИЗМА ПИРИМИДИНОВ

Известны нарушения в работе 2 ферментов этого метаболического пути.

При недостаточности пиримидин-5'-нуклеотидазы нарушаются отщепление неорганического фосфата от пиримидиновых мононуклеотидов и образование нуклеозидов.

Неактивная изоформа пиримидин-5'-нуклеотидазы обнаружена в эритроцитах. В результате наблюдается накопление пиримидиновых НТФ, которые ингибируют пентозофосфатный путь превращения глюкозы и тем самым создают предпосылки к гемолизу эритроцитов.

Дигидропиримидиндегидрогеназа - скорость-лимитирующий фермент катаболизма пиримидинов. Нарушение работы этого фермента сопровождается отклонениями в функционировании нервной системы и диагностируется на основании повышения уровня свободных пиримидинов: урацила и тимина в плазме крови.

Оротацидурия - редкое наследственное заболевание, при котором в результате мутации в гене второго полифункционального фермента нарушается превращение оротата в УМФ. С мочой выделяется до 1,5 г оротата (в 1000 раз больше, чем в норме). Клинически заболевание проявляется в виде мегалобластной анемии, нарушений работы ЖКТ, сердца, интеллектуального развития и двигательной способности. Высокие концентрации оротата в крови и тканях нетоксичны для организма, а указанные симптомы возникают в результате неспособности организма из-за «пиримидинового голода» обеспечить нормальную скорость синтеза нуклеиновых кислот и увеличения числа клеток. Наиболее характерным следствием оротацидурии является мегалобластная анемия, вызванная снижением скорости деления клеток эритроцитарного ряда. Для лечения этой болезни используют уридин или цитидин в дозах от 0,5 до 1 г/сут, которые с помощью уридинцитидинкиназы превращаются в УМФ или ЦМФ в обход нарушенной реакции. Полифосфорные производные полученных нуклеотидов - УТФ и ЦТФ - ингибируют регуляторные ферменты синтеза пиримидиновых нуклеотидов de novo и снижают синтез и выведение оротата с мочой.

 

БИОСИНТЕЗ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ

Синтез дезоксирибонуклеотидов идёт с заметной скоростью только в тех клетках, которые вступают в S-фазу клеточного цикла и готовятся к синтезу ДНК и делению. В покоящихся клетках дезоксинуклеотиды практически отсутствуют. Все дезоксинуклеотиды, кроме тимидиловых, образуются из рибонуклеотидов путём прямого восстановления ОН-группы у второго углеродного атома рибозы в составе рибонуклеозидди-фосфатов до дезоксирибозы. Тимидиловые нук-леотиды синтезируются из сУМФ особым путём с участием N5, N10-метилен-Н4-фолата.

А. РИБОНУКЛЕОТИДРЕДУКТАЗНЫЙ КОМПЛЕКС

Реакцию восстановления НДФ в дезокси-производные катализирует рибонуклеотидредуктазный комплекс, в состав которого входят: собственно рибонуклеотидредуктаза (РНР), белок тиоредоксин и фермент тиоредоксинредуктаза, обеспечивающий регенерацию восстановленной формы тиоредоксина (рис.).

Рис. Восстановление рибонуклеозиддифосфатов в 2'-дезоксирибонуклеозиддифосфаты. 1 - рибо-нуклеотидредуктаза (РНР); 2 - тиоредоксинредуктаза.

Рибонуклеотидредуктаза - олигомерный белок, состоящий из двух В1- и двух В2-субъединиц, и содержит негеминовое железо в качестве кофактора. Непосредственным донором водорода в реакции восстановления рибозы служит низкомолекулярный белок тиоредоксин. В рабочую часть этого белка входят 2 SH-группы, которые, отдавая водород, окисляются с образованием дисульфидного мостика. Второй фермент комплекса - тиоредоксинредуктаза - катализирует гидрирование окисленного тиоредоксина с использованием NADPH.

При участии комплекса РНР образуются: dАДФ, dГДФ, dУДФ и dЦДФ, которые с помощью НДФ-киназ превращаются в дНТФ, 3 из которых (кроме дУДФ) непосредственно используются в синтезе ДНК.

дНДФ + АТФ → дНТФ + АДФ.

БИОСИНТЕЗ ТИМИДИЛОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

Тимидин-5'-монофосфат (дТМФ) образуется из дУМФ в реакции, катализируемой тимиди-латсинтазой (рис. 10-18). Донором метильной группы, появляющейся в 5-положении пири-мидинового кольца в молекуле дТМФ, служит кофермент тимидилатсинтазы - N5, N10-метилен-Н4-фолат. С помощью этого кофермента в молекулу дУМФ включается метиленовая группа и восстанавливается в метильную, используя 2 атома водорода от Н4-фолата.

Образование субстрата тимидилатсинтазной реакции - дУМФ осуществляется двумя путями (рис. 10-19):

•  дефосфорилированием дУДФ;

•  гидролитическим дезаминированием дЦМФ с помощью дЦМФ дезаминазы. дЦМФ получается при дефосфорилировании дЦДФ - одного из продуктов рибонуклеотидредуктазной реакции. В организме человека это основной путь образования дУМФ.

Рис. Синтез дТМФ из дУМФ.

Рис. Образование ТТФ из дЦДФ и дУДФ. 1 - дЦМФ дезаминаза; 2 -тимидилатсинтаза; 3 - дНМФ-и дНДФ киназы; 4 - дигидрофолатредуктаза; 5 - серингидроксиметилтрансфераза.

 

Скорость синтеза дТМФ зависит также от количества второго субстрата тимидилатсинта зной реакции - N5, N10-метилен-Н4-фолата, пополнение запасов которого осуществляется при участии 2 ферментов: дигидрофолатредуктазы, которая с участием NADPH восстанавливает Н2-фолат в Н4-фолат, и серин гидроксиметил-трансферазы, осуществляющей перенос β-гид-роксиметиленовой группы серина на Н4-фолат (см. раздел 9). У человека дТМФ образуется, главным образом, из дЦДФ.

 «ЗАПАСНЫЕ» ПУТИ СИНТЕЗА ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ

В быстроделящихся клетках наряду с синтезом дезоксинуклеотидов с помощью рибонуклео-тидредуктазного комплекса и тимидилатсинтазы активируются реакции, обеспечивающие повторное использование тимина и дезоксицитидина в реакциях, катализируемых ферментами «запасных» путей и обратимых реакций катаболизма. Под влиянием тимидинфосфорилазы протекает следующая реакция:

Тимин + Дезоксирибоза-1-фосфат → Тимидин + H3PO4

Тимидинкиназа катализирует реакцию:

Тимидин + АТФ → дТМФ + АДФ.

Дезоксицитидинкиназа катализирует реакцию образования дЦМФ:

Дезоксицитидин + АТФ → дЦМФ + АДФ.

РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ

Рибонуклеотидредуктаза, тимидилатсинтаза и тимидинкиназа - индуцируемые ферменты, их количество в клетке регулируется на генетическом уровне по механизму индукции и репрессии. Синтез этих белков начинает нарастать в G1-пе-риоде, достигает максимума во время активного синтеза ДНК, снижаясь практически до нуля в G2- и М-периоды клеточного цикла.

В то же время активность РНР подвержена сложной аллостерической регуляции, с помощью которой достигается сбалансированное образование всех дНДФ.

РНР осуществляет последовательное восстановление всех рибонуклеозиддифосфатов. Первыми восстанавливаются пиримидиновые нуклеотиды, а последним - дАДФ. дАДФ фосфорилируется в дАТФ, накопление которого полностью прекращает восстановление всех остальных рибонуклео-зиддифосфатов.

НАРУШЕНИЯ В РАБОТЕ РНР, ВЫЗВАННЫЕ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ ФЕРМЕНТОВ КАТАБОЛИЗМА ПУРИННУКЛЕОЗИДОВ

Аденозиндезаминаза (АДА) и пуриннуклеозид-фосфорилаза (ПНФ) участвуют в превращении пуриновых нуклеозидов в азотистые основания. Их недостаточность сопровождается развитием тяжёлых форм иммунодефицита.

Недостаточность аденозиндезаминазы. АДА катализирует гидролитическое дезаминирование аденозина и дезоксиаденозина:

Аденозин + Н2O → Инозин + NH3,

Дезоксиаденозин + Н2O → Дезоксиинозин + NH3.

Фермент АДА обнаружен во многих органах и тканях, однако его недостаточность имеет наиболее тяжёлые последствия для клеток лим-фоцитарного ряда. Низкая активность этого фермента нарушает пролиферацию и созревание Т- и В-лимфоцитов и сопровождается тяжёлыми формами клеточного и гуморального иммунодефицита. Дети, страдающие этой патологией, как правило, погибают в раннем возрасте от бактериальных, вирусных или грибковых инфекций.

Столь тяжёлые последствия недостаточности АДА для клеток лимфоцитарного ряда объясняют тем, что при снижении скорости дезаминирова-ния адениловых и дезоксиадениловых нуклео-тидов в клетках увеличивается концентрация дАТФ, который ингибирует РНР. Это нарушает синтез всех дНТФ и лишает клетки субстратов для синтеза ДНК. Для нелимфоцитарных клеток недостаточность АДА не сопровождается нарушениями метаболизма в связи с тем, что в них активно работает фосфатаза дАТФ, которая предотвращает накопление основного ингибитора РНР - дАТФ.

Фермент обладает групповой субстратной специфичностью и использует в качестве субстратов некоторые производные аденозина, которые применяются в терапии онкологических и противовирусных заболеваний (аденозинара-бинозид, формицин).

Недостаточность пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ). ПНФ катализирует фосфоролиз пуриновых рибо- и дезоксирибонуклеозидов с освобождением азотистых оснований и рибозоили дезоксирибозо-1-фосфата. Субстратами служат гуанозин, дезоксигуанозин и инозин.

Нуклеозид + Н3РС4 → Азотистое основание + Рибозо-1-фосфат.

Фермент обнаружен во многих органах и тканях, но особенно активен в клетках-предшественниках Т-лимфоцитов в процессе их созревания в тимусе. При наследственной недостаточности пуриннуклеозидфосфорила-зы, вызванной генными мутациями, в крови снижается образование и количество зрелых Т-лимфоцитов. Нарушение созревания Т-лим-фоцитов вызвано тем, что в этих клетках высокой активностью обладает дезоксигуанозинкиназа, а это приводит к накоплению дГТФ в концентрациях, которые, подобно дАТФ, ингибируютРНР.

У детей снижен клеточный иммунитет, хотя гуморальный иммунитет не страдает, так как в В-лимфоцитах дезоксигуанозинкиназа малоактивна и накопления дГТФ в токсических концентрациях не отмечают.

Болезнь, вызванная недостаточностью ПНФ, характеризуется более лёгким течением, чем болезнь, обусловленная дефицитом АДА.

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ

Синтезировано очень много аналогов дНТФ, которые включаются ДНК полимеразами в ДНК и ингибируют репликацию. К числу мощных противоопухолевых препаратов принадлежит 5-фторурацил (5-FU) - аналог урацила.

В организме по «запасным» путям 5-FU превращается в 5-F-УМФ либо в реакции, катализируемой оротатфосфорибозилтрансфе-разой, либо через промежуточное образование нуклеозида и последующее фосфорилирование. Превращаясь в нуклеозиддифосфат, 5-FU может участвовать в реакции, катализируемой РНР, и восстанавливаться в соответствующее дезокси-производное. Под действием фосфатазы 5-F-

дУДФ снова теряет фосфат, и образующийся 5-F-дУМФ связывается с тимидилатсинтазой и N5, N10-метилен-Н4-фолатом, образуя комплекс, напоминающий промежуточное соединение в реакции превращения дУМФ в дТМФ. Тими-дилатсинтаза оказывается полностью блокированной, и синтез дТМФ прекращается:

Цитозинарабинозид (или цитарабин) представляет собой соединение, в котором остаток рибозы замещён на стериоизомер - арабинозу. Оно используется в химиотерапии рака, в частности, при острой миелоцитарной лейкемии.

В организме препарат может превращаться в дНТФ, ингибировать ДНК полимеразы и снижать скорость репликации.

Аналоги фолиевой кислоты. В обмене нуклеотидов производные Н4-фолата как доноры одно-углеродных групп участвуют в формировании пуринового гетероциклического кольца и в ключевой реакции синтеза дТМФ из дУМФ, катализируемой тимидилатсинтазой.

В последнем случае N5, N10-метилен-Н4-фолат служит донором метильной группы и в ходе реакции превращается в Н2-фолат. Для активного синтеза тимидиловых нуклеотидов Н2-фолат должен повторно использоваться, проходя стадию восстановления в Н4-фолат

Метотрексат и аминоптерин - структурные аналоги фолиевой кислоты - ингибируют дигидрофолатредуктазу и таким образом нарушают синтез пуриновых нуклеотидов и превращение дУМФ в дТМФ, снижая внутриклеточную концентрацию субстратов синтеза ДНК и РНК. Препараты широко используют в химиотерапии опухолей.

АНТИВИРУСНЫЕ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ

Азидотимидин (АZТ, или зидовидин) представляет собой мощный противовирусный препарат, применяющийся в лечении инфекций, которые сопровождают приобретённые формы иммунодефицита. Будучи структурным аналогом тимидина, препарат имеет в 3'-положении дезоксирибозы азидогруппу.

AZT может фосфорилироваться и с помощью ДНК-полимераз включаться в растущую молекулу ДНК. Однако присутствие в З'-положении дезоксирибозы азидогруппы делает синтезирующиеся молекулы ДНК не способными к последующему удлинению. В результате образование новых молекул ДНК прекращается.

Важно, что фосфорилированные производные АZТ утилизируются более эффективно вирусной ДНК-полимеразой или так называемой обратной транскриптазой, чем ДНК-полимеразами эука-риотов, поэтому препарат наиболее эффективно влияет на размножение вирусов и, в частности, ретровируса, вызывающего ВИЧ-инфекцию.

5-Йоддезоксиуридин используют в терапии кератитов и поражений роговицы глаза вирусом герпеса.

Азатиоприн в организме превращается в 6-меркаптопурин, который оказывает мощное им-муносупрессорное действие. Препарат широко используют в трансплантологии для предотвращения развития иммунологических реакций, вызывающих отторжение трансплантата.