Мікробіологія

Розділ 12. ПАТОГЕННІ КОРЕНЕБАКТЕРІЇ ТА БОРДЕТЕЛИ

Рід Corynebacterium об’єднує в собі грампозитивні паличкоподібні безспорові мікроорганізми з булавоподібними потовщеннями на кінцях. Звідси походить назва роду (coryna - булава). До нього входять види, які заселяють різні біотопи людей і тварин. Одні з них патогенні для людини - збудник дифтерії (Corynebacterium diphtheriae) та тварин - C. ulcerans; інші непатогенні, але подібні за морфологією (C. pseudodiphtheriticum, C. xerosis, C. bovis, C. lipophylicum та ін.). Вони є представниками нормальної мікрофлори шкіри, слизових оболонок, кишкового тракту. До роду Bordetella належать збудники коклюшу та паракоклюшу.

Збудник дифтерії (C. diphtheriae)

Уперше дифтерійні бактерії описали і виділили в чистій культурі Е. Клебс і Ф. Леффлер у 1883-1884 рр., дифтерійний екзотоксин отримали Е. Ру та А. Ієрсен (1888), протидифтерійну сироватку - Е. Берінг, Я. Бардах, Е. Ру (1892-1894). У 1923 р. Г. Рамон виготовив дифтерійний анатоксин.

Морфологія і фізіологія. Коринебактерії дифтерії мають досить характерну морфологію. Це прямі або трохи зігнуті тонкі грампозитивні нерухомі безспорові палички довжиною 1-8 мкм(рис. 12.1), шириною 0,3-0,8 мкм із невеликими булавоподібними стовщеннями на кінцях. На полюсах бактерійних клітин розташовані метахроматичні зерна волютину або зерна Бабеша-Ернста(рис. 12.2)(рис. 12.3). За хімічною природою вони належать до поліметафосфатів і є запасом поживних речовин. Найкраще ці зерна виявляють при забарвленні за методом Нейссера: цитоплазма забарвлюється в світло-коричневий, а зерна волютину - в темно-синій колір. Скупчення нуклеїнових кислот у цитоплазмі може надавати їм характерної смугастості (зеброподібної зернистості). У збудника дифтерії виявлено фімбрії, які зумовлюють адгезивність.

Бактерії в мазках виглядають досить характерно і нагадують купку розкиданих сірників. Взаємне розташування паличок також своєрідне: під гострим або прямим кутом, у вигляді латинських літер V, L, Y. У носоглотці часто знаходять псевдодифтерійні палички, коротші й товстіші, ніж дифтерійні, розташовані паралельно, у вигляді частоколу(рис. 12.4). Зерна волютину в них бувають рідко.

Останнім часом морфологія збудника дифтерії дуже змінилася. Поряд із типовими паличками в полі зору можна зустріти зернисті й незернисті, тонкі й товсті, гіллясті й нерозгалужені, паличкоподібні й кокоподібні форми. Така безмежна мінливість виникла під впливом антибіотиків, її обов’язково потрібно враховувати при лабораторній діагностиці дифтерії.

Інший патогенний представник C. ulcerans є природним патогеном великої рогатої худоби і викликає мастит у корів, однак може спричинити захворювання і в людей, особливо в сільській місцевості.

Збудник дифтерії добре росте в аеробних умовах на сироваткових середовищах Ру (згорнута кінська сироватка), Леффлера (сироватка з 1/3 цукрового бульйону) та на мартенівському бульйоні. Широко використовуються сироватковий і кров’яний телуритовий агар, середовище Клауберга та ін. На мартенівському бульйоні утворюється ніжна плівка, яка поступово товстішає, стає крихкою і опускається на дно. На згорнутій сироватці, навіть при густих посівах, колонії ізольовані, ніколи не зливаються, бугристі, нагадують шагренєву шкіру. Вони круглі, сухуваті, кремувато-жовтого кольору, матові, з трохи піднятим центром.

За характером росту на телуритових середовищах і деякими іншими ознаками збудник дифтерії поділяють на три біовари: gravis, mitis, intermedius. Біовар gravis утворює великі сірі колонії з радіальною зчерченістю і фестончатим краєм (“маргаритки”)(рис. 12.5), високотоксичний, не викликає гемолізу, розкладає крохмаль і глікоген. Колонії біовару mitis (рис. 12.6) малі, опуклі, чорні, гладенькі, токсичність їх менша, бактерії викликають гемоліз, але не розкладають крохмаль і глікоген. Біовар intermedius за своїми властивостями займає проміжне становище(рис. 12.7). Раніше біовар gravis виділяли при тяжких формах дифтерії, а mitis - при легких. Тепер така закономірність втрачена.

Дифтерійні бактерії розкладають глюкозу, мальтозу, галактозу, не ферментують сахарозу, виділяють цистиназу і не утворюють уреазу. Ці ознаки важливі для диференціації їх від інших коринеформних бактерій.

Токсиноутворення. Коринебактерії дифтерії утворюють сильний екзотоксин, який є основним фактором їх вірулентності. Крім токсину вони продукують гіалуронідазу і нейрамінідазу. Дифтерійний токсин - білок із молекулярною вагою 62000 дальтон(рис. 12.8). Він вибірково уражає м’язи серця, наднирникові залози, периферичну нервову систему. Синтез токсинів контролюють спеціальні tox+ гени(рис. 12.9). До складу екзотоксину входять гістотоксин, гемотоксин, некротоксин(рис. 12.10). Його силу вимірюють у мінімальних смертельних дозах. За 1 DLM приймають ту найменшу дозу токсину, яка при введенні в черевну порожнину гвінейським свинкам вагою 250 г викликає їх загибель на четверту добу. Існують токсигенні й нетоксигенні штами коринебактерій дифтерії. C. ulcerans також виділяє екзотоксин, але є штами, які не продукують його.

Дифтерійний токсин нестійкий, він швидко інактивується при кімнатній температурі, від дії світла, кисню, повітря, різних хімічних речовин. При дії 0,3-0,4 % формаліну при температурі 38-40 °C протягом місяця він перетворюється в неотруйну сполуку - анатоксин. Останній зберігає імуногенні властивості й використовується для імунізації людей. Він входить до складу різних вакцин.

Антигенна структура. У дифтерійних бактерій виявлені як термостабільні, так і термолабільні антигени, за якими вони поділяються на 11 сероварів, але всі вони продукують однаковий екзотоксин, який нейтралізує будь-яка антитоксична протидифтерійна сироватка.

Екологія. Основний хазяїн коринебактерій дифтерії - хвора людина і бактеріоносій. Збудник локалізується переважно в рото- і носоглотці. Захворювання передається, в основному, повітряно-краплинним шляхом, але може бути зараження і через посуд, іграшки, книги й інші предмети вжитку, а також харчові продукти, контаміновані збудниками. Важливе значення у виникненні й розповсюдженні хвороби мають дифтерійні бактеріоносії. Виділені від хворих і носіїв коринебактерії дифтерії зберігаються в зовнішньому середовищі декілька днів, у висушених плівках - значно довше. Стійкі до низьких і чутливі до високих температур, добре переносять висушування. Усі дезинфікуючі розчини в звичайних концентраціях (3-5 %) вбивають їх через 20-30 хв. Чутливі до пеніциліну, еритроміцину, тетрацикліну. Токсигенні штами більш чутливі до антибіотиків, ніж нетоксигенні.

Захворювання людини. Дифтерія - гостра інфекційна хвороба, яка характеризується фібринозним запаленням слизових оболонок зіва(рис. 12.11)(рис. 12.12), носа(рис. 12.13), гортані(рис. 12.14), токсичним ураженням серцево-судинної, нервової систем і наднирникових залоз. Частіше виникає в дітей від 2 до 8 років. Останнім часом дифтерія “подорослішала”. В Україні були численні випадки захворювань із тяжким перебігом у дорослих, які не мали імунітету. Інкубаційний період триває від 2 до 10 днів. Найчастіше виникає дифтерія зіва (98 %), рідко - носа, вуха, очей, шкіри, статевих органів. На місці вхідних воріт інфекції виникає запалення з утворенням сірувато-жовтої фібринозної плівки (diphthera - плівка), яка міцно спаяна з підлеглою тканиною. Якщо її зняти - тканина кровоточить. Інколи процес із глотки переходить на гортань, трахею, виникає набряк, розвивається асфіксія. Захворювання супроводжується загальною інтоксикацією організму. В кров можуть проникнути і самі бактерії (бактеріємія). Смерть може настати від ядухи або паралічу серця.

Імунітет. Після хвороби виникає антитоксичний імунітет, хоча можливі повторні випадки захворювання. Його формування залежить від накопичення в крові антитіл - антитоксинів. Коли їх кількість досягає 1/30 МО, такі діти несприйнятливі до дифтерії.

Лабораторна діагностика. Успіх бактеріологічного дослідження значною мірою залежить від своєчасного і правильного взяття матеріалу від хворого. Це повинен робити лікар або спеціально підготовлені середні медичні працівники. Матеріал з мигдаликів і носа беруть окремими стерильними сухими ватними тампонами натщесерце або не раніше, ніж через дві години після прийому їжі. У зв’язку з мінливістю морфології збудника дифтерії, бактеріоскопічне дослідження в сучасних умовах малокорисне. Основне значення має виділення чистої культури і визначення її токсигенності. Результати дослідження видають через 48-96 год. Діагноз дифтерії встановлює лікар. Мікробіологічне дослідження тільки підтверджує клінічний діагноз. Розпізнавання дифтерійного бактеріоносійства можливе лише за допомогою лабораторних методів. Детальніше ці питання викладені в матеріалах до практичного заняття.

Профілактика і лікування. Загальні профілактичні заходи зводяться до ранньої діагностики, госпіталізації хворих, виявлення бактеріоносіїв, проведення повноцінної дезинфекції приміщення і предметів вжитку. Основне значення має специфічна профілактика - активна імунізація людей дифтерійним анатоксином, який входить до складу багатьох вакцин: АКДП - адсорбована коклюшно-дифтерійно-правцева, АДП-М - адсорбований дифтерійно-правцевий анатоксин із зменшеним вмістом антигенів, АД-М - адсорбований дифтерійний анатоксин із зменшеним вмістом дифтерійного антигена.

Основний метод лікування - введення специфічної антитоксичної протидифтерійної сироватки. Її вводять методом дробної десенсибілізації. При легких формах дифтерії вводять 10000-20000 МО сироватки, при середній тяжкості - 40000-50000 МО, при тяжкій, гіпертоксичній формах - від 60000 до 120000 МО. При поєднанні дифтерії із стафіло- та стрептококовою інфекцією призначають антибіотики (пеніцилін, еритроміцин, тетрациклін) і сульфаніламідні препарати.

Бордетели

До роду Bordetella входять три види мікроорганізмів, патогенних для людини: B. pertussis - збудник коклюшу, B. parapertussis - збудник паракоклюшу і B. bronchiseptica – збудник бронхісептикозу. Всі вони мають подібні властивості, виділяються з верхніх дихальних шляхів і спричиняють схожі за клінічною картиною захворювання.

Збудник коклюшу

Коклюш (син.: кашлюк) - гостра інфекційна хвороба, яка характеризується катаральним запаленням дихальних шляхів і нападами спазматичного кашлю. Збудник коклюшу B. pertussis вперше виділили від хворої дитини Ж. Борде й О. Жангу в 1906 році.

Морфологія і фізіологія. Збудник коклюшу, як інші види бордетел, - невеликі грамнегативні овоїдної форми палички завдовжки 1-1,2 мкм і завширшки 0,3-0,5 мкм (рис. 12.5)(рис. 12.6). Спор не утворюють, капсули є тільки у B. pertussis, а джгутики - лише у B. bronchiseptica(рис. 12.17). Слабо забарвлюються аніліновими бавниками, трохи інтенсивніше на полюсах. Бордетели - суворі аероби, вибагливі до умов вирощування. Культивують їх на середовищі Борде-Жангу (картопляно-гліцериновий агар із кров’ю) або на казеїно-вугільному агарі (КВА). Колонії всіх видів гладенькі, блискучі, прозорі, опуклі, нагадують крапельки ртуті(рис. 12.18)(рис. 12.19). Виростають через 48-72 год. На кров’яному агарі колонії оточені зонами гемолізу.

Біологічні властивості бордетел дуже слабкі. Вони не розкладають білки і вуглеводи, не відновлюють нітрати, але виділяють каталазу.

Антигенна структура. Бордетели мають загальний термостабільний О-антиген, гемаглютинін, протективний антиген. Серед 14 виявлених компонентів специфічні антигени позначають арабськими цифрами: 1 властивий для B. pertussis, 12 - B. bronchoiseptica, 14 - B. parapertussis.

Токсиноутворення. Збудник коклюшу виділяє термолабільний білковий токсин, який діє на нервові рецептори дихальних шляхів, що викликає спазматичний кашель. Він також збуджує дихальний центр, спричиняє спазм м’язів дрібних бронхів.

Екологія. Основним біотопом бордетел є верхні дихальні шляхи хворої людини і бактеріоносія(рис. 12.20). Джерелом інфекції служить переважно хвора людина, яка виділяє збудник протягом 25-45 днів хвороби. Найбільш небезпечними є хворі на стерті й субклінічні форми та нерозпізнані бактеріоносії. Механізм передачі - повітряно-краплинний. Сприйнятливість до коклюшу дуже висока, особливо в дітей до 10 років.

Потрапляючи в навколишнє середовище, бордетели швидко гинуть від дії прямих сонячних променів і висушування. Кип’ятіння викликає їх загибель у перші секунди. Низькі температури вони також переносять погано. Дезинфікуючі розчини досить швидко інактивують їх.

Захворювання людини. Інкубаційний період триває 5-9 днів. Перебіг хвороби поділяють на три періоди: катаральний (2 тижні), спазматичний або конвульсивний (4-6 тижнів) і завершення (2-3 тижні).

Хвороба починається запаленням верхніх дихальних шляхів, незначним підвищенням температури. Потім з’являються кашель, нежить, чхання. Пізніше окремі покашлювання переходять у приступи кашлю, які набувають тривалого характеру(рис. 12.21). Після серії кашльових поштовхів настає форсований свистящий вдих. Це може повторюватися багато разів. Захворювання супроводжується такими ускладненнями, як ларингіт, бронхіт, пневмонія.

Імунітет. Після перенесення хвороби виникає стійкий і тривалий імунітет. Він носить гуморальний характер і зумовлений утворенням антитоксинів, аглютинінів, преципітинів, комплементзв’язуючих антитіл. Повторні випадки хвороби не виникають. Перехресний імунітет між захворюваннями, викликаними трьома видами бордетел, не розвивається.

Лабораторна діагностика. Матеріалом для дослідження є мокротиння або слиз із носоглотки, взятий спеціальним (зігнутим) тампоном. Можна зробити посів за методом “кашльових пластинок”: під час кашлю чашку Петрі з живильним середовищем тримають на відстані 10-15 см перед ротом. Збудник коклюшу можна виділити протягом перших двох тижнів хвороби. Культури виростають через 2-5 днів. Колонії на середовищі Борде-Жангу нагадують краплини ртуті. Види виділених культур визначають за морфологічними, культуральними, ферментативними й антигенними властивостями.

Із 10-12 дня захворювання проводять серологічну діагностику, використовують реакції аглютинації, зв’язування комплементу і непрямої гемаглютинації.

Профілактика і лікування. Для попередження виникнення захворювань важливе значення має рання діагностика й ізоляція хворих дітей протягом 30 днів від початку хвороби. Дезинфекцію не проводять, так як бордетели нестійкі в зовнішньому середовищі. Ослабленим дітям, які були в контакті з хворими, з профілактичною метою вводять 3 мл імуноглобуліну.

Для специфічної профілактики застосовують адсорбовану коклюшно-дифтерійно-правцеву (АКДП) вакцину. Перше щеплення роблять у віці 3 місяців, ревакцинацію - через 1,5-2 роки. Лікування проводять протикоклюшним імуноглобуліном і антибіотиками, з яких найбільш ефективними є левоміцитин, еритроміцин, ампіцилін і тетрациклін, але вони діють лише в катаральному і в перші дні спазматичного періоду хвороби.

Матеріали до практичного заняття

Оскільки середній медичний персонал часто забирає матеріал для мікробіологічного дослідження, необхідно детально вивчити методику забору. Відповідно до інструкцій, від хворих із підозрою на дифтерію забір матеріалу проводять протягом 3-4 год (не пізніше 12 год) після огляду лікаря і не раніше ніж через 2 год, після прийому їжі, бажано до початку лікування. Перед процедурою не можна полоскати горло розчинами антисептиків. Для взяття матеріалу використовують стерильні сухі ватні тампони на дерев’яних паличках, вміщених у пробірки. Матеріал із мигдаликів і носа беруть окремими тампонами при доброму освітленні з використанням шпателя, не торкаючись тампоном язика, слизової щік і зубів. Якщо є наліт на мигдаликах, матеріал необхідно брати на межі уражених і здорових тканин, злегка натискуючи на них тампоном. Для взяття матеріалу з носа використовують один тампон, який вводять спочатку в один, потім у другий носовий хід. Тампони доставляють у лабораторію не пізніше 3-х год після забору. Пробірки з тампонами надписують, вказуючи зів (З) і ніс (Н), на супровідному папері пишуть прізвище й ім’я хворого, його адресу, попередній діагноз, час взяття матеріалу. При дифтерії рідких локалізацій (очі, вуха, шкіра, рана, піхва) матеріал забирають окремим додатковим тампоном з уражених ділянок, а також із зіва та носа.

Первинна бактеріоскопія мазків із тампонів проводиться лише на вимогу лікаря і не стільки для виявлення дифтерійних паличок, а щоб не пропустити діагноз некротичної ангіни(рис. 12.22) Симановського-Плаута-Венсана, яку викликає асоціація B. fusiformis і спірохет(рис. 12.23). У такому разі повинен бути ще один тампон виключно для бактеріоскопії.

Матеріал із мигдаликів, носа й інших уражених ділянок засівають роздільно на поверхню кров’яного (сироваткового) телуритового агару або середовище Клауберга в чашках Петрі. Посів від одного хворого проводять на єдину чашку, використовуючи одну половину середовища для посіву з мигдаликів, а другу - з носа. При посіві з інших ділянок додають ще одну чашку. При посіві матеріал втирають у середовище на ділянці 2х1 см2, повертаючи тампон, а потім ним же засівають круговими рухами, втираючи в поверхню середовища. Такий метод дозволяє засіяти весь матеріал із тампона, отримати ізольовані колонії, що скорочує тривалість аналізу на одну добу. Для посіву використовують підігріті в термостаті (15-20 хв) середовища.

Коротка схема бактеріологічного аналізу виглядає так:

перший день - посів матеріалу на середовище й інкубування в термостаті при температурі 37 °С протягом 24-х год;

другий день - вивчення колоній, які виросли, постановка проб на токсигенність і цистиназу, пересів ізольованих колоній на скошений сироватковий агар;

третій день - облік проб на токсигенність і цистиназу; якщо вони позитивні - видають документовану відповідь про виділення токсигенних коринебактерій дифтерії; при негативних пробах вивчають біохімічні властивості чистої культури (ферментація глюкози, сахарози, крохмалю, сечовини);

четвертий день - облік проби на токсигенність у разі запізнення виділення чистої культури, пересів її для біохімічної ідентифікації, видача відповіді про виділення токсигенних чи нетоксигенних коринебактерій дифтерії із зазначенням біоварів;

п’ятий день - облік усіх посівів і проб, видача остаточної відповіді про культури, які виділені із запізненням.

Отже, основа мікробіологічної діагностики дифтерії - виділення чистої культури і визначення її токсигенності.

Визначення токсигенності проводять in vivo та in vitro. При першому варіанті двох морських свинок підшкірно заражають виділеною культурою, але напередодні одній з них вводять антитоксичну протидифтерійну сироватку. Заражена тварина гине, а та, якій ввели сироватку, залишається жива(рис. 12.24).

У лабораторній практиці токсигенність дифтерійних бактерій визначають переважно in vitro за допомогою методу імунопреципітації в агаровому гелі. Для цієї мети мікробіологічна промисловість випускає спеціальне сухе стандартне середовище для визначення токсигенності дифтерійних мікроорганізмів (ВТДМ)(рис. 12.25) і стандартні паперові диски, просочені антитоксичною протидифтерійною сироваткою і висушені.

На поверхню свіжовиготовленого середовища ВТДМ накладають паперові диски діаметром 6 мм. На відстані 6-7 мм від нього засівають навколо окремими бляшками п’ять культур, дві з них завідомо токсигенні (контроль). Цей метод оснований на здатності токсину (антигену) і сироватки (антитіла) дифундувати в агаровий гель і в місці їх оптимальних співвідношень утворювати білі лінії преципітації (рис. 12.26). Метод дуже економічний, за чутливістю не поступається біологічному, але результат відомий значно раніше (24 год).

Дифтерійне бактеріоносійство можна виявити лише бактеріологічним способом. Взяття матеріалу проводять описаним вище методом стерильними тампонами і висівають на скошений сироватковий агар. Через 24 год з культури виготовляють мазок, забарвлюють метиленовою синькою або за Нейссером. При виявленні типових за морфологією дифтерійних паличок встановлюють наявність бактеріоносійства.

Коринебактерії дифтерії не завжди мають типову морфологію. У таких випадках необхідно диференціювати їх від псевдодифтерійних бактерій і дифтероїдів, які населяють шкіру і слизові оболонки людини. Відмінні ознаки коринебактерій наведені в інструкції з бактеріологічної діагностики дифтерії.

Практична робота

1. Забір матеріалу із носа і зіва для проведення бактеріологічного дослідження на дифтерію.

2. Вивчити і замалювати морфологію збудника дифтерії в готових забарвлених препаратах-мазках.

3. Ознайомитись із препаратами, які використовують для лікування і профілактики дифтерії (антитоксична протидифтерійна сироватка, вакцини, антибіотики, сульфаніламідні препарати).

Питання для самоконтролю

1. Морфологічні й тинкторіальні особливості збудника дифтерії. Біовари та їх біологічні властивості.

2. Токсиноутворення дифтерійних паличок. Значення у розвитку захворювання. Шляхи передачі збудника.

3. Протидифтерійний імунітет. Значення вакцинації в профілактиці хвороби. Визначення рівня протидифтерійного імунітету в людини.

4. Методика і правила забору матеріалу у хворого та ідентифікація збудника. Значення проб на токсигенність.

5. Специфічна терапія дифтерії.

6. Збудник коклюшу. Біологічні властивості, шляхи передачі, особливості перебігу хвороби, методи мікробіологічної діагностики та профілактики коклюшу.

Ситуаційні задачі

1. У дитини з важкою формою ангіни із ротоглотки тампоном було взято матеріал і засіяно на телуритове середовище. Через добу на ньому виросли великі, з нерівними краями колонії чорного кольору. Мікроскопія мазка засвідчила метахроматичні властивості цих бактерій, що дозволило запідозрити дифтерію. Яким чином довести роль паличок у виникненні захворювання?

2. Протидифтерійний імунітет обумовлений достатнім рівнем антитоксинів у сироватці крові.

А. Яким чином визначити їх наявність?

Б. Що треба зробити при відсутності або низькому рівні антитоксинів?

3. У дитини протягом 9 днів спостерігались катаральні симптоми, на десятий день з’явився судорожний кашель при нормальній температурі. Приступи кашлю виникали на будь-які зовнішні подразники. Педіатр поставив діагноз “Коклюш” і для підтвередження призначив мікробіологічне дослідження.

Які методи мікробіологічної діагностики можна застосувати?

Відповіді

1. Поставити пробу на токсигенність.

2. А - поставити РНГА з еритроцитами, навантаженими дифтерійним анатоксином.

Б - імунізувати дифтерійним анатоксином.

3. Висіяти виділення хворого методом “кашльових” пластинок та ідентифікувати культуру. Поставити реакцію аглютинації або РЗК з сироваткою дитини.