ЗБУДНИК ТУБЕРКУЛЬОЗУ, ЙОГО ВЛАСТИВОСТІ, МЕТОДИ ВИЯВЛЕННЯ.

    Збудником туберкульозу є мікобактерія туберкульозу (МБТ) - патогенний мікроорганізм з роду Micobacterium сімейства Actinomycetacae (променисті гриби). Розрізняють 3 групи мікобактерій:
  • істинні мікобактерії - патогенні для людини;
  • кислотостійкі умовно-патогенні мікобактерії (атипові);
  • кислотостійкі сапрофіти.
        Серед істинних мікобактерій, залежно від патогенності для людини та різних видів тварин, виділяють такі типи:
  • M. tuberculosis - людський тип, збудник туберкульозу людини;
  • M. bovis - бичачий тип, збудник туберкульозу великої рогатої худоби;
  • M. africanum - африканський тип, виділений у західній тропічній Африці, йому притаманні риси двох попередніх типів.
        M. tuberculosis мають вигляд тонких, дещо вигнутих, гомогенних або зернистих паличок довжиною 0,8-5 мкм, товщиною 0,3-0,5 мкм. МБТ не утворюють спор і капсул. Грам-позитивні. Важливою їх властивістю є кислото-, луго-, спиртостійкість. МБТ - факультативні аероби, для їх нормального розвитку потрібен кисень. Розмноження відбувається шляхом простого ділення, рідше брунькуванням. Цикл простого ділення материнсь кої клітини на дві дочірні триває 20-24 години. Розрізняють популяції, які розмножуються швидко, повільно і знаходяться у латентному стані. Популяції МБТ із різною активністю мають різну чутливість до антибактеріальних препаратів.
        Мікробна клітина має мікрокапсулу, цитоплазматичну мембрану, цитоплазму з органелами (гранули, вакуолі, рибосоми), ядро(рис. 10) .
        Хімічний склад мікобактерій - вода (85,9%), білки, вуглеводи, ліпіди, мінеральні солі. Половину сухої речовини клітини складають білки - туберкулопротеїни, основні носії антигенних властивостей МБТ. Туберкулопротеїни входять до складу туберкуліну. Для МБТ, на відміну від інших мікроорганізмів, характерний високий вміст ліпідів (до 40%), які зумовлюють стійкість МБТ до кислот, лугів, спиртів. Із ліпідних фракцій найактивніша фосфатидна, вона викликає в інтактній легені специфічну тканинну реакцію з утворенням епітеліоїдних і гігантських клітин Пирогова-Лангханса. Носієм вірулентних властивостей МБТ є ліпідна фракція, яка має назву корд-фактор. Корд-фактор склеює МБТ, які ростуть на живильних середовищах, утворюючи коси та джгути.
        Туберкульоз у людей у 80-95% випадків спричинюють МБТ людського типу, в 10-20% - МБТ бичачого типу, який найчастіше виділяють у хворих - мешканців сільської місцевості з високим рівнем захворюваності на туберкульоз великої рогатої худоби. При зараженні бичачим типом МБТ здебільшого розвиваються позалегеневі форми туберкульозу: лімфатичних вузлів, кісток і суглобів, сечостатевої системи, мозкових оболонок.
        МБТ людського та бичачого типів можуть бути збудниками туберкульозу не тільки в людей, але й у великої рогатої худоби, кіз, свиней, рідше в коней, собак, кішок. На туберкульоз хворіють практично всі хребетні тварини. Збудником туберкульозу в птахів є M. avium. Для МБТ характерна значна стійкість у зовнішньому середовищі до фізичних і хімічних агентів. Без сонячного світла вони залишаються життєздатними у зовнішньому середовищі кілька місяців, дуже довго зберігаються у воді - до 5 місяців, на сторінках книг - протягом 3-х місяців, у вуличному пилу - до 10 днів. Однак під дією сонячних променів МБТ гинуть за 1,5 години, а при ультрафіолетовому опроміненні - через 2-3 хвилини. Кип'ятіння рідкого харкотиння вбиває МБТ за 5 хвилин. МБТ стійкі до іонізуючої радіації, але швидко руйнуються під дією ультразвукових хвиль. Звичайні дезинфікуючі речовини слабо діють на МБТ. Найефективніші дезинфікуючі препарати, які виділяють вільний активний хлор (3-5% розчин хлораміну, розчин хлорного вапна).
        Мінливість мікобактерій туберкульозу
    . Характерною властивістю МБТ є їх мінливість (поліморфізм). Під впливом зовнішнього середовища, змін умов існування змінюються морфологічні, культуральні, біологічні властивості МБТ. Так, крім типової паличкоподібної форми, МБТ можуть бути ниткоподібної, зернистої, кокової, гігантської форми з утворенням бруньок. Під дією протитуберкульозних препаратів можуть утворюватись ультрадрібні форми МБТ, які проходять через бактеріальні фільтри - фільтрівні форми. Фільтрівні форми підтримують тривалий хронічний перебіг туберкульозного запалення в організмі.
        Одним із видів мінливості є L-трансформація МБТ (рис. 11). Антибактеріаль ні препарати блокують синтез клітинної оболонки, в результаті чого МБТ частково втрачає клітинну стінку - утворюються L-форми збудника як один із варіантів захисту для виживання у несприятливих умовах. Вакцина БЦЖ в організмі дитини також переходить у L-форму, зумовлюючи тривалу підтримку імунітету. L-форми можуть мати вигляд куль, зерен, мають знижену вірулентність, не забарвлюються за Цілем-Нільсеном внаслідок втрати частини клітинної оболонки. Для їх культивування потрібні спеціальні живильні середовища. L-форми можуть тривало безсимптомно існувати в організмі (персистувати). За несприятливих умов відбувається реверсія L-форми в бактеріальну вірулентну форму, що зумовлює ендогенну реактивацію процесу і рецидив захворювання.
        Застосування антибактеріальних препаратів спричинює розвиток медикаментозної стійкості МБТ. Існує дві теорії виникнення стійкості МБТ до протитуберкульозних препаратів:
  • теорія адаптації;
  • теорія спонтанних мутацій.
        Згідно з теорією адаптації, розвиток стійкості є однією з форм мінливості бактеріальної клітини під впливом хіміопрепа ратів як варіант пристосування у несприятливих умовах.
        Згідно з другою теорією, в кожній популяції мікобактерій існують стійкі мутанти. Під впливом антибактеріальних препаратів пригнічується ріст чутливих збудників, а стійкі мутанти розмножуються.
        Існує кілька основних механізмів, що зумовлюють резистент ність бактеріальної клітини: нові шляхи обмінних процесів, які обходяться без блокованої туберкулостатиком обмінної ланки; збільшення продукції ферменту, що блокується даним препаратом; зменшення проникності бактеріальної клітини для хіміопрепаратів тощо.
        Розрізняють первинну і вторинну стійкість. Первинна стійкість - це стійкість МБТ у вперше виявлених хворих, які ще не лікувались. Вона виникає внаслідок зараження стійкими штамами МБТ від хворих на хронічні форми туберкульозу, які тривало отримували хіміопрепарати. Вона зустрічається в 1-14% вперше виявлених хворих.
        Вторинна стійкість виникає в процесі тривалої антибактері альної терапії і зустрічається значно частіше (40-50%). Розвиткові стійкості МБТ сприяють монотерапія, перерви в лікуванні, недостатні дози препаратів. Стійкість може бути до одного препарату (монорезистентність) або до кількох (полірезистентність).
        Крім стійкості, можливе виникнення залежності збудника від антибактеріальних препаратів, коли хіміопрепарат стає необхідним для росту та розвитку культури. Частіше це явище спостерігається стосовно стрептоміцину.
        Атипові мікобактерії
    (анонімні, паратуберкульозні) - кислотостійкі, умовно-патогенні мікобактерії, поширені у воді, грунті, на овочах. За певних умов, особливо при зниженні імунітету, можуть викликати в людини захворювання, подібні до туберкульозу, які об'єднуються поняттям мікобактеріози.
        За класифікацією Runyon, яка грунтується на ознаках пігментоутворення та швидкості росту, виділяють 4 групи атипових мікобактерій:
        I - фотохромогенні - утворюють пігментацію колоній на світлі (M. kansasii);
        II - скотохромогенні - найбільш поширена група - утворюють жовто-оранжевий пігмент у темноті (M. aquae, M. scrofulaceum);
        III - нефотохромогенні - мають слабку пігментацію або не пігментуються (M. avium, M. intracellularae, M. xenopi);
        IV - швидкоростучі (M. phlei, M. smegmatis, M. fortuitum, M. marinum).
        Частіше причиною мікобактеріозів є мікобактерії I і III груп. В організм людини вони потрапляють із пилом, водою, при контакті з ураженими тваринами та птахами. Збудникам и захворювання у людини вважають лише ті атипові мікобактерії, які повторно висівають із харкотиння при відсутності типових мікобактерій або виявляють специфічні антитіла в сироватці крові хворих. Атипові мікобактерії стійкі до ізоніазиду, чутливі до рифампіцину, піразинаміду. Вони часто бувають причиною мікобактеріозів у хворих на СНІД.
        Матеріалом для виявлення МБТ є харкотиння хворих на туберкульоз легень, промивні води бронхів. При позалегеневих формах туберкульозу досліджують спинномозкову рідину, плевральну рідину, ексудат із черевної порожнини, гній із нориць, сечу, кал, пунктат із лімфатичного вузла, тканину, отриману під час біопсії.
        Важливо правильно зібрати харкотиння. Необхідно зранку прополоскати рот і відкашляти вміст верхніх дихальних шляхів у стерильну плювальницю. При невеликій кількості харкотиння його можна збирати протягом доби. Для збільшення кількості харкотиння напередодні призначають відхаркувальні засоби або подразнювальні аерозольні інгаляції 15%-го розчину натрію хлориду в 1%-му розчині соди, які підсилюють секрецію бронхіальних залоз. При відсутності харкотиння досліджують промивні води бронхів.
        Методи виявлення МБТ

        1. Бактеріоскопічний:
  • пряма бактеріоскопія;
  • флотація;
  • люмінесцентна мікроскопія .
        2. Бактеріологічний (культуральний):
  • посів на живильне середовище .
        3. Біологічний .
        Пряма бактеріоскопія
    - один з основних методів виявлення МБТ, простий, загальнодоступний, швидкий.
        Пряму бактеріоскопію харкотиння можна здійснити в умовах будь-якої лабораторії. Недоліком методу є те, що МБТ можна виявити лише при їх значній кількості - 50 000-100 000 і більше мікробних тіл в 1 мл патологічного матеріалу.
        Методика забарвлення мазка за Цілем-Нільсеном грунтується на кислото-, луго-, спиртостійкості збудника - здатності МБТ після забарвлення фуксином утримувати барвник навіть після тривалого знебарвлення кислотою або спиртом, на відміну від іншої мікробної флори.
        Методика:
  • на предметному склі роблять тонкий мазок із харкотиння і висушують над полум'ям пальника;
  • на фіксований препарат накладають смужку фільтруваль ного паперу, зверху наливають розчин карболового фуксину й нагрівають над полум'ям пальника до появи парів;
  • змивають залишки фарби водою;
  • знебарвлюють мазок у 20%-му розчині сірчаної кислоти або в 3%-му солянокислому спирті до рожево-сіруватого кольору, промивають водою;
  • дофарбовують 30 секунд 0,025%-м розчином метиленового синього. Відеофрагмент МЕТОДИКА ЗАБАРВЛЕННЯ МАЗКА ЗА ЦІЛЕМ-НІЛЬСОНОМ
        На висушений мазок наносять краплю оливкової або рицинової олії й оглядають через імерсійну систему мікроскопа. Під мікроскопом МБТ мають вигляд паличок червоного кольору на синьому фоні препарату. Для підвищення імовірності знаходження МБТ дослідження харкотиння проводять не менше 3-х разів.
        Метод флотації
    грунтується на тому, що при збовтуванні водної суспензії харкотиння з вуглеводнем (ксилол, бензин, бензол, толуол) мікобактерії прилипають до крапель вуглеводню. Вуглеводень легший за воду і тому спливає на поверхню у вигляді піни, у якій концентруються мікобактерії (флотаційне кільце). Із флотаційного кільця беруть матеріал, з якого готують мазок за принципом товстої краплі (нашарування 3-4 мазків із попереднім висушуванням). Мазок забарвлюють за Цілем-Нільсеном. При застосуванні методу флотації МБТ знаходять на 10-15% частіше, ніж при звичайній бактеріоскопії.
        Люмінесцентний метод
    грунтується на здатності ліпідів МБТ сприймати люмінесцентні барвники, а потім світитися під ультрафіолетовими променями. Залежно від барвника, МБТ світяться яскраво-червоним кольором на зеленому фоні або золотисто -жовтим - на темно-зеленому. Застосовують такі барвники: акридин, суміш аураміну ОО з родаміном. Мазок оглядають під спеціальним люмінесцентним мікроскопом. Метод люмінесцентної мікроскопії підвищує можливість виявлення МБТ на 14-30%, порівняно з прямою бактеріоскопією , і на 8% - порівняно з флотацією (рис. 12).
        Бактеріологічний метод
    значно чутливіший, дозволяє виявити МБТ, якщо в 1 мл харкотиння знаходиться 20-100 мікробних тіл. Значною перевагою методу є можливість виділити чисту культуру МБТ, ідентифікувати їх, визначити чутливість до протитуберкульозних препаратів. Ріст МБТ на поживному середовищі свідчить про їх високу життєздатність. Недоліком методу є повільний ріст мікобактерій.
        Існують різні поживні середовища - тверді, напіврідкі, рідкі. Частіше застосовують тверді яєчні середовища - Левенштейна -Йенсена, Фінна-2, Гельберга, Петроньяні. До складу середовища Левенштейна-Йенсена входить: сольова основа - солі Mg, K, L-аспарагін, гліцерин, яєчна маса, 2%-й розчин малахітової зелені. Середовище Фінна-2 замість L-аспарагіну містить глутамінат натрію. На середовищі Фінна-2 ріст мікобактерій з'являється на кілька днів раніше, ніж на середовищі Левенштейна-Йенсена.
        Для пригнічення неспецифічної флори перед посівом харкотиння обробляють 2-6%-м розчином сірчаної кислоти або 4%-м розчином їдкого натрію, 10%-м розчином фосфату натрію. Пробірки з посіяним матеріалом вміщують у термостат при 37°С. Перші колонії з'являються на 18-30-й день культивування, максимально до 2-2,5 місяців. Тому матеріал витримують у термостаті 3 місяці з переглядом посівів кожні 7-10 днів. На твердих поживних середовищах МБТ ростуть у вигляді сухих безпігмент них R-колоній. На фоні хіміотерапії можуть виділятися культури з гладким вологим ростом (S-колонії) (рис. 13).
        Біологічний метод
    (зараження лабораторних тварин) дозволяє виявити МБТ при мінімальній кількості (5 мікробних тіл) в 1 мл харкотиння. Однак мікобактерії, стійкі до хіміопрепаратів, зокрема ізоніазиду , авірулентні для морських свинок. При застосуванні інтенсивної антибактеріальної терапії хворих, зараження тварин може дати негативні результати.
        Харкотиння або інший матеріал обробляють 3-4%-м розчином сірчаної кислоти для знищення неспецифічної мікрофлори, після чого ретельно промивають стерильним фізіологічним розчином від залишків сірчаної кислоти. Осад розчиняють у фізіологічному розчині і вводять морській свинці підшкірно у пахвинну ділянку. Для підвищення частоти виявлення МБТ можна вводити матеріал у яєчко; або одночасно із зараженням свинки вводити їй кортизон, який пригнічує захисні сили організму. При наявності у введеному свинці матеріалі вірулентних мікобактерій через 2 тижні в ділянці зараження з'являється інфільтрат, через місяць збільшуються лімфатичні вузли, через 3 місяці розвивається генералізований туберкульоз.
        Для біологічного визначення МБТ потрібні умови для утримання лабораторних тварин і тому в практичних лікувальних закладах його застосовують рідко.
        Знаходження МБТ у патологічному матеріалі хворого, зокрема в харкотинні, має велике значення для встановлення епідеміоло гічної небезпеки хворого. Кількість МБТ у мазку або колоній на поживному середовищі, їх зменшення у процесі хіміотерапії є орієнтовним показником ефективності лікування. Якщо кількість МБТ не зменшується, це може свідчити про розвиток стійкості й необхідність корекції комбінації хіміопрепаратів.
        Із метою встановлення наявностні або відсутності бактеріови ділення кожний хворий перед початком лікування підлягає комплексному бактеріологічному обстеженню:
  • три рази пряма бактеріоскопія харкотиння або промивних вод бронхів;
  • при негативних результатах - три рази дослідження методом флотації;
  • незалежно від результатів цих досліджень - три рази посів харкотиння на поживне середовище з визначенням медикамен тозної стійкості виділеної культури МБТ;
  • у процесі лікування дослідження повторюють один раз на місяць після попередньої відміни препаратів протягом 2-х днів - до припинення бактеріовиділення, а надалі - один раз на 2-3 місяці до закінчення основного курсу хіміотерапії.
        Бактеріовиділювачем вважають хворого, в якого знайдено МБТ будь-яким методом один раз за наявності клініко-рентгенологіч них ознак активності процесу, а при відсутності цих ознак - 2 рази будь-яким методом. У таких випадках джерелом виділення МБТ можуть бути ендобронхіт, прорив казеозного лімфатичного вузла в просвіт бронха або розпад невеликого вогнища, яке важко виявити рентгенологічно. Припинення бактеріовиді лення підтверджується не менше ніж двома послідовними негативними бактеріоскопіями та посівами з інтервалом 2-3 місяці.
        Визначення чутливості МБТ до протитуберкульозних препаратів
    має важливе значення для тактики хіміотерапії, контролю за ефективністю лікування і прогнозу захворювання. Зміна чутливості МБТ спостерігається до всіх туберкулостатиків. Чутливість МБТ до хіміопрепаратів визначається мінімальною концентрацією препарату, яка затримує ріст МБТ при стандартних умовах досліду. В бактеріологічних лабораторіях для визначення чутливості МБТ до протитуберкульозних препаратів застосову ється метод абсолютних концентрацій на твердому живильному середовищі Левенштейна-Йенсена. Отримують чисту культуру МБТ, виділену від хворого. Під час приготування твердого середовища до нього додають протитуберкульозні препарати в різних розведеннях . У пробірки з середовищем, які містять різну концентрацію препаратів, і в одну контрольну, без туберкулостатика, засівають суспензію культури МБТ (500 млн. мікробних тіл в 1 мл). Культуру вважають чутливою, якщо в пробірці з препаратом виросло менше 20 колоній при рясному рості в контролі. Якщо виросло більше 20 колоній, культуру вважають стійкою.
        Результати визначення чутливості і стійкості МБТ називають антибіограмою. Штами вважають стійкими, якщо вони дають ріст при таких концентраціях в 1 мл середовища: ізоніазид - 1 мкг, рифампіцин - 20 мкг, стрептоміцин - 5 мкг, етамбутол - 2 мкг, усі інші препарати - 30 мкг (рис. 14).
        Бактеріостатична активність крові (БАК)
    . Лікувальний ефект протитуберкульозних препаратів визначається їх бактеріоста тичною дією на МБТ у вогнищі ураження і пов'язаний не тільки з чутливістю збудника до хіміопрепаратів, але й з їх концентрацією у вогнищі ураження. Рівень хіміопрепаратів у вогнищі ураження залежить від концентрації їх у крові. БАК відображає достатність концентрації препаратів у крові хворого для пригнічення росту МБТ, які знаходяться в його організмі.
        БАК визначають різними методами. Один із них полягає в тому, що хворий приймає комбінацію препаратів, якими планують проводити лікування. У момент їх найвищої концентрації проводять забір крові. У пробірки з кров'ю, розведеною від 1:12 до 1:256, поміщують мазки харкотиння або культури МБТ, виділеної у цього ж хворого, і мікрокультивують у термостаті 10 днів. Ступінь БАК визначають за максимальним розведенням крові, де є повна затримка росту МБТ. Розведення 1:16 свідчить про низьку БАК, 1:256, 1:128 - високу БАК. Отримані результати дозволяють прогнозувати ефективність терапії й коригувати її.
        Для етіологічної ідентифікації туберкульозу на даний час застосовують також молекулярно-генетичні та імунологічні методи. Однією з найбільш достовірних ознак підтвердження наявності збудника туберкульозу є виявлення специфічних антигенів МБТ у патологічному матеріалі хворих (харкотиння, плевральна рідина, ліквор, сироватка крові). Мікобактерії та їх фільтрати - це складна комбінація антигенів, які представлені протеїнами, полісахаридами, ліпідами.
        Антигенні препарати культур МБТ застосовують для отримання специфічних сироваток і моноклональних антитіл при створенні діагностикумів, призначених для визначення мікобактеріальних антигенів у клінічному матеріалі. Найперспективні шими є імуноферментний та радіоімунний методи визначення мікобактеріальних антигенів, які грунтуються на застосуванні моноклональних антитіл.
        Молекулярно-генетичний метод полімеразної ланцюгової реакції полягає у виявленні в біологічному матеріалі ДНК мікобактерій. Навіть при мінімальній кількості мікробних клітин (5-10) у досліджуваному матеріалі за допомогою специфічних олігонуклеотидів-праймерів запускають синтез специфічних фрагментів ДНК у спеціальному циклотермостаті, які пізніше ідентифіку ють методом гельелектрофорезу. Вихідним матеріалом може бути харкотиння, лаважна, спинномозкова, плевральна рідини, вміст шлунка, тканини, знезаражені нагріванням із необмеженим терміном зберігання. Результати досліджень отримують через 3-4 години.
        У зв'язку з високою ціною діагностикумів і відсутністю необхідного обладнання , ці методи на даний час рідко використовуються в практичних лікувальних закладах.