Медицина

Розділ 3


Розділ 3. ФІЗІОЛОГІЯ БАКТЕРІЙ



   Фізіологія мікроорганізмів вивчає біохімічні й енергетичні процеси, що відбуваються в бактеріальній клітині й забезпечують відтворення її структурного матеріалу та енергетичні потреби.
   Бактерії є складними живими організмами, в яких відбуваються різноманітні біохімічні перетворення. Вони зумовлюють ріст, розмноження, продукцію ферментів, токсинів та інших біологічно активних речовин, відповідають за регуляцію функціональної активності клітин, їх високу пластичність і здатність адаптуватись до умов зовнішнього середовища.

Хімічний склад бактерій

   Як і всі живі істоти, бактерійна клітина складається з чотирьох основних елементів - азоту, вуглецю, водню, кисню. Вуглець складає 45-55 % сухого залишку клітини, кисень - 25-30 %, азот - 8-15 % і водень - 6-8 %. Ці органогени служать матеріалом, з якого побудовано всі складові компоненти клітини: нуклеїнові кислоти, білки, ліпіди, вуглеводи, численні ферментні системи тощо.
   Залежно від виду бактерії містять від 70 до 90 % води. Вона може знаходитись у вільному (в цитоплазмі) або зв’язаному стані. Вільна вода є середовищем, в якому відбувається розмаїття біохімічних перетворень (розщеплення й синтез речовин) внаслідок дії гідролітичних ферментів, в ній спостерігається рух іонів, вона виступає розчинником багатьох речовин, що надходять у клітину, забезпечує колоїдний стан цитоплазми.
   Зв’язана вода - також необхідний компонет цитоплазми, проте вона не може служити розчинником. Втрата води клітиною призводить до її загибелі. Якщо бактерію помістити в гіпертонічний розчин, вода починає виходити з неї, цитоплазма зморщується, відшаровується від стінки, набуває вигляду дрібної грудочки, а клітина гине.
   Сухий залишок становить 10-30 %. Він формується з білків, нуклеїнових кислот, ліпідів, вуглеводів, полісахаридів, низькомолекулярних органічних речовин і солей.
   Білок
складає до 55 % сухого залишку клітини. Його представлено простими та складними білками. Прості білки називають протеїнами. За своїм складом вони суттєво не відрізняються від білків еукаріотичних організмів. Основна їх маса міститься в цитоплазмі клітини, цитоплазматичній мембрані, клітинній стінці грамнегативних мікробів, нуклеоїді. Токсини збудників газової анаеробної інфекції, правця, ботулізму, фермент гіалуронідаза є простими білками.
   Складні білки - протеїди свою назву отримали за здатність сполучатися з іншими речовинами. Так, білки, зв’язані з нуклеїновими кислотами, одержали назву нуклеопротеїди, з вуглеводами - глікопротеїди, ліпідами - ліпопротеїди, залізом, міддю - хромопротеїди. Вони відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини. Так, нуклеопротеїди забезпечують суперспіралізацію нуклеїнових кислот; глікопротеїди входять до складу клітинної стінки, капсули й виконують захисну функцію, забезпечують особливості будови клітинних антигенів; ліпопротеїди зумовлюють токсичні властивості бактеріальних ендотоксинів, отже, вірулентність мікробів; хромопротеїди відповідають за дихальну функцію клітини, є переносниками кисню.
   Тонкі фізико-хімічні дослідження дозволили встановити, що в клітині нараховується понад 2,4 млн різноманітних білкових молекул 1850 видів.
   Нуклеїнові кислоти представлено дезоксирибонуклеїновою (ДНК) та рибонуклеїновою (РНК) кислотами. Їх вміст коливається в межах 25-30 % сухої маси. У клітині є дві молекули ДНК та понад 250 тисяч молекул РНК. Останні можна поділити на три групи: рибосомальні РНК, транспортні РНК і матричні (інформаційні) РНК. Матрична РНК - форма, що утворюється в процесі біосинтезу білка. Вона забезпечує передачу генетичної інформації на білок, тобто елонгацію (подовження) поліпептидних ланцюгів. Рибосомальні РНК входять до складу великих і малих субодиниць рибосом. Вони відрізняються від РНК еукаріотів за константою седиментації. Транспортні РНК здатні зв’язуватись із амінокислотами, що накопичуються в цитоплазмі, й доставляти їх до рибосом, на яких відбувається процес біосинтезу.
   Вуглеводи
становлять 12-20 % сухого залишку. Їх представлено різноманітними цукрами, багатоатомними спиртами, оліго- та поліозидами, полісахаридами, іншими сполуками. Їх роль у забезпеченні життєдіяльності клітини важко переоцінити, так як вони входять до складу будь-яких структур клітини. Прості цукри є субстратом, з яких синтезуються більш складні сполуки. Полісахариди різних бактерій відрізняються за своєю специфічністю. Вони зумовлюють антигенні властивості клітини, їх вірулентні (капсули пневмококів) властивості.
   Відмінності у будові бактеріальних полісахаридів лягли в основу розробки методів хемотаксономії мікробів, їх ідентифікації. Особливості складу полісахаридів оболонки дозволяють одержувати вакцини, специфічні діагностичні сироватки.
   У клітині міститься в середньому до 10 % ліпідів. Однак в окремих груп мікроорганізмів (мікобактерії, рикетсії) ця частка збільшується до 40 %. У грамнегативних бактерій в зв’язку з особливостями будови клітинної стінки їх у 2-5 разів більше, ніж у грампозитивних.
   В середньому в клітині є до 22 млн молекул різноманітних ліпідів. Представлено їх, в основному, жирними насиченими й ненасиченими жирними кислотами, ефірами жирних кислот і гліцерину, восками, фосфоліпідами. Вони зумовлюють захисні властивості клітини (кислотостійкість), її токсичні функції, беруть участь у метаболізмі.
   Важливою складовою частиною будь-якої мікробної клітини є мінеральні елементи. Вони входять до складу вітамінів, ферментів, білків і можуть знаходитись у вільному стані в цитоплазмі. Без них не обходяться біохімічні реакції. Загальна їх кількість у мікробах може досягати 2-4 % сухого залишку. Зокрема, сірка і фосфор, їх похідні за рахунок здатності утворювати макроергічні (багаті на енергію) зв’язки постачають клітину енергією. Калій і натрій необхідні для нормальної життєдіяльності бактерій, забезпечують функціонування натріє-калієвого насосу. Магній й кальцій здатні активувати багато ферментів; залізо - невід’ємний складник цитохромів.

Клітинний метаболізм

   Сукупність усіх біохімічних перетворень у клітині називається метаболізмом. Він відбувається за двома основними напрямками. Перший забезпечує синтез складних клітинних сполук із більш простих. Тому він одержав назву біосинтез, конструктивний метаболізм або анаболізм. Однак переважна більшість реакцій синтезу й розпаду потребує енергетичного забезпечення. Тому енергетичний метаболізм або катаболізм представляє собою потік реакцій, які супроводжуються накопиченням електрохімічної енергії, що потім використовується клітиною.
   Конструктивний та енергетичний метаболізм - тісно пов’язаний між собою комплекс перетворень, часто їх шляхи співпадають, і одні й ті ж речовини використовуються для різних потреб. У цьому випадку такі субстрати називаються амфіболітами, а шляхи - амфіболічними.
   Метаболічні цикли мікробів надзвичайно різноманітні. Вони здатні використовувати різні види енергії й численні вихідні субстрати для побудови власних структур. Саме цим зумовлюється убіквітарність їх розповсюдження.
   Конструктивний метаболіз прокаріотів
. Для того, щоб клітина могла існувати, повинен відбуватись постійний обмін речовин з навколишнім середовищем. У клітину ззовні мусить надходити пластичний матеріал, з якого вона синтезує всі необхідні їй молекули.
   У конструктивному метаболізмі провідна роль належить сполукам вуглецю, з якого побудовано всі живі організми. Залежно від того, який вуглець засвоюють бактерії, вони поділяються на дві групи: автотрофи і гетеротрофи.
   Автотрофи
(autos - сам, trophe - живлення) здатні синтезувати всі необхідні їм органічні сполуки з CO 2 як єдиного джерела вуглецю. Гетеротрофи (heteros - інший) - мікроорганізми, джерелом вуглецю для яких є органічні сполуки. Вони здатні споживати будь-які прості й складні вуглецеві сполуки - цукри, амінокислоти, багатоатомні спирти, парафіни та ін.
   Ступінь вираження гетеротрофії у бактерій може бути найрізноманітніша. Найвищу гетеротрофність мають прокаріотичні організми, які здатні жити тільки всередині живих клітин (рикетсії, хламідії). Їх метаболічні шляхи повністю залежать від організму хазяїна. Такі мікроорганізми називають облігатними (суворими) паразитами.
   Однак багато мікробів можна вирощувати на штучних живильних середовищах, до складу яких входять білки, пептиди, вітаміни, фрагменти нуклеїнових кислот. Такі форми бактерій, здатних рости поза клітинами людини або тварин при створенні необхідних умов, називають факультативними паразитами.
   Більшість бактерій, що населяють земну кулю (понад 99 %), належать до сапрофітів. Вони безпосередньо від живих організмів не залежать і живляться за рахунок мертвих органічних залишків.
   Мікроорганізмам необхідний азот для синтезу азотомістких сполук. Джерела його можуть бути різноманітними. Одні бактерії здатні засвоювати молекулярний азот повітря (бульбочкові мікроби), інші використовують різноманітні субстрати. Бактерії, як правило, засвоюють азот у відновленій формі - це солі амонію, сечовини, органічні сполуки (амінокислоти, пептиди). Однак окислені форми азотистих сполук (нітрати) також можуть бути засвоєні мікробами. У клітині вони відновлюються до аміаку за допомогою ферментів нітратредуктази й нітритредуктази.
   Дикі штами бактерій здатні синтезувати всі необхідні їм речовини з обмеженого числа органічних сполук, наприклад, глюкози та солей амонію. Вони називаються прототрофами. Окремі мікроорганізми (варіанти прототрофів) втратили здатність до синтезу деяких необхідних їм ростових факторів, отже не можуть рости на мінімальних живильних середовищах. Їх називають ауксотрофними організмами.
   Джерела енергії та донори електронів.
Залежно від джерела енергії, що засвоюють мікробні клітини, їх поділяють на фототрофи і хемотрофи.
   Фототрофні
бактерії здатні використовувати енергію сонячного світла. Їх інакше називають фотосинтезуючими бактеріями. Патогенних для людини серед них немає. Інші прокаріоти, які одержують енергію за рахунок окисно-відновних реакцій в субстратах, називаються хемотрофами.
   Для здійснення різноманітних реакцій клітині необхідні електрони. Речовини, які в процесах біохімічних перетворень віддають електрони, називаються донорами. Молекули, які одержують електрони, називаються акцепторами.
   Мікроорганізми, для яких джерелом електронів є неорганічні сполуки типу Н 2 , Н 2 S, NH 3+ , Fe +2 та інші, називаються літотрофами (litos - камінь). Інші бактерії, для яких донором електронів виступають органічні речовини, називаються органотрофами .
   Залежно від способу одержання енергії, донора електронів та джерела вуглецю для засвоєння можна виділити 8 основних типів прокаріотичних організмів: фотолітоавтотрофи й фотолітогетеротрофи, фотоорганоавтотрофи й фотоорганогетеротрофи, хемолітоавтотрофи й хемолітогетеротрофи, хемоорганоавтотрофи й хемоорганогетеротрофи.
   Мікроорганізми, які здатні викликати у людини захворювання, належать до хемоорганогетеротрофів .
   Бактерії, яким притаманний один із спосібів живлення, позначають як облігатні, а ті, які використовують два джерела енергії, - міксотрофи.
   Для здійснення своїх метаболічних перетворень і забезпечення життєдіяльності клітина потребує інші неорганічні сполуки. Так, сірка входить до складу деяких амінокислот (метіонін, цистеїн), вітамінів та кофакторів (біотин, ліпоєва кислота, кофермент А), а без фосфору неможливо синтезувати нуклеїнові кислоти, він необхідний компонент фосфоліпідів, коферментів.
   Мікроорганізми засвоюють сірку з природних джерел, де вона знаходиться у формі неорганічних солей (сульфатів, сульфідів) або елементарної сірки, а потреби у фосфорі задовільняються за рахунок засвоєння неорганічних фосфатів.
   Усі необхідні йони металів клітина одержує за рахунок неорганічних сполук. Деякі елементи (магній, кальцій, калій, залізо) потрібні в досить великих концентраціях. Потреби в інших (цинк, марганець, молібден, ванадій, кобальт) незначні. Проте їх роль у клітині надзвичайно різноманітна, так як вони входять до складу основних клітинних метаболітів, виконуючи життєво важливі функції.
   При культивуванні бактерій крім білків, жирів та вуглеводів, які надходять у клітину з навколишнього середовища, до середовищ додають речовини, які виконують функцію стимуляторів росту. Вони включаються до складу клітинних метаболітів, каталізують біохімічні перетворення. Такими факторами є деякі вітаміни (біотин, тіамін, пантотенова кислота, холін, ціанокобаламін, нікотинова та фолієва кислоти), пуринові та піримідинові основи, жирні кислоти, гемін, коензим ферменту дегідрогенази.
    Надходження речовин у клітину. Незважаючи на досягнення мікробіологічної науки у вивченні процесів обміну в бактеріальній клітині остаточно інтимні механізми транспорту поживних речовин в клітину і виведення метаболітів назовні не з’ясовано. Встановлено, що мікробам притаманний голофітний тип живлення, тобто вони здатні поглинати живильні речовини тільки в розчиненому вигляді.
   Однак деякі субстрати не розчиняються у воді (білки, полісахариди), або утворюють колоїдні розчини, які не проникають у клітину. В такому випадку клітинні екзоферменти, які виділяються в навколишнє середовище, викликають гідроліз цих субстанцій, розщеплюючи їх до більш простих і дрібних молекул і переводячи в розчинний стан.
   Виділяють декілька механізмів проникнення речовин. Пасивна дифузія функціонує тоді, коли створюється градієнт концентрації речовини всередині бактеріальної клітини та зовні. Вона відбувається пасивно, тому що не вимагає затрат енергії. Полегшена дифузія здійснюється за рахунок особливих білків - пермеаз, які містяться в цитоплазматичній мембрані. Цей процес також не вимагає енергетичного забезпечення. Однак більшість поживних речовин, метаболітів, іонів проникають у клітину за допомогою активного транспорту. Його також забезпечують білки-пермеази, але вони є високоспецифічними й здатні переносити тільки певні субстрати. Цей процес відбувається за рахунок енергії, яку генерує клітина, тому можливий перенос і проти градієнта концентрації речовини. Якщо цьому процесу передує певна хімічна модифікація молекули, його називають транслокацією хімічних груп. Виділяють також механізм іонного транспорту, при якому відбувається перенос у клітину окремих неорганічних іонів.
   Конструктивний метаболізм.
Обмін білків у мікроорганізмів відбувається за двома основними напрямками: розщеплення поліпептидів до амінокислот і біосинтетичні процеси, пов’язані з конструюванням нових молекул. Перший напрямок забезпечують ферменти екзопротеази, що виділяються в навколишнє середовище, та ендопротеази, які нагромаджуються в клітині. Кінцеві продукти - амінокислоти, - що утворюються під час цього процесу, можуть зазнавати дезамінування та декарбоксилювання, перетворюючись на аміак, вуглекислий газ, оксикислоти.
   Біосинтетичні процеси відбуваються за участю готових амінокислот, які трансамінуються або переамінуються. Деякі мікроорганізми здатні синтезувати амінокислоти з простих сполук азоту. Необхідно зазначити, що мікроорганізми, на відміну від клітин організму людини, здатні синтезувати незамінні амінокислоти - лізин, метіонін, триптофан.
   Вуглеводний обмін забезпечуєтся або гідролітичним розщепленням молекул з утворенням глюкози й мальтози або фосфоролізом. І в одному, і в іншому випадках процеси не супроводжуються вивільненням енергії. Це відбувається при бродінні - окисновідновних реакціях анаеробного розщеплення органічних речовин, головним чином, вуглеводів. Метаболіти, які утворюються під час бродіння, використовуються для біосинтетичних процесів. Продуктами бродіння є різні органічні кислоти (молочна, масляна, оцтова, мурашина), спирти (етиловий, бутиловий, пропіловий), ацетон, диоксид вуглецю, водень. Залежно від того, який основний продукт накопичується в середовищі, розрізняють молочнокисле, маслянокисле, мурашинокисле, спиртове та інші види бродіння. При бродінні вивільняється незначна частка енергії, яка накопичена в речовині. Як правило, на 1 молекулу субстрату утворюється 2 молекули аденозинтрифосфорної кислоти (АТФ).
   Синтез вуглеводів відбувається або з вуглекислого газу (автотрофи), або за рахунок вуглецемістких органічних сполук.
   Як було зазначено, ліпіди мікроорганізмів представлено насиченими та ненасиченими жирними кислотами, фосфоліпідами, стеринами, восками, каротиноїдами та іншими речовинами. Мікроорганізми здатні до синтезу вищих жирних кислот, який відбувається за участю особливих білків, що переносять ацильні фрагменти. Часто з цією метою клітини використовують метіонін. Синтезовані ліпіди включаються до складу фосфоліпідів. Розщеплення ліпідів відбувається за участю ліпаз та інших ліполітичних ферментів.
   Ферменти мікроорганізмів.
Усі біосинтетичні процеси та інші метаболічні перетворення в клітині відбуваються за участю особливих високоактивних біологічних каталізаторів, які називаються ферментами. Вони належать до 6 класів: гідролази (забезпечують реакції розщеплення за участю води), оксидоредуктази (каталізують різноманітні окисно-відновні реакції, беруть участь у процесах дихання), ізомерази (здійснюють перенос фосфатних груп у молекулах, спонукаючи процеси ізомеризації), трансферази (переносять аміногрупи, аденілові групи з одних субстратів на інші), ліази (каталізують реакції відщеплення хімічних груп негідролітичним шляхом), лігази (відповідають за синтез нових речовин, який відбувається за рахунок енергії АТФ).
   Здатність утворювати певні ферменти кодується клітинним геномом і є постійною ознакою бактерій. Так як бактеріальна клітина займає невеликий об’єм, у ній переважають адаптивні ферменти над конститутивними. Перша група ферментів синтезується тільки за умов наявності субстрату для їх дії. Ферменти другої групи постійно присутні в бактерії в певних концентраціях. Вони зумовлюють першочергові біосинтетичні потреби клітин.
   Клітина виділяє ферменти в навколишнє середовище (екзоферменти). Там вони здійснюють контактне позаклітинне перетравлювання речовин або пошкоджують тканини організму господаря. Ендоферменти локалізуються на цитоплазматичній мембрані, в периплазматичному просторі.
   Роль ферментативної діяльності мікроорганізмів важко переоцінити. Вони мають загальнобіологічне значення. Відома участь бактерій у кругообізі речовин у природі, формуванні родовищ корисних копалин (нафта, вугілля, поклади сірки). Мікроорганізми - прекрасні санітари довкілля. Вони здатні біодеградувати практично будь-які речовини, що забруднюють навколишнє середовище.
   Людина поставила мікробні ферменти собі на службу. Їх широко використовують у різних галузях хімічної, харчової, фармацевтичної, парфумерної промисловостей, сільському господарстві, медицині.
   Протеазами видаляють волосяний покрив зі шкір тварин, знімають желатиновий шар з кіноплівки. Ферменти, що забезпечують бродіння, використовуються для одержання бутанолу, ацетону, необхідних для проведення хроматографічних досліджень, етилового спирту, масляної кислоти. Кисломолочні продукти - кефір, йогурт, кисляк, кумис - також продукти діяльності бактерій бродіння.
   Мікроорганізми використовуються у виноробстві, виробництві пива, при виготовленні вершкового масла, силосуванні кормів, квашенні овочів. Із дріжджів одержують білково-кормові добавки для вигодовування худоби. Як живильне середовище використовують парафіни - відходи нафти.
   За допомогою мікроорганізмів та їх ферментних систем в медичній промисловості одержують гормони гідрокортизон, преднізолон, різноманітні алкалоїди. Пропіонібактерії, актиноміцети синтезують вітаміни (В 12 ). Зі стрептококів одержано фібринолізин, стрептодорназу і стрептокіназу, які руйнують тромби в кровоносних судинах.
   Оскільки здатність утворювати ферменти певної специфічності притаманна всім мікроорганізмам, це широко використовується в лабораторній практиці для ідентифікації бактерій. Її проводять за комплексом цукролітичних, протеолітичних, пептолітичних, ліполітичних та інших ферментів.
   Енергетичний метаболізм прокаріотів.
За своїм об’ємом реакції, що забезпечують клітину внутрішньою енергією, значно перевищують біосинтетичні процеси.
   Мікроорганізми можуть використовувати не всі форми енергії, що існують у природі. Вони здатні користуватись тільки енергією сонячного світла (фотосинтезуючі бактерії) та хімічною (хемотрофні мікроби). Недоступні для них ядерна, механічна та теплова енергії.
   Явище нагромадження енергії розглядається як перенос іонів водню шляхом окремого транспорту протонів та електронів: протони при цьому виділяються в навколишнє середовище, а електрони передаються на відповідні молекули-акцептори.
   Протягом своєї еволюції бактерії виробили три способи одержання енергії: бродіння, дихання і фотосинтез.
   При бродінні в анаеробних умовах у певних окислювально-відновних реакціях утворюються нестабільні молекули, фосфатна група яких містить багато вільної енергії. Вона переноситься на молекулу аденозиндифосфорної кислоти (АДФ), яка перетворюється в АТФ. Реакції, в яких енергія запасається на АТФ, одержали назву субстратного фосфорилювання. Відновлювач, який при цьому утворюється, (НАД· Н 2 , відновлений фередоксин), переносить електрони на ендогенний акцептор (піруват, ацетальдегід) або звільняється у вигляді водню.
   Окислення відбувається внаслідок переносу електронів через спеціальний електроннотранспортний ланцюг, локалізований на мембрані. Він складається з набору переносників і в більшості випадків спричиняє відновлення молекулярного кисню до Н 2 О.
   Основою фотосинтетичних процесів у представників мікробного світу є поглинання сонячної енергії різними пігментами: флавопротеїнами, хінонами, цитохромами і білками, що містять негемове залізо. Вони й забезпечують перенос електронів і, відповідно, вивільнення енергії.
   Енергія, яку генерує клітина, запасається у формі електрохімічного трансмембранного градієнта іонів водню - Dm н + або в молекулах АТФ.
   Прокаріоти містять декілька сполук із високоенергетичними фосфатними зв’язками - ацилфосфати, фосфоенолпіруват, аденозинфосфосульфат, а також сполуки з тіоефірним зв’язком - ацилтіоефіри. У цих речовинах одна з груп має великий енергетичний потенціал. Перенос її веде до розриву зв’язку, з’єднуючого з молекулою, отже, до різкого зменшення вільної енергії, накопиченої в клітині. Приєднання такої групи до молекули акцептора підвищує рівень його вільної енергії, переводячи молекулу в активовану форму, що здатна брати участь у біосинтетичних реакціях.
   Найголовніше місце в переносі хімічної енергії належить системі АТФ. Вона утворюється при субстратному та мембранозалежному фосфорилюванні. При цьому від субстрату відщеплюється фосфатна група і переноситься на молекулу АДФ. Вона містить два макроергічних зв’язки, які при гідролізі звільняють 31,8 кДж/моль енергії. Молекули АТФ вважають енергетичною валютою клітини, а малі розміри дозволяють їм легко дифундувати в ті ділянки клітини, де необхідна енергія. Підраховано, що для подвоєння клітинної маси молекула АТФ повинна біля 10000 разів брати участь у процесах гідролізу й синтезу.
   На прикладі E. coli визначено, скільки необхідно енергії, щоб синтезувався 1 г клітинної речовини. Це потребує 37 ммоль АТФ, із них 20 ммоль використовується на синтез білка, 7 ммоль - на синтез ДНК і РНК, 2 ммоль - для полімеризації цукрів. Решта іде на підтримання життєдіяльності - осмос, рух клітини тощо.
   Іншою універсальною клітинною енергією є енергія трансмембранного потенціалу Dm н + . Це здійснюється за допомогою спеціальної “петлі”, локалізованої в цитоплазматичній мембрані. Переносники хінони забезпечують рух двох атомів водню від внутрішньої сторони ЦПМ назовні. Потім цитохроми повертають в клітину два електрони, а протони вивільняються в зовнішнє середовище.
   При такому переносі назовні клітини накопичуються іони водню, середовище підкислюється, а в цитоплазмі їх число зменшується, і вона набуває більш лужного характеру. Виникає орієнтований поперек ЦПМ градієнт іонів водню. Оскільки Н + - хімічні частинки з позитивним зарядом, то їх накопичення з обох сторін ЦПМ викликає створення не тільки концентраційного градієнта часток, але й орієнтованого поперек мембрани електричного поля. Напруга потенціалу Dm н + досягає 200-250 мВ.
   Енергія трансмембранного потенціалу може розряджатись за участю локалізованого в мембрані протонного АТФ-синтетазного комплексу. Це створює можливість з АДФ та неорганічного фосфату без будь-яких проміжних сполук утворити молекули АТФ. Однак процес може проходити і в протилежному напрямку. Тоді при гідролізі АТФ зростає енергія Dm н + на ЦПМ.
   Таким чином, дані реакції є природними механізмами, які з’єднують процеси окислення з фосфорилюванням. Енергія, яка накопичується на мембрані, та енергія АТФ забезпечують різні потреби клітини. Перша поглинається ДНК при генетичній трансформації, зумовлює рух бактерій за допомогою джгутиків, забезпечує активний перенос речовин та іонів через мембрану, а енергія АТФ - синтетичні процеси в клітині.
   Але ні енергія Dm н + , ні АТФ не можуть нагромаджуватись і зберігатись в клітині достатньо довгий строк, адже тривалість життя молекули АТФ всього 1/3 с. Для консервування енергії прокаріоти створили механізм синтезу високополімерних молекул, полісахаридів, ліпідів або поліпептидів. Ці речовини упаковуються в спеціальні гранули, вкриваються оболонкою і зберігаються в неактивному стані.

Дихання бактерій

   Це один із шляхів біологічного окислення, який відбувається з утворенням молекул АТФ, тобто супроводжується нагромадженням енергії. Під час цього процесу одні речовини (органічні та неорганічні сполуки) служать донорами електронів і при цьому окислюються, акцепторами електронів виступають неорганічні сполуки, вони відновлюються. В одних мікроорганізмів кінцевим акцептором електронів виступає кисень, у інших - неорганічні сульфати, нітрати, карбонати.
   Л. Пастером було вперше помічено, що деякі мікроби одержують енергію без участі кисню. У 1863 р. він запропонував терміни “аероб” та “анаероб”.
   Сьогодні, залежно від умов одержання енергії (способу дихання), прокаріоти поділяються на ряд груп. Облігатні аероби - мікроорганізми, для оптимального росту яких необхідно 21 % кисню. До них належать збудники туберкульозу, чуми, холерний вібріон. На поверхні рідких живильних середовищ вони ростуть, як правило, у вигляді плівки. Облігатні анаероби - бактерії, які ростуть при відсутності вільного молекулярного кисню за рахунок процесів бродіння. Вони одержують кисень з органічних сполук у процесі їх метаболізму. Деякі з них не виносять навіть незначної кількості вільного кисню. Такими бактеріями є збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції, бактероїди, фузобактерії та ін. Окремі клостридії можуть бути аеротолерантними. Для культивування їх використовують спеціальні живильні середовища й апарати (анаеростати), в яких створюються анаеробні умови за рахунок поглинання кисню або заміни його індиферентними газами (азотом, воднем). Факультативні анаероби (факультативні аероби) пристосувались, залежно від умов середовища (наявності або відсутності кисню), переключати свої метаболічні процеси з використанням молекулярного кисню на бродіння та навпаки. Групу факультативних анаеробів формують численні представники родини кишкових бактерій (ешеріхії, сальмонели, шигели), стафілококи та деякі інші бактерії. Мікроаерофіли - особлива група мікробів, для яких концентрація кисню при культивуванні може бути зменшена до 2 %. Вищі його концентрації здатні затримувати ріст. Ця група представлена молочнокислими, азотфіксуючими бактеріями. Капнеїчними називають такі мікроорганізми, які потребують, крім кисню, ще й до 10 % вуглекислого газу. Типовими представниками є збудники бруцельозу бичачого типу.
   В облігатних аеробів кисень використовується як кінцевий акцептор електронів у реакціях, що каталізуються цитохромоксидазами та оксигеназами. У клітинах факультативних анаеробів також є цитохромоксидази, проте в облігатних анаеробів ферментів, які каталізують взаємодію з молекулярним киснем, немає.
   Детальне вивчення механізмів дихання у бактерій довело, що першими мікроорганізмами на земній кулі були анаероби, так як до виникнення фотосинтезуючих еукаріотів вміст кисню в атмосфері був незначним порівняно із сьогоденням. За розрахунками, щоб відбулось переключення механізму бродіння на аеробне дихання, достатньо було 0,2 % кисню в атмосфері (на сьогодні його концентрація становить 21 %). У свою чергу зростання вмісту кисню призвело до зміни характеру атмосфери із відновлювальної на окисну за рахунок відповідних реакцій. В умовах безкисневої атмосфери існував дефіцит акцепторів електронів, а з появою кисню ця проблема була розв’язана.

Ріст і розмноження бактерій

   Будь-яка жива істота здатна до росту та розмноження. Під ростом розуміють координоване відтворення бактеріальних структур і відповідно збільшення маси мікробної клітини. Розмноження - це здатність мікробів до самовідтворення, при цьому збільшується кількість особин у популяції на одиницю об’єму середовища
   Розмноження бактерій - складний процес, пов’язаний із синхронною взаємодією багатьох їх структур. Починається воно з відтворення генетичного матеріалу - ДНК, яка локалізована в нуклеоїді. Спочатку відбувається реплікація (подвоєння) генетичного матеріалу напівконсервативним шляхом. Розпочинається вона з реплікативної точки на ДНК, розташованої в місці з’єднання мезосоми з цитоплазматичною мембраною. Нуклеїнова кислота деспіралізується, й нитки ДНК розходяться. Кожна з них є матрицею, на якій за принципом комплементарності синтезуються їх копії, які згодом об’єднуються у двониткову ДНК. Синтез дочірніх ниток ДНК відбувається ступенево, невеликими фрагментами по 1-2 тис нуклеотидів, які пізніше зшиваються ферментом лігазою. Залежно від умов, реплікація може тривати 20-40 хвилин.
   Паралельно з реплікацією починається утворення поперечної перегородки за рахунок цитоплазматичної мембрани. Потім вона оточується пептидогліканом. Під час реплікації та утворення перегородки клітина росте, синтезуються біополімери, з яких складатимуться цитоплазматична мембрана, рибосоми, цитоплазма.
   Клітини відділяються одна від іншої, а в грамнегативних мікробів синтезується додатково зовнішня мембрана. Якщо клітини зберігають зв’язки, утворюються ланцюги з кокоподібних чи паличкоподібних форм.
   Поділ клітин може відбуватись за трьома типами. Випереджаючий - такий тип, при якому утворюються багатоклітинні палички і коки. При синхронному реплікація нуклеоїду супроводжується поділом клітини, й утворюються одноклітинні організми. Третій тип - із випереджаючим поділом нуклеоїду, при якому утворюються багатонуклеоїдні форми бактерій.
   Як правило, бактерії розмножуються простим поділом, що відбувається в різних площинах. Це спричиняє, наприклад, утворення різних морфологічних типів кокоподібних мікроорганізмів - диплококів, стафілококів, тетракоків, сарцин. Актиноміцети можуть розмножуватись шляхом фрагментації ниткоподібних клітин, брунькуванням. Можливо утворення клітин, подібних до спор, конідій.
   Облігатні внутрішньоклітинні паразити - хламідії - розмножуються, проходячи ряд стадій: елементарні тільця, ініціальні тільця, проміжні тільця. Саме останні є тим джерелом, з якого формується нове покоління елементарних тілець. Тривалість циклу складає 40-48 годин.
   Мікоплазми також можуть утворювати особливі елементарні тіла, що здатні до розмноження фрагментацією або брунькуванням. Однак вони можуть розмножуватись і простим бінарним поділом.
   Швидкість розмноження бактерій залежить від багатьох факторів: віку культури, складу живильного середовища, його рН, окисно-відновного потенціалу, температури, аерації тощо.
   Бактерії розмножуються у геометричній прогресії. Якщо вважати, що за оптимальних умов бактерія подвоюється кожні 30 хвилин, то за годину їх буде 4, через дві години - 16, через 4 - 256, через 15 - мільйони. Через 35 год їх об’єм становитиме до 1000 м 3 , а маса - понад 400 т.
   При внесенні у живильне середовище бактерії розмножуються за певними закономірностями. Вони ростуть і розмножуються, досягаючи певного максимуму до того часу, поки не будуть вичерпані запаси живильних речовин. Якщо не видаляти кінцеві продукти обміну і не додавати необхідні речовини, то можна одержати періодичну культуру (популяція в обмеженому просторі). Мікроорганізми в такій культурі ведуть себе як багатоклітинні системи з генетично обмеженим ростом.
   Крива, яка описує залежність логарифму числа живих клітин від часу культивування, називається кривою росту.
   Розрізняють чотири основні фази росту періодичної культури: початкову (або лаг-) , експоненціальну (або логарифмічну ), стаціонарну та відмирання(рис. 3.1) .
   Початкова або лаг-фаза охоплює проміжок між інокуляцією бактерій і досягненням найвищої швидкості їх поділу. В цей період відбувається адаптація бактерій до умов існування. В клітині у 8-12 разів зростає кількість РНК, збільшується концентрація ферментів. Тривалість фази 1-2 год.
   Експоненціальна (логарифмічна) фаза характеризується постійною максимальною швидкістю поділу клітин і зростанням їх кількості у геометричній прогресії. Вона залежить від віку мікробів і складу середовища. Так, ентеробактерії діляться кожні 15-30 хв, стрептококи - 30 хв, а грунтові нітробактерії й збудники туберкульозу - 5-18 год. Час, протягом якого відбувається поділ мікроба, називається часом генерації. Тривалість фази - 5-8 год.
   Стаціонарна фаза наступає тоді, коли число клітин перестає збільшуватись. Настає рівновага між кількістю живих мікробів і тих, що відмирають. Цьому сприяє висока щільність популяції, дефіцит живильних речовин у середовищі, низький парціальний тиск кисню, накопичення токсичних продуктів обміну. Однак кількість біомаси в цей період сягає найвищого рівня, тому концентрацію клітин позначають як максимальну ( М-) концентрацію, а величину біомаси - терміном вихід або урожай. Ця ознака є специфічною й характерною для кожного виду бактерій. Триває фаза 6-7 год.
   Фаза відмирання (до 10 год) супроводжується різким зменшенням числа живих клітин. Цьому сприяють значний дефіцит поживних речовин у середовищі, нагромадження кислот, автоліз під впливом власних ферментів.
   Отже, у періодичній культурі умови культивування весь час змінюються: густина мікробів зростає, а запаси живильних речовин зменшуються. Однак у багатьох випадках необхідно підтримувати клітини у фазі експоненціального росту та М-концентрації, тому що саме в цей період вони найбільш фізіологічно і функціонально активні: синтезують багато білка, продукують велику кількість різноманітних ферментів, токсинів, антибіотиків, інших біологічно активних речовин. Це досягається постійним видаленням популяцій бактерій, що ростуть, оновленням живильного середовища, додатковою аерацією (для аеробних бактерій). Саме за такими принципами працюють хемостати і турбідостати - прилади, які дозволяють проводити безперервне культивування у промислових і лабораторних умовах.
    Ріст мікробів на твердих живильних середовищах відбувається за аналогічними закономірностями, однак щільність клітин значно вища.

Культивування мікроорганізмів

   Для вирощування бактерій в лабораторних умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання використовують живильні середовища. Вони повинні відповідати певним стандартам, створюючи оптимальні умови для росту, розмноження й життєдіяльності мікроорганізмів.
   В першу чергу бактерії потребують азоту, вуглецю та водню для побудови власних білків. Водень і кисень для клітин постачає вода. Джерелом азоту виступають численні речовини, в основному, тваринного походження (м’ясо яловиче, риба, м’ясо-кісткова мука, казеїн), а також білкові гідролізати, пептиди, пептони. Можна використовувати й замінники м’яса - плаценту, кров’яні згустки, дріжджі. Отже, до складу середовищ повинні бути введені джерела живильних речовин і води, а також ростові фактори (вітаміни, ферменти). Універсальним джерелом їх служать екстракти з білків тваринного й рослинного походження, білкові гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу середовищ включають нативні субстрати - кров, сироватку, асцитичну рідину, яєчний жовток, кусочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін.
   Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, натрію, калію, мати у своєму складі неорганічні фосфати.
   Допустимим є вживання речовин, які усувають дію інгібіторів росту і токсиноутворення мікробів (окремі амінокислоти, твіни, активоване вугілля тощо). Важливим є стабілізація оптимуму рН середовища, його високої буферності. Середовища повинні мати певну в’язкість, густину (рідкі, напіврідкі, щільні), бути ізотонічними, прозорими й обов’язково стерильними.
   Численні потреби мікроорганізмів зумовлюють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існують спеціальні середовища. Частину їх готують у лабораторіях безпосередньо перед посівом, але з кожним роком з’являються все нові й нові середовища заводського виготовлення (сухі), які здатні задовільнити найвибагливіші потреби мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад.
   Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі й щільні. Напіврідкі та щільні середовища готуються з рідких, додаючи відповідно 0,3-0,7 % та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє собою волокнистий матеріал, який добувають з морських водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %), білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропептин. Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи, надає середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних систем бактерій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіологічній практиці. Для створення щільних середовищ використовують також желатин (10-15 %), згорнуту сироватку крові.
   Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використовують згорнуту сироватку, молоко, яйця, м’язову тканину. Штучні середовища створюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що забезпечують ті чи інші потреби мікроорганізмів.
   Залежно від потреб бактеріологів існуючі живильні середовища поділяються на чотири основні групи.
   Перша група - універсальні (прості) середовища. До них належать прості середовища: м’ясо-пептонний бульйон (МПБ) та м’ясо-пептонний агар (МПА). За своїм складом, наявністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.
   Друга група - спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випадках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров’яний, сироватковий агари, сироватковий бульйон, асцитичний бульйон та асцит-агар.
   Третя група - елективні середовища. Їх використовують для цілеспрямованого виділення та накопичення бактерій з матеріалу, який містить багато сторонніх мікробів. Створюючи такі середовища, враховують біологічні особливості бактерій певного виду, які відрізняють їх від інших. Наприклад, елективним для холерних вібріонів є 1 % лужна пептонна вода, середовища Ру та Леффлера - для збудників дифтерії, середовище Плоскирева - для дизентерійних паличок, середовище Мюллера - для тифопаратифозних бактерій. Гарний ріст стафілококів спостерігаєтся на середовищах, у складі яких є до 10 % хлориду натрію. Мікрококи та коринебактерії ростуть на агарі, що містить фуразолідон.
   Додавання антибіотиків до складу живильних середовищ робить їх елективними відносно антибіотикостійких штамів.
   Четверта група - диференціально-діагностичні середовища. Це велика група середовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх первинну диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, редукуючих властивостей тощо.
   На поверхні щільного живильного середовища мікроорганізми можуть утворювати суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Колонія - це видимі неозброєним оком скупчення бактерій на поверхні або в товщі живильного середовища. Як правило, кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад досить однорідний. Утворення її є проявом культуральних властивостей бактерій.
   Характеристика колоній - важлива складова частина роботи бактеріолога і лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду притаманні свої особливі колонії (рис. 3.2).
   Характеризувати колонії можна за різними ознаками. За величиною (діаметром) вони поділяються на великі (4-6 мм і більше), середні (2-4 мм), дрібні (1- 2 мм), карликові або точкові (менше 1 мм). Форма колоній може бути найрізноманітнішою: правильно кругла, неправильна (амебоподібна), ризоїдна. Вони бувають прозорими, що пропускають світло, і мутними.
   За рельєфом і контуром форми у вертикальному розрізі колонії поділяються на плоскі, опуклі, куполоподібні, каплеподібні, конусоподібні, плоскоопуклі, плоскі, що стеляться по поверхні середовища, із вдавленим центром, з припіднятою у вигляді соска серединою.
   Поверхню колоній вивчають спочатку неозброєним оком, а потім за допомогою лупи чи малого збільшення мікроскопа. Вона може бути матовою або блискучою, з глянцем, сухою або вологою, гладенькою або шорсткою. Гладенькі колонії позначають як S-форми (smooth - гладенький), а шорсткі - R-форми (rough - шорсткий, нерівний).
   Форма шорстких поверхонь також може бути різноманітною: зморшкуватою, гірозною, бородавчастою, шагреневою, мати радіальну посмугованість тощо.
   Переважна більшість мікроорганізмів утворює безбарвні колонії або мутно-молочного кольору. Однак деякі з них формують кольорові колонії. Їх колір визначається пігментом, який синтезують бактерії: білі, кремові, жовті, золотисті, сині, червоні тощо.
   Структуру колоній досліджують у прохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, ниткоподібні і волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.
   При доторканні до колонії петлею можна визначити її консистенцію: пастоподібна, в’язка або слизова, суха, крихка тощо.
   На рідких живильних середовищах бактерії також можуть рости по-різному, хоча особливості проявів росту бідніші, ніж на щільних.
   Бактерії здатні викликати дифузне помутніння середовища, колір його при цьому може не змінюватись або набуває кольору пігменту. Такий характер росту найчастіше спостерігається у більшості факультативно-анаеробних мікроорганізмів.
   Деколи відбувається утворення осаду на дні пробірки. Він може бути крихтоподібним, гомогенним, в’язким, слизистим та ін. Середовище над ним може залишатись прозорим або ставати мутним. Якщо мікроби пігменту не утворюють, осад має сірувато-білий або жовтуватий колір. Подібним чином ростуть, як правило, анаеробні бактерії.
   Пристінковий ріст проявляється утворенням пластівців, зерен, прикріплених до внутрішніх стінок пробірки. Середовище при цьому залишається прозорим.
   Аеробні бактерії мають тенденцію до поверхневого росту. Часто утворюється ніжна безбарвна або голубувата плівка у вигляді ледь помітного нальоту на поверхні, яка зникає при струшуванні або збовтуванні середовища. Плівка може бути волога, товста, мати в’язку, слизову консистенцію та прилипати до петлі, тягнучись за нею. Однак, зустрічається й щільна, суха, крихка плівка, колір якої залежить від пігменту, що виробляється мікроорганізмами.

Морфологія й фізіологія вірусів

   Віруси - особливий клас неклітинних форм життя, які вивчає самостійна галузь мікробіологічної науки - вірусологія. Відомо понад 2000 видів різноманітних вірусів людини, тварин, комах, рослин, бактерій. Віруси - убіквітарні істоти. Вони відіграють надзвичайно велику роль у природі: виступають як фактор, що об’єднує складні живі системи органічного світу, служать переносниками генетичної інформації. Саме за допомогою вірусів були зроблені фундаментальні відкриття з розшифрування структури нуклеїнових кислот, механізмів реплікації ДНК та синтезу білка. Фундаментальне вивчення вірусів та бактеріофагів увінчалось грандіозними успіхами генної інженерії. Отже, вони дають нам ключ до розуміння функціонування нуклеїнових кислот і сутності життя.
   Вірусні хвороби людей, тварин, рослин - справжнє лихо людства. Відомо понад 500 вірусів, які викликають різноманітні захворювання людини. Грип, інфекційні гепатити, натуральна віспа, жовта гарячка, геморагічні гарячки Ебола та Ласса, сказ, поліомієліт, СНІД - ось тільки деякі захворювання, з якими людина повинна вести постійну боротьбу.
   Слово “вірус” означає “отрута”. Честь відкриття вірусів належить Д.Й. Івановському, який у 1892 р. описав вірус мозаїчної хвороби тютюну. У 1897 р. Леффлер і Фрош відкрили вірус ящура, а в 1917 р. Ф. д’Ерелль - бактеріофаги. Сьогодні віруси розглядають як неклітинні системи живих істот, які відрізняються своїми малими розмірами, відсутністю у віріоні білоксинтезуючих та енергієгенеруючих систем, а також облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом.
   Структура вірусів.
Окрема вірусна частка одержала назву віріон. Він складається з однієї молекули нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) та білкового футляра, що її оточує, - капсида (capsa - вмістилище). Разом вони формують нуклеокапсид (рис. 3.3) .
   Капсиди утворюються з білкових субодиниць (поліпептидів), які називаються капсомерами. Їх кількість стабільна для кожного виду вірусів і використовується як таксономічна ознака. Віруси з таким типом будови називають простими. До них належать найдрібніші з патогенних вірусів людини поліовіруси, а також аденовіруси, паповавіруси.
   Проте більшість вірусів має ще одну оболонку - суперкапсидну, яка містить ліпіди. Вона пронизана вірусспецифічними білками -глікопротеїдами, які на поверхні оболонки утворюють особливі стуктури, що називаються шипами. Такі віруси називають складними або оболонковими. Структурною одиницею суперкапсидної оболонки є пепломер (peplos - накидка). До них належать віруси віспи, герпесу, гепатиту В, грипу, енцефалітів, імунодефіциту людини та ін.
   Віріони характеризуються поняттям симетрії. Тип симетрії залежить від способу укладки нуклеїнової кислоти і, відповідно, розташування капсомерів навколо неї. Виділяють ізометричний (або кубічний), спіральний та змішаний типи симетрії. Кубічний тип характеризується тим, що капсомери утворюють багатогранник (найчастіше ікосаедр - 20-гранник), (рис. 3.4) симетричний у трьох взаємоперпендикулярних площинах (вісях симетрії). Усі відомі ДНК-місткі віруси мають ізометричні (складні) капсиди (аденовіруси, герпесвіруси, віруси натуральної віспи), а також віруси, що містять РНК - пікорнавіруси, тогавіруси.
   У віріоні зі спіральною симетрією молекула нуклеїнової кислоти закручена разом із капсомерами в тугу спіраль (рис. 3.5). Такий тип симетрії мають віруси мозаїчної хвороби тютюну, віруси грипу, кору епідемічного паротиту та ін.).
   Комбінований тип симетрії спостерігається у деяких вірусів - збудників лейкозу, саркоми, бактеріофагів. При цьому нуклеокапсид має кубічний тип симетрії, а нуклеопротеїд, розміщений у ньому, укладається спірально (рис. 3.6).
   Форма вірусів може бути найрізноманітнішою: паличкоподібна (віруси сказу)(рис. 3.7) , сферична (віруси грипу (рис. 3.8), папіломи (рис. 3.9)), кубоїдальна (віруси (рис. 3.10) натуральної віспи), головчаста або сперматозоїдна (деякі бактеріофаги (рис. 3.11)), ниткоподібна (віруси грипу, віруси бактерій (рис. 3.12)).
   Розміри вірусів значно поступаються бактеріям, коливаючись у межах 20-400 нм. Визначити їх можна за допомогою електронного мікроскопа, ультрацентрифугування, а також при фільтруванні через спеціальні фільтри.
   Класифікація вірусів.
В основі сучасної класифікації вірусів лежать ознаки, що характеризують тип нуклеїнової кислоти, їх морфологію, особливості репродукції, антигенні властивості тощо. За наявністю нуклеїнової кислоти їх поділяють на ДНК-місткі та РНК-місткі (або ДНК-геномні та РНК-геномні) віруси. Всередині цих груп розрізняють родини, підродини, роди та види. До ДНК-містких вірусів належать 7 родин: Poxviridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Papovaviridae, Hepadnaviridae, Parvoviridae, Iridoviridae. РНК-місткі віруси формують 13 родин: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Arenaviridae, Coronaviridae, Bunyaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae, Filioviridae. Їх детальна характеристика описана в 18 розділі.
   Хімічний склад вірусів.
До складу вірусів входить нуклеїнова кислота, білок, ліпіди, гліколіпіди, глікопротеїди. Вони завжди містять один тип нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), яка становить від 1 % до 40 % маси віріона. Вони характеризуються надзвичайним різномаїттям форм. Геном може бути представлений як односпіральними, так і двоспіральними молекулами, бути лінійними або фрагментованими. Вірусні геноми містять інформацію, достатню для синтезу лише декількох білків. Їх маса сягає 10 -15 мг, що в 1 млн разів менше, ніж у клітини, а довжина - до 0,093 мм. Число нуклеотидних пар коливається від 3150 (вірус гепатиту В) до 230000 (вірус натуральної віспи).
   Білки вірусів (70-90 %) поділяються на структурні та неструктурні. Структурними називають такі білки, які входять до складу зрілих позаклітинних віріонів. Вони виконують ряд важливих функцій: захищають нуклеїнову кислоту від зовнішнього пошкодження, взаємодіють з мембранами чутливих клітин і забезпечують проникненя вірусу в клітину, мають РНК- та ДНК-полімеразну активність та ін. Неструктурні білки не входять до складу зрілих віріонів, однак утворюються під час їх репродукції. Вони забезпечують регуляцію експресії вірусного генома, є попередниками вірусних білків, здатні пригнічувати клітинний біосинтез. Залежно від розташування у віріоні, білки поділяються на капсидні, суперкапсидні, матриксні, білки серцевини та асоційовані з нуклеїновою кислотою.
   Ліпіди містяться в складних вірусах і входять до складу суперкапсидної оболонки, утворюючи її подвійний ліпідний шар. Вони стабілізують вірусну оболонку, забезпечують захист внутрішніх шарів віріонів від гідрофільних речовин зовнішнього середовища, беруть участь у депротеїнізації віріонів. Віруси мають до 15-35 % ліпідів. Ліпопротеїди - комплекс ліпідів клітинної мембрани та вірусних суперкапсидних білків, які вони набувають при виділенні з клітини під час репродукції.
   Молекули вуглеводів входять до складу глікопротеїнів, гліколіпідів, сягаючи 3,5-9 %. Вони відіграють важливу роль, забезпечуючи захист відповідних молекул від дії клітинних протеаз.
   Резистентність вірусів до дії факторів зовнішнього середовища
. Різні групи вірусів мають неоднакову стійкість до дії факторів зовнішнього середовища. Найчутливіші до них віруси, що мають ліпопротеїнову оболонку. Наприклад, віруси грипу, парагрипу, епідемічного паротиту інактивуються на поверхнях за декілька годин, проте аденовіруси зберігають інфекційні властивості декілька днів. Чутливість вірусів до дії рентгенівського та ультрафіолетового опромінення залежить від величини генома вірусів: чим менший геном, тим резистентніший вірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну оболонку, чутливі до ефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших жиророзчинників і детергентів.
   Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації водневих іонів. Частина з них стійка до кислих значень рН (2,2-3,0). До них належать віруси, які викликають кишкові інфекції, проникаючи в організм аліментарним шляхом (віруси поліомієліту, Коксаки, ЕСНО). Віруси, які потрапляють в організм через верхні дихальні шляхи (риновіруси, віруси грипу та ін.), чутливі до кислих значень рН.
   Методи культивування вірусів.
Віруси є облігатними внутрішньоклітинними паразитами, тому вони можуть репродукуватись тільки в живій клітині. Виходячи з цього, запропоновано три основні способи культивування вірусів: на лабораторних тваринах, курячих ембріонах та культурах клітин.
   Лабораторних тварин використовують для виділення вірусів та їх ідентифікації з клінічного, секційного матеріалу в біологічних пробах та реакціях нейтралізації. Для цього служать різноманітні види тварин: білі миші (дорослі та сисунки), гвінейські свинки, хом’яки, кролі, мавпи, яких можна заражати у мозок, внутрішньочеревинно, інтраназально, під шкіру тощо. Залежно від виду збудника, у піддослідних тварин розвиваються характерні ознаки ураження.
   Курячі ембріони використовують для виділення вірусів та визначення їх виду. Доступність та відносна дешевизна ембріонів, простота в роботі дозволяють використовувати їх для приготування діагностичних препаратів та одержання вакцин. Як правило, працюють з 5-12-14-денними ембріонами. Зараження проводять відкритим та закритим способом у порожнину алантоїсу, порожнину амніона, на хоріоналантоїсну оболонку, в жовтковий мішок (рис. 3.13).
   Сучасну вірусологічну діагностику важко уявити без використання клітинних культур. Культури клітини поділяють на ряд груп. Первинні культури одержують з тканин людини або тварин при їх ферментативній дезинтеграції за допомогою трипсину, хемотрипсину або версену. Культури можуть витримувати до 10 поділів в умовах in vitro. Вони чутливі до багатьох вірусів, їх можна одержувати в лабораторіях у будь-якій кількості. Найчастіше використовують культури нирок ембріона людини, нирок мавп, свиней, фібробласти курячих ембріонів.
   Перещеплювані
культури - клітини, які набули здатності до безмежного росту. Як правило, вони є похідними пухлин людини або тварин. Такі культури чутливі до багатьох вірусів, мають тенденцію до безмежного росту, тому набули широкого застосування у вірусологічних лабораторіях. Їх вирощують у вигляді одношарових культур на поверхні скла у флаконах або суспензії. Використовують тканинні культури HeLa (карцинома шийки матки), H ep 2 (карцинома гортані людини), КВ (карцинома ротової порожнини).
   Диплоїдні
культури - особлива група клітин одного типу, які витримують у лабораторних умовах до 100 пасажів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом. Вони вільні від контамінації вірусами, мікоплазмами, грибами, онкогенно безпечні, високостабільні. Культури ліній IMR-90 (з легень 16-тижневого плода людини) й J (клітини крові) використовують для одержання вакцинних штамів вірусів.
   При розмноженні вірусів в тканинних культурах відбуваються різноманітні зміни клітин. Усю сукупність їх називають цитопатичною дією (ЦПД) або цитопатичним ефектом (рис. 3.14). Одні віруси викликають повну деструкцію (руйнування) клітин і відпадання їх моношару від стінки пробірки чи флакона. Так діє, наприклад, вірус поліомієліту. Інші віруси викликають у клітинах різного ступеня дегенеративні зміни ядра й цитоплазми, появу специфічних включень тощо. Таку цитопатичну дію проявляють віруси натуральної віспи, сказу, аденовіруси, герпесвіруси. При зараженні культури вірусом кору або респіраторно-синцитіальним вірусом утворюються гігантські багатоядерні відростчаті клітини - так звані синцитії та симпласти. Онкогенні віруси викликають ЦПД у вигляді клітинної проліферації, що зумовлює утворення пухлин.
   Репродукція вірусів.
Здатність вірусів до відтворення називають репродукцією. Особливості її полягають у тому, що геноми представлено як РНК, так і ДНК, вони різноманітні за структурою і формою, майже всі вірусні РНК здатні реплікуватись незалежно від ДНК клітини, вірусам притаманний диз’юнктивний спосіб репродукції. Останній полягає в тому, що синтез генома та білків вірусу розірваний у просторі та часі: нуклеїнові кислоти реплікуються в ядрі клітини, білки - в цитоплазмі, а збирання цілих віріонів може відбуватись на внутрішній поверхні цитоплазматичної мембрани. Репродукція вірусів - унікальна система відтворення чужерідної інформації в клітинах еукаріотів і забезпечує абсолютне підкорення клітинних структур потребам вірусів.
   В репродукції вірусів виділяють ряд стадій. До ранніх належить адсорбція вірусів на поверхні клітини, проникнення (пенетрація) їх всередину клітини та їх роздягання (депротеїнізація). Пізні стадії (стратегія вірусного генома) включають синтез вірусних нуклеїнових кислот, синтез білка, збирання віріонів та вихід вірусних часток із клітини.
   Прикріплення вірусів до поверхні клітини забезпечується двома механізмами: неспецифічним і специфічним. Неспецифічний визначається силами електростатичної взаємодії, що виникає між хімічними групами на поверхні вірусів і клітин, які несуть різні заряди. Специфічний механізм (обернена та необернена адсорбція) зумовлюється комплементарними вірусними та клітинними рецепторами. Вони можуть мати білкову, вуглеводну, ліпідну природу (рис. 3.15). Наприклад, рецептором для вірусів грипу є сіалова кислота. Число рецепторів на ділянках адсорбції може сягати 3000. На поверхні вірусів рецептори, як правило, розташовані на дні заглибин і щілин.
   Проникнення вірусів всередину клітини відбувається за механізмом рецепторного ендоцитозу (варіант віропексису) на спеціальних ділянках клітинних мембран (рис. 3.16), які містять особливий блок з високою молекулярною масою - клатрин. Мембрани інвагінуються, і утворюються вкриті клатрином внутрішньоклітинні вакуолі. Іх число може сягати 2000. Вакуолі, об’єднуючись, утворюють рецептосоми, а останні зливаються з лізосомами. Поверхневі білки вірусів взаємодіють із мембранами лізосом, а їх нуклеопротеїд виходить у цитоплазму.
   Однак існує ще один механізм проникнення вірусів у клітину - індукція злиття мембран. Вона відбувається завдяки особливому вірусному білку злиття (F - білок, fusion - злиття). Внаслідок цього процесу вірусна ліпопротеїдна оболонка інтегрує з клітинною мембраною, а геном його проникає в клітину. Такий білок ідентифіковано у вірусів грипу, парагрипу, рабдовірусів та ін.
   Роздягання віріонів - багатоступеневий процес, під час якого вивільняється їх нуклеїновий апарат, зникають захисні оболонки, які гальмують експресію генома. Відбувається воно в спеціалізованих ділянка - лізосомах, апараті Гольджі.
   Пізні стадії репродукції спрямовані на синтез вірусних нуклеїнових кислот та білка. Механізм реплікації (утворення вірусних геномів, які є точною копією попередника) залежить від особливостей нуклеїнової кислоти. У різних видів вірусів він неоднаковий (рис. 3.17). Виділяють 6 основних класів реплікації вірусів.
   У двониткових ДНК-містких вірусів (герепесвіруси, аденовіруси, віруси натуральної віспи) спочатку відбувається деспіралізація ДНК і розходження її ниток. На одній з них за принципом комплементарності синтезується нова нитка ДНК, на другій - інформаційна (матрична) РНК (іРНК або мРНК). Цей процес триває, поки в клітинах не утвориться достатня кількість нуклеїнових кислот. У однониткових ДНК-геномних вірусів процес відбувається за умови утворення проміжної форми ДНК.
   Реплікація у вірусів, що містять РНК, відбувається за подібними закономірностями. На материнській РНК синтезується іРНК, а матрицею для синтезу вірусного генома служать проміжні форми РНК.
   Суттєво відрізняється від попередніх механізм реплікації онкорнавірусів. Їх процес репродукції тісно пов’язаний з репродукцією клітини-хазяїна. Спочатку на РНК-місткому геномі вірусу відбувається синтез нитки ДНК за допомогою РНК-залежної ДНК-полімерази. За деякий час синтезується комплементарна нитка ДНК, яка надалі інтегрує в геном клітини-хазяїна. В такому стані вірус тривалий час зберігається в клітині. Пізніше ця нитка ДНК служить матрицею для утворення вірусної РНК.
   Транскрипцією
називають процес утворення інформаційних (матричних) РНК. Вона відбувається за допомогою спеціальних ферментів, які називаються ДНК- або РНК-залежні РНК-полімерази. У ДНК-вірусів ці ферменти клітинного походження, а у РНК-вірусів - власні вірусспецифічні транскриптази.
   На стадії трансляція відбувається зчитування генетичної інформації з матричної РНК та перевід її у послідовність амінокислот. Відбувається процес у рибосомах. Молекули РНК просуваються в рибосомах відповідно до послідовності триплетного коду, який розпізнають транспортні РНК. Останні несуть на спеціальних ділянках амінокислоти.
   Складання віріонів - не до кінця вивчений процес. В його основі лежить можливість специфічного розпізнавання нуклеїнових кислот і вірусних білків при досягненні їх певної концентрації. Підраховано, що для утворення однієї вірусної частки необхідно біля 10 тисяч молекул білків, ліпідів, вуглеводів, нуклеїнових кислот. Прості віріони складаються на мембранах ендоплазматичного ретикулюму. У складних вірусів він починається в аналогічних ділянках, а закінчується на цитоплазматичній мембрані.
   Прості віруси залишають клітину, як правило, шляхом “вибуху”, розриваючи її мембрану. Складні віруси - брунькуванням. При цьому клітина тривалий час може залишатись життєздатною, поки повністю не виснажиться, продукуючи вірусних нащадків (рис. 3.18).
   Типи вірусної інфекції.
При взаємодії вірусів з клітиною проявляється декілька типів такої взаємодії. При продуктивній інфекції вірус функціонує в клітині автономно, а його репродукція відбувається незалежно від репродукції клітинного генетичного апарата. При цьому утворюється нове покоління вірулентних вірусів.
   Якщо цикл репродукції вірусів блокується на одній із стадій, а інфекційні віріони не утворюється, такий тип взіємодії позначають як абортивний.
   Коли з клітиною взаємодіють онкогенні РНК-місткі віруси (збудники СНІДу, лейкозу), нуклеїнова кислота інтегрується в клітинну хромосому та існує там у вигляді провірусу. В результаті може спричинятись зміна спадкових властивостей клітини. Такий тип взаємодії називають вірогенією. Віруси, які викликають вірогенію, належать до групи помірних.

Бактеріофаги (віруси бактерій)

   Вперше спонтанний лізис бактерій описав М.Ф. Гамалія в 1898 р. Детальніше явище розчинення дизентерійних батерій якимось невідомим агентом дослідив канадський мікробіолог Ф. д’Ерелль у 1917 р. Він назвав цей агент бактеріофагом (bacteriophaga - той, який руйнує бактерії). На основі вивчення феномена бактеріофагії були вирішені дуже важливі проблеми молекулярної біолоігї та генетики. Бакеріофаги виявились основною моделлю для дослідження тонкої структури гена, універсального генетичного коду, впливу радіації на спадкові структури організмів.
   Морфологія фага
. Більшість бактеріофагів мають форму сперматозоїда (рис. 3.18а),(рис. 3.18б). Вони складаються з гексагональної головки, в якій міститься ДНК (або РНК), хвостового відростка (стержня, оточеного білковим чохлом), базальної пластинки з фібрилами - рецепторами. Розмір головки 60-100 нм. Її двошарова оболонка утворена капсомерами, які оточують одну щільно скручену молекулу ДНК. Порожнистий відросток довжиною 100-200 нм служить для прикріплення до поверхні бактерійної клітини та її інфікування. Адсорбується фаг на клітині за допомогою базальної пластинки та фібрил-рецепторів. Існує шість морфологічних типів фагів: нитчасті, без відростка, з аналогом відростка, коротким відростком, з чохлом відростка, що не скорочується й з чохлом відростка, що скорочується (рис. 3.19).
   Хімічний склад
фагів, як інших вірусів, представлений нуклеїновою кислотою, білками, невеликою кількістю ліпідів у оболонці. Переважна більшість бактеріофагів містить ДНК і лише окремі - РНК. За своїм складом фагові нуклеїнові кислоти не відрізняються від аналогічних структур інших мікроорганізмів і вірусів. Всередині головки є невелика кількість “внутрішнього білка”. В дистальній частині відростка, під чохлом, міститься фермент лізоцим, який відіграє велику роль у проникненні фагової нуклеїнової кислоти в бактеріальну клітину.
   У мікроорганізмів, виявляється, також існують “інфекційні хвороби” і викликають їх бактеріофаги. При цьому лізис бактерій під впливом фагів характеризується суровою специфічністю. Для кожного виду як патогенних, так і сапрофітних мікроорганізмів існує індивідуальний бактеріофаг, який вибірково діє лише на “свій” мікроб. Ця вибіркова спеціалізація дії може бути спрямована тільки на певну різновидність (або навіть певний штам), що має велике значення для ідентифікації збудників інфекційних хвороб, їх окремих фаговарів. Це допомагає епідеміологам і клініцистам встановити джерело інфекції та намітити раціональні шляхи для її профілактики. Такі високоспеціалізовані бактеріофаги називають монофагами. Але в природі існують і поліфаги, які здатні лізувати кілька близьких між собою видів бактерій.
   Бактеріофаги стійкі до дії багатьох факторів зовнішнього середовища. Зокрема, вони витримують високий тиск, зберігають активність при дії іонізуючого та рентгенівського випромінювання, а також при значеннях рН - 2,5-8,5. Однак вони швидко втрачають свої властивості при кип’ятінні, дії дезинфікуючих розчинів та ультрафіолетових променів.
   Феномен бактеріофагії можна спостерігати як на рідких, так і на щільних живильних середовищах. Якщо в пробірку з МПБ, де росте кишкова паличка, додати декілька крапель відповідного бактеріофагу, то через певний час відбувається просвітління мутної суспензії бактерій за рахунок дії фагів. Для вивчення лізису клітин на щільних живильних середовищах їх попередньо засівають мікроорганізмами, а потім наносять бактеріофаги. Через добу на фоні суцільного газону бактерій утворюються зони, де ріст відсутній. Такі зони мають, як правило, круглу форму і виникають внаслідок літичної дії бактеріофагів. Їх називають негативними колоніями або бляшками бактеріофагів (рис. 3.20).
   Залежно від наслідків взаємодії фагів з бактеріальною клітиною вони поділяються на вірулентні та помірні .
   Вірулентні бактеріофаги проникають всередину клітини, спричиняючи її лізис. Взаємодія їх з клітиною складається з ряду етапів, притаманних практично всім вірусам. Спочатку відбувається адсорбція (обернена й необернена) фага на поверхі клітини внаслідок взаємодії їх рецепторного апарату з рецепторами клітини. Представлено його позитивно зарядженими аміногрупами білків та карбоксильними групами, які мають негативний заряд. Адсорбція залежить від багатьох чинників, зокрема, температури, складу середовища, де вона відбувається, концентрації іонів кальцію та магнію. Завдяки ферментам (наприклад, лізоциму) головки бактеріофага руйнується клітинна стінка бактерії, хвостовий відросток бактеріофага скорочується, а науклеїнова кислота вводиться в клітину (рис. 3.21). Оболонка фага при цьому залишається назовні. На наступних етапах відбувається синтез “ранніх” ферментів, які забезпечують відтворення (реплікацію) фагової ДНК та матричної РНК. Згодом на рибосомах та полісомах спрацьовує механізм синтезу білка вірусів. При появі в клітині достатніх кількостей фагових нуклеїнових кислот та необхідного білка відбувається збирання фагових корпускул та вихід їх з клітини. При цьому клітинна стінка руйнується і сотні бактеріофагів виходять назовні.
   Коли з клітиною взаємодіють помірні бактеріофаги, частина клітин залишається неушкодженою ними, тому що спостерігається явище лізогенії - інтеграції генома бактеріофага в геном клітини. Такий фаг, який вмонтовано в хромосому клітини, називається профагом . Мікроорганізми з профагом називаються лізогенними бактеріями, і при дії деяких факторів (іонізуючого й ультрафіолетового випромінювання, мутагенів) вони здатні до продукції помірного фагу, втрачаючи свою лізогенність. Лізогенізація має велике біологічне значення й широко поширена у мікробному світі, тому що під впливом бактеріофагів можуть суттєво змінюватись біологічні властивості бактерій. Таке явище називають фаговою конверсією. Доказана можливість перетворення нетоксигенних дифтерійних паличок у токсигенні під впливом лізогенізації їх помірним бактеріофагом, який несе в свому геномі tox+-гени. Саме вони забезпечують синтез дифтерійними паличками сильного екзотоксину. Доведена роль бактеріофагів у забезпеченні продукції токсинів збудників ботулізму, стафілококів та інших бактерій. У деяких випадках під впливом помірних бактеріофагів можуть змінюватись антигенні властивості бактерій кишкової групи, вібріонів, ферментативна активність мікробів, їх резистентність до антибіотиків.
   Помірні бактеріофаги відіграють роль типових плазмід. Їх використовують як моделі для вивчення актуальних проблем генетики мікроорганізмів, в генно-інженерних дослідженнях і біотехнологічних процесах.
   Бактеріофаги широко розповсюджені у природі. Вони зустрічаються в будь-яких середовищах довкілля: грунті, воді, стічних водах - всюди, де є відповідні їм види мікроорганізмів. Фаги знайдено в кишечнику та виділеннях людей, тварин, птахів, плазунів, риб. Відповідно звідси в навколишнє середовище потрапляють бактеріофаги численних збудників інфекційних захворювань: черевного тифу та паратифів, сальмонельозів, ешерихіозів, дизентерії, холери та ін.
   Одержують бактеріофаги або з лізогенних культур мікроорганізмів, або з навколишнього середовища, заражаючи матеріалом відповідні бактерії. Активність бактеріофагів визначають при їх титруванні на щільних живильних середовищах за методом Граціа або на рідких середовищах за методом Аппельмана. За титр бактеріофага приймають найбільше його розведення, яке викликає лізис мікроорганізмів.
   Феномен бактеріофагії широко використовують у практичній медицині. За епідемічними показаннями проводять фагопрофілактику черевного тифу й дизентерії, приймаючи їх всередину. До застосування антибіотиків часто проводили фаготерапію різноманітних захворювань (черевного тифу, дизентерії, холери, стафілококо-вих інфекцій). Оскільки фаги мають специфічну літичну дію на мікроорганізми, їх можна використовувати для фагоіндикації - визначення відповідних бактерій в інфекційному матеріалі та об’єктах зовнішнього середовища. Нарешті, їх застосовують для фаготипування. Цей метод грунтується на використанні специфічної чутливості бактерій до своїх бактеріофагів, яка свідчить про спільне (тотожнє) походження бактерій, що мають однаковий фаготип. Порівнянням фаготипів збудників, виділених від хворих, та від осіб, які можуть бути їх носіями, визначають джерела зараження. Використовують його при визначенні джерел черевнотифозної, дизентерійної, стафілококової інфекції.

Матеріали до практичних занять


1. Виготовлення живильних середовищ. Техніка посіву матеріалу петлею, тампоном, шпателем

   Техніка посівів мікроорганізмів. Бактеріологічний метод дослідження - найголовніший у практичній роботі бактеріолога і лаборанта. При цьому проводять посіви заразного матеріалу на різноманітні живильні середовища, виділяють чисту культуру мікроорганізмів, ідентифікують їх. Його застосовують для діагностики інфекційних хвороб, дослідження мікробного забруднення різних об’єктів, виявлення обсіменіння шовного, перев’язного матеріалу, інструментарію.
   Посіви проводять на рідкі та щільні живильні середовища, що диктує особливості їх проведення (рис. 3.22). Посів мікроорганізмів на   рідке  живильне середовище Посів мікроорганізмів на   щільне живильне середовище в пробірках Посів мікроорганізмів петлею на щільне живильне середовище в чашках Петрі
   У ліву руку беруть дві пробірки. В одній знаходиться живильне середовище (щільне або рідке), в іншій - досліджуваний матеріал. Пробірки зажимають великим та вказівним пальцями. Для того, щоб можна було спостерігати за вмістом пробірок, їх тримають зверху кисті руки. Пробірки повинні бути дещо нахиленими, і потрібно стежити, щоб при відкриванні їх матеріал або сторонні мікроби з повітря та навколишніх предметів з однієї не потрапили в іншу . Корки з пробірок виймають, зажимаючи їх 4 і 5 пальцями правої руки. Трьома іншими пальцями правої руки, як олівець, тримають бактеріологічну петлю або піпетку, якими розподіляють досліджуваний матеріал.
   Спочатку стерилізується у верхній частині полум’я газового пальника петля (рис. 3.23). Пробірки відкривають і край їх проносять через полум’я пальника. Петлю опускають у пробірку, де є досліджуваний матеріал, і, обережно торкаючись стінки, охолоджують. У подальшому петлю опускають у пробірку і набирають матеріал. Якщо він знаходиться у рідкому стані, для посіву достатньо краплі рідини, яка затримується в кільці бактеріологічної петлі. Коли використовують мікроби, що виросли на поверхні середовища, обережно плавним рухом набирають невелику кількість їх, стежачи, щоб не ушкодити живильне середовище. Петлю повільно виймають з пробірки, не торкаючись її стінок, і переносять в іншу пробірку з середовищем. Штриховими рухами від однієї стінки пробірки до іншої, починаючи з нижньої частини середовища, проводять посів матеріалу по скошеній поверхні агару, знизу догори.
   Петлю виймають з пробірки, пробки і краї пробірок проносять через полум’я і закривають. Петлю прожарюють у полум’ї, щоб знищити мікроорганізми.
   При посіві матеріалу на рідке живильне середовище петлю з матеріалом занурюють у рідину. Якщо він не знімається з петлі, його обережно розтирають на стінці пробірки й омивають середовищем.
   Матеріал, який набирали пастерівською або градуйованою піпеткою, виливають у живильне середовище, а для рівномірного розповсюдження його пробірку обережно, щоб не замочити корок, стряхують або обертають, зажавши в долонях.
   Для посіву матеріалу на щільне живильне середовище у чашках Петрі невелику кількість матеріалу набирають стерильною петлею і втирають у поверхню середовища біля краю чашки (рис. 3.24). Після цього петлю стерилізують у полум’ї, щоб знищити надлишок матеріалу, охолоджують. Наступний етап посіву починають з місця, де закінчився попередній. Петлю кладуть горизонтально на поверхню агару, де було зроблено посів, проводять один-два рази по поверхні і роблять посів по решті середовища. Необхідно намагатись, щоб штрихи посіву розташовувались від краю до краю чашки, не пошкоджували поверхні агару і розташовувались близько один до одного. Цим штучно подовжується лінія посіву і створюються можливості для одержання ізольованих колоній.
   Посів шпателем Посів мікроорганізмів шпателем у чашки Петрі і тампоном Посів мікроорганізмів тампоном у чашки Петрі у чашки Петрі
. Матеріал попередньо наносять на поверхню живильного середовища біля краю чашки петлею або піпеткою. Стерильний шпатель (рис. 3.25) проносять через полум’я, охолоджують, торкаючись стінки чашки. Обережними круговими рухами, тримаючи чашку напівзакритою, розподіляють матеріал рівномірно по поверхні середовища.
   При посіві тампоном (рис. 3.26) чашку привідкривають однією рукою, тампоном торкаються поверхні агару біля краю чашки і починають проводити посів штрихами від краю до краю чашки, втираючи обережно матеріал у поверхню середовища, не пошкоджуючи його, поступово обертаючи тампон. Після проведення посіву чашку обертають на 90° і повторюють посів перепендикулярно до попереднього.
   При посіві уколом у стовпчик живильного середовища
Посів уколом у стовпчик живильного середовища пробірку з м’ясо-пептонним агаром, желатином тощо беруть у ліву руку, петлю з матеріалом - у праву і роблять укол до дна пробірки в середовище (рис. 3.27). Петлю обережно виймають, а пробірку закривають.
   Посів матеріалу в товщу живильного середовища
. Перед посівом матеріал повинен бути в рідкому стані. Стерильною градуйованою піпеткою набирають 0,1, 0,5 або 1,0 мл матеріалу і виливають його в стерильні чашки Петрі. Після цього матеріал заливають 15-20 мл розтопленого й охолодженого до 45-50° С МПА. Обережно похитуючи чашку або круговими рухами її по поверхні стола перемішують матеріал, досягаючи його рівномірного розподілу в середовищі. Чашку залишають закритою до повного застигання агару, а потім перевертають догори дном.
   Етапи бактеріологічного дослідження.
Бактеріологічний метод є найважливішим у практичній діяльності будь-якої мікробіологічної лабораторії. Від правильного його виконання залежить вірне визначення етіологічного чинника, що викликав захворювання, і, відповідно, вибір тактики лікування інфекційної хвороби. Важливість цього методу пояснюється тим, що в багатьох випадках лікарі мають справу з мікробними асоціаціями. Тоді необхідно встановлювати роль кожного з мікробів.
   Виділення чистої культури аеробних мікроорганізмів складається з ряду етапів.
   У перший день дослідження в стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) проводять забір патологічного матеріалу. Його вивчають за зовнішнім виглядом, консистенцією, кольором, запахом, готують мазок, фарбують і розглядають під мікроскопом. У деяких випадках (гостра гонорея, чума) на цьому етапі можна поставити попередній діагноз, а крім того, підібрати середовища, на які буде засіватись матеріал. Посів проводять бактеріологічною петлею, ватно-марлевим тампоном, за допомогою шпателя за методом Дригальського (рис. 26, 27). Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем і ставлять у термостат при оптимальній температурі (37° С) на 18-48, а деколи й більше годин. Мета етапу - одержати ізольовані колонії мікроорганізмів (рис. 3.28),(рис. 3.29).
   На другий день розглядають чашки і вивчають ізольовані колонії, що виросли на поверхні агару. Звертають увагу на величину, форму, колір, характер країв і поверхні колоній, їх консистенцію та інші ознаки. При потребі розглядають колонії під лупою, малим чи великим збільшенням мікроскопа. З підозрілих колоній готують мазки, фарбують за методом Грама для вивчення морфологічних та тинкторіальних властивостей, досліджують рухомість бактерій у “висячій” чи “роздавленій” краплі. Ці ознаки мають надзвичайно велике діагностичне значення при характеристиці окремих мікроорганізмів.
   Досліджувані колонії обережно, не торкаючись інших, знімають із поверхні середовища і засівають на скошений агар або на сектори чашки Петрі із живильним середовищем для одержання чистої культури. Пробірки або чашки з посівами поміщають у термостат при оптимальній температурі на 18-24 год.
   На третій день досліджують характер росту чистої культури мікроорганізмів і проводять її ідентифікацію.
   Спочатку звертають увагу на особливості росту мікроорганізмів на середовищі та роблять мазок, фарбуючи його за методом Грама, з метою перевірки культури на чистоту. Якщо під мікроскопом спостерігають бактерії однотипної морфології, розмірів та тинкторіальних властивостей, роблять висновок, що культура чиста. У деяких випадках вже за зовнішнім виглядом та особливостями їх росту можна зробити висновок про вид виділених збудників. Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками називається морфологічною ідентифікацією. Визначення виду збудників за їх культуральними ознаками називають культуральною ідентифікацією.
   Однак цих досліджень недостатньо, щоб зробити остаточний висновок про вид виділених мікробів. Тому вивчають біохімічні властивості бактерій. Вони досить різноманітні. Найчастіше досліджують цукролітичні, протеолітичні, пептолітичні, гемолітичні властивості, утворення ферментів декарбоксилаз, оксидази, каталази, плазмокоагулази, ДНК-ази, фібринолізину, перетворення нітратів у нітрити, тощо. Для цього існують спеціальні живильні середовища, які засівають мікроорганізмами (строкатий ряд Гісса, МПБ, згорнута сироватка, молоко та ін.). Визначення виду збудника за його біохімічними властивостями називається біохімічною ідентифікацією .
   З метою встановлення видової належності бактерій часто вивчають їх антигенну будову, тобто проводять ідентифікацію за антигенними властивостями. Кожний мікроорганізм має у своєму складі різні антигенні субстанції. Зокрема, представники родини ентеробактерій (ешеріхії, сальмонели, шигели) містять оболонковий О-антиген, джгутиковий Н-антиген і капсульний К-антиген. Вони неоднорідні за своїм хімічним складом, тому існують у багатьох варіантах. Їх можна визначити за допомогою специфічних аглютинуючих сироваток. Найчастіше використовується орієнтовна реакція аглютинації на склі. З цією метою на предметне скельце наносять різні діагностичні сироватки (проти окремих збудників або їх антигенів), а потім у кожну краплю вносять стерильною петлею невелику кількість чистої культури. За декілька хвилин спостерігають за феноменом аглютинації. Утворення аглютинату (пластівців) свідчить про гомологічність антигенів збудника та антитіл діагностичної сироватки, що дозволяє визначити вид інфекційного агента (рис. 3.3). При наявності позитивної орієнтовної реакції аглютинації її ставлять у розгорнутому варіанті (реакція аглютинації Грубера)(рис. 3.31) .
   При деяких інфекційних захворюваннях (дифтерія) ідентифікацію проводять за токсигенними властивостями мікробів. Метод грунтується на визначенні токсигенної активності коринебактерій дифтерії за допомогою реакції преципітації. Утворення ліній преципітації між колоніями токсигенних штамів та папірцем, просоченим антитоксичною сироваткою, свідчить про позитивну реакцію.
   Інколи ідентифікацію бактерій проводять, заражаючи лабораторних тварин чистою культурою і спостерігаючи за тими змінами, які викликають збудники в організмі (туберкульоз, ботулізм, правець, сальмонельоз тощо). Такий метод називають ідентифікацією за біологічними властивостями. Як об’єкти найчастіше використовують гвінейських свинок, білих мишей і щурів.
   Дуже важливим при виділенні мікроорганізмів є визначення їх чутливості до антибіотиків з метою вибору оптимального препарату для лікування. Найчастіше користуються методом стандартних дисків (метод дифузії в агар). Для цього на поверхню спеціального щільного живильного середовища в чашках Петрі засівають культуру мікроорганізмів і накладають паперові диски, просочені різними антибіотиками (рис. 3.32). Посіви інкубують при оптимальній температурі 18-24 год і вимірюють зони затримки росту бактерій навколо дисків з антибіотиками. За розмірами цих зон визначають належність бактерій до чутливих, помірно резистентних або стійких штамів.
   На підставі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних, антигенних, біологічних та інших властивостей мікробів роблять остаточний висновок про ідентифікацію. Наприклад: “Виділено Escherichia coli” або “Виділений збудник належить до виду Staphylococcus epidermidis”.
   При виділенні та ідентифікації S. aureus, S. typhi та деяких інших мікроорганізмів визначають фаготип мікробів. З цією метою на живильне середовище засівають чисту культуру бактерій і після підсушування чашки капають на її поверхню різні бактеріофаги. Після добової інкубації на поверхні середовища спостерігають за утворенням зон лізису бактерій (так звані, “негативні” колонії). Враховуючи, що чутливість до фагів досить-таки постійна ознака збудників, визначають їх фаготип. Співставляючи фаготипи мікробів, які виділено від хворих, з фаготипами тих, що виділено від носіїв або інших об’єктів, встановлюють джерело інфекції.
   Виділення чистої культури анаеробних бактерій
. В лабораторній практиці часто доводиться працювати з анаеробними мікроорганізмами. Вони більш вибагливі до живильних середовищ, ніж аероби, частіше потребують спеціальних ростових добавок, вимагають припинення доступу кисню при їх культивуванні, тривалість росту їх довша. Тому робота з ними складніша, вимагає значної уваги бактеріологів і лаборантів.
   Враховуючи сучасний розвиток мікробіологічної науки, виділяти та ідентифікувати культури анаеробних мікроорганізмів можна аналогічно аеробним бактеріям. Незаперечною умовою є обов’язкове дотримання на всіх етапах дослідження анаеробіозу, використовуючи для цього трикомпонентну газову суміш (у певному співвідношенні азот, водень та вуглекислий газ) чи систему “Gas-Pack”(рис. 3.33).
   Однак збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції можна виділяти та ідентифікувати за дещо іншою схемою, не використовуючи занадто складних живильних середовищ.
   На першому етапі (І день дослідження) вивчають макроскопічні особливості клінічного матеріалу, роблять мазок та фарбують його за методом Грама. Після цього його засівають на середовище Кітта-Тароцці та молоко. Середовища ставлять у термостат при температурі 37° С і культивують 1-3 доби (рис. 3.34) .
   На другому етапі вивчають прояви росту мікроорганізмів (помутніння, утворення осаду та газу на середовищі Кітта-Тароцці, пептонізація молока). Готують мазок, фарбують за методом Грама і проводять посів матеріалу за методами Вейнберга або Цейсслера для одержання ізольованих колоній.
   За методом Вейнберга готують декілька пробірок (3-4) з розтопленим і охолодженим до 42-45° С цукровим м’ясо-пептонним агаром. Матеріал із середовища Кітта-Тароцці вносять у першу пробірку за допомогою пастерівської піпетки й ретельно перемішують, потім переносять у другу, а далі - в третю (рис. 3.35). Після застигання агару пробірки культивують при оптимальній температурі, і за деякий час спостерігають утворення ізольованих колоній. Однак вміст кожної пробірки можна всмоктати у пастерівські піпетки або трубки Віньяль-Вейона, стежачи щоб не було бульбашок повітря. Останні мають довжину біля 30 см і діаметр 0,5-0,6 см. Верхній кінець їх , який закривається ватою, має перетяжку, а нижній витягнутий у вигляді капіляра. Після заповнення піпетки її витягнутий кінець запаюють і кладуть у термостат для культивування. Через 1-2 доби в агарі виростають колонії анаеробних бактерій. Для того, щоб їх ізолювати, трубку надрізають напильником на певному рівні, розламують, колонію беруть бактеріальною петлею і переносять у відповідне середовище.
   Для виділення ізольованих колоній за методом Цейсслера матеріал із середовища Кітта-Тароцці або молока наносять петлею або 1-2 краплі його пастерівською піпеткою на чашку Петрі з цукрово-кров’яним агаром і роблять посів шпателем за методом Дригальського. Не стерилізуючи шпатель, засівають на другу чашку, а потім і третю. На останній чашці виростають ізольовані колонії. Чашки перевертають догори дном, підписують, ставлять в анаеростат, в якому створюють анаеробні умови (рис. 3.36), а потім - у термостат при температурі 37° С на 2-3 доби.
   Третій етап дослідження починається з вивчення морфологічних особливостей колоній, які виросли в чашках Петрі або трубках Віньяль-Вейона. Досліджуються їх форма, величина, колір, характер країв, рельєф колонії, консистенція тощо. З колоній готують мазки, фарбують їх за методом Грама. Після цього колонії відсівають у середовище Кітта-Тароцці для одержання чистої культури. Посіви інкубують певний час при оптимальній температурі.
   На четвертому етапі звертають увагу на особливості росту чистої культури збудників на відповідних середовищах, перевіряють її на чистоту і проводять ідентифікацію. Ідентифікують виділені чисті культури анаеробних мікроорганізмів подібно до аеробних за морфологічними, культуральними, біохімічними та біологічними ознаками. Обов’язково використовують визначення токсигенних властивостей збудників у біологічниій пробі та реакції нейтралізації на лабораторних тваринах. У деяких випадках визначають антигенні властивості мікроорганізмів.

Практична робота

   1.Ознайомитись із набором основних компонентів для приготування простих і складних живильних середовищ (м’ясна вода, пептон, хлорид натрію, агар-агар, сухі середовища).
   2.Ознайомитись із готовими живильними середовищами (МПБ, МПА, кров’яний агар, згорнута сироватка, Ендо, Левіна, Плоскирєва).
   3.Вивчити ознаки росту мікробів на живильних середовищах.
   4.Зробити мазки із суміші мікроорганізмів, забарвити їх за методом Грама і розглянути під мікроскопом.
   5.Суміш бактерій засіяти на щільне живильне середовище петлею, тампоном і за допомогою шпателя.

2. Ідентифікація мікроорганізмів

   Ідентифікіація мікроорганізмів за біохімічними ознаками. Для дослідження здатності бактерій розщеплювати білки (протеолітичні властивості) використовують молоко або середовище з желатином (рис. 3.37). Протеоліз у молоці виражається розчиненням згустку казеїну, який утворено бактеріями, що згортають молоко.
   Середовища із желатином готують на м’ясній воді, додаючи 1 % пептону, 0,5 % хлориду натрію та 10-20 % желатину. Посів роблять уколом. Протеоліз проявляється розрідженням стовпчика середовища (рис. 3.38). Оскільки деякі види бактерій відрізняються за особливостями розрідження желатину, цю ознаку можна враховувати при їх ідентифікації.
   Пептолітичні властивості (здатність розщеплювати пептони - продукти неповного гідролізу білка) виявляють за допомогою МПБ і пептонної води. Їх засівають мікроорганізмами, а потім визначають утворення кінцевих продуктів - аміаку, сірководню та індолу. Для знаходження аміаку в пробірку вставляють та зажимають пробкою червоний лакмусовий папірець. В атмосфері аміаку він набуває синього забарвлення. Індикатором на сірководень є розчин ацетату свинцю, який за аналогічних умов визначення забарвлює фільтрувальний папір, змочений індикатором, у чорний колір за рахунок утворення сульфіду свинцю (рис. 3.39).
   Індол можна виявити за допомогою смужки фільтрувального паперу, змоченого 12 % розчином щавелевої кислоти. За наявністю індолу папірець набуває рожевого кольору (рис. 3.40). Більш чутливим є метод Ерліха. Згідно із загальноприйнятим методом пробкою пробірки зажимають папірець, просякнутий спеціальним індикатором (спиртовий розчин парадиметиламідобензальдегіду). При наявності індолу колір його змінюється на бузково-рожевий або малиновий (рис. 3.41).
   У мікробіологічній практиці широко використовуються диференційно-діагностичні середовища Ендо, Левіна, Плоскирєва, Мак Конкі які дозволяють виявити розкладання лактози бактеріями. Вони дозволяють проводити первинну диференціацію патогенних і сапрофітних бактерій кишкового тракту, що надзвичайно важливо для швидкого виділення чистих культур з їх наступною ідентифікацією (рис. 3.42). Ці середовища є елективними для багатьох представників родини кишкових бактерій. Випускаються вони у сухому вигляді, тому їх приготування в лабораторіях не потребує багато часу.
   Середовище Ендо складається з сухого живильного агару, 1 % лактози та індикатора фуксину, знебарвленого розчином сульфіту натрію. Свіже середовище має слабке рожеве забарвлення. При рості лактозопозитивних мікроорганізмів, тих, що розщеплюють лактозу (E. coli), їх колонії забарвлюються у темно-червоний колір з металевим блиском. Колонії лактозонегативних мікробів (сальмонели, шигели) на цьому середовищі безбарвні.
   До складу середовища Левіна також входить МПА, лактоза, однозаміщений фосфат калію, індикатори метиленовий синій, еозин. Нативне середовище має фіолетовий колір. Колонії лактозопозитивних бактерій мають темно-синє забарвлення, а лактозонегативні - рожевий відтінок.
   Сухий бактоагар Плоскирєва (Бактоагар Ж) містить у складі агар із солями жовчних кислот, лактозу, цитрат натрію, гіпосульфіт, фосфат натрію, брильянтовий зелений, соду кальциновану, йод і нейтральний червоний. Мікроорганізми, що розщеплюють лактозу, утворюють колонії червоного кольору, а ті, що її не ферментують - безбарвні.
   У мікробіологічній практиці часто виникає потреба дослідити ферментацію не тільки одного, а декількох цукрів відразу. З цією метою використовуються середовища Гісса. Вони можуть мати рідку та напіврідку консистенцію.
   Основою рідкого середовища є 1 % пептонна вода з 0,5 % натрію хлориду, 1 % вуглеводів (глюкози, мальтози, лактози, сахарози, манніту та ін.). До нього додають індикатор Андреде (кислий фуксин в 1 н розчині NaOH). Встановлюють рН 7,2, при ньому середовище має жовтий колір. Середовища з різними вуглеводами розливають в окремі пробірки, в які встановлюють поплавок - запаяну з одного кінця скляну трубочку довжиною 3 см відкритим кінцем донизу. Стерилізують текучою парою або парою під тиском 0,5 атм 15 хв.
   Після посіву бактерій, якщо вони ферментують вуглеводи, спостерігають появу червоного забарвлення, яке свідчить про зміну рН у кислу сторону (утворення кислоти), а деколи з поплавка витісняється рідина. Тоді роблять висновок про утворення газу (рис. 3.43). Отже, можливі три варіанти при обліку результатів посіву на середовише Гісса: мікроорганізми не ферментують субстрату (негативна відповідь) або бактерії розкладають вуглеводи (позитивна відповідь) з утворенням кислоти без газу чи кислоти і газу.
   Враховуючи, що мікроорганізми по-різному відносяться до вуглеводів (розкладають або не розкладають) при кінцевому обліку результатів спостерігають пробірки із зміненим або незміненим кольором рідини. Це створює враження строкатості, а такий ряд називають строкатим рядом Гісса.
   Зараз у більшості випадків користуються набором сухих середовищ для визначення цукролітичних ферментів, з яких готують напіврідкі строкаті ряди. На відміну від попередньої групи, до їх складу входять індикатори ВР (суміш водного голубого з розоловою кислотою) або бромтимоловий синій чи бромкрезоловий пурпурний. При наявності газу спостерігаються бульбашки або розриви живильного середовища у товщі агару. При підкисленні середовища з індикатором ВР воно стає синім, а при підлужнюванні - червоним (бромкрезоловий пурпурний при утворенні кислоти дає дещо фіолетове та лимонно-жовте забарвлення, а бромтимоловий синій - зеленкувате або лимонне). У лужному середовищі вони мають відповідно інтенсивно фіолетовий та синій колір із зеленкуватим полиском.
   Випускаються також сухі середовища Рессела та цукровий агар із сечовиною Олькеницького.
   Середовище Рессела є напіврідким агаром із лактозою (1 %) і глюкозою (0,1 %) та індикатором ВР. Після розливання його у пробірки їх кладуть так, щоб утворився стовпчик агару і була скошена поверхня. Мікроорганізми засівають петлею спочатку уколом у стовпчик, а потім по скошеній поверхні. Якщо бактерії ферментують лактозу і глюкозу, спостерігають зміну кольору (підкислення) всього середовища на синій. Якщо мікроби здатні метаболізувати тільки глюкозу, в цьому випадку змінює колір стовпчик середовища. За умови утворення газу спостерігають за появою його бульбашок або розривами агару.
   Трицукровий агар із сечовиною Олькеницького - більш складне середовище порівняно з попереднім. Він дозволяє визначити ферментацію лактози, сахарози, глюкози, утворення сірководню та наявність у бактерій ферменту уреази. До складу середовища відповідно вводять сухий живильний агар, лактозу, сахарозу, глюкозу, комплексну сіль амоній-залізо сульфат, тіосульфат натрію, сечовину, індикатор феноловий червоний. Готове середовище має блідо-рожевий колір.
   При розщепленні цукрів феноловий червоний забарвлює середовище в жовтий колір. Оскільки глюкоза присутня в невеликих концентраціях (0,1 %), в аеробних умовах (скошена поверхня) бактерії повністю утилізують її за перші години росту. Через 18-24 год вони споживають і пептони як білкову живильну основу. При цьому утворюється аміак, який робить середовище лужним, надаючи йому червоного кольору. Однак у стовпчику агару жовтий колір залишається, тому що там зберігаються кислі кінцеві продукти, які забезпечують низький рівень рН (рис. 3.44).
   Ентеробактерії, які розкладають лактозу й глюкозу, підкислюють середовище в усій пробірці (жовтий колір стовпчика та скошеної поверхні). Оскільки лактози (1 %) в 10 разів більше, ніж глюкози, через 18-24 год інкубації її запаси ще не вичерпані, тому зберігається жовтий колір середовища. Однак через 48 год за рахунок розщеплення пептонів можна спостерігати за його почервонінням (зсув рН у лужну сторону).
   Якщо бактерії утворюють газ (вуглекислий, водень) при ферментації цукрів, з’являються розриви середовища або відбувається скупчення газу на дні, що піднімає агар у пробірці.
   Сірководень мікроби утворюють з неорганічних сполук, завдячуючи ферменту тіосульфатредуктазі. Взаємодіють із сірководнем солі заліза, які вступаючи з ним у реакцію, утворюють сульфід заліза у вигляді нерозчинного преципітату чорного кольору в стовчику.
   Уреаза, яку продукують бактерії, руйнує сечовину з виділенням великої кількості аміаку, під впливом якого все середовище червоніє. Тому при наявності уреазопозитивних штамів провести облік ферментації цукрів неможливо. В таких випадках необхідно використовувати інші середовища (рис. 3.45).
   За останні роки в практиці мікробіологічних лабораторій почали використовувати спеціальні тест-системи для визначення різноманітних властивостей бактерій: “Roche”, “API”, “Enterotest”, пластини та диски індикаторні біохімічні. Вони зручні для користування, надійні, дозволяють визначати 12-20 і більше різноманітних ознак, значно полегшити ідентифікацію мікробів (рис. 3.46).
   Гемолітична активність мікроорганізмів є однією з найсуттєвіших ознак їх вірулентності, тому її визначення стало рутинною процедурою будь-якої спеціалізованої лабораторії. З цією метою використовують кров’яний МПА. Його готують з розтопленого та охолодженого до 45-50° С живильного агару, до якого додають 5-10 % дефібринованої або свіжої крові тварини (барана або кролика). Агар з кров’ю ретельно перемішують, не допускаючи утворення піни, і розливають у чашки Петрі. Якщо бактерії продукують гемолізини, навколо колоній або штрихів посіву утворюються зони просвітління на матовому червоному фоні (рис. 3.47). За кольором гемолізу (безбарвний, зеленкуватий) можна визначити тип гемолізинів (a, b, g тощо) (рис. 3.48),(рис. 3.49).
   Щоб виявити ліпіолітичні властивості мікробів, до складу живильних середовищ вводять ліпіди або жироподібні субстанції - твіни. Бактерії за таких умов утворюють райдужні вінчики навколо колоній при розщепленні ліпідів.
   Редукуючі властивості вивчають, додаючи до складу середовищ барвники (метиленовий синій, наприклад), які здатні відновлюватись. Фіксуючи час зміни кольору індикатора, можна судити про ступінь вираження редукуючої активності.
   Декарбоксилазну активність бактерій оцінюють на спеціальних середовищах з амінокислотами (лізином, орнітином, глютаміновою кислотою фенілаланіном та ін.)(рис. 3.50) .
   Широкого застосування для ідентифікації збудників інфекційних захворювань як бактеріальної, так і вірусної етіології набуває зараз ланцюгова полімеразна реакція.
   Ланцюгова полімеразна реакція (реакція гібридизації) високо специфічна. Принцип її застосування полягає у використанні однієї нитки нуклеотидної послідовності (генетичний зонд), що несе найспецифічніший для даної бактерії ген. Вона комплементарно зв'язується з ДНК бактерій, які знаходяться в досліджуваному матеріалі.
   Основою методу полімеразної ланцюгової реакції є багатократне утворення копій (ампліфікація) певної ділянки ДНК. Спочатку необхідно досліджувану ДНК розділити на два окремих ланцюги шляхом нагрівання. Після чого вносять праймери (синтетичні олігонуклеотидні послідовності, які запускають процес ампліфікації ДНК) і ДНК-полімеразу. Синтезовані ДНК знову нагрівають до утворення окремих ланцюгів, вносять праймери і повторюють процедуру нагрівання. Після 30-80 таких циклів накопичення копій синтезовані ДНК ідентифікують за методом електрофорезу, за допомогою специфічних рестриктаз або ендонуклеаз, використовуючи методи імуноферментного аналізу, мічених антитіл.

Практична робота

   1. Вивчити макроскопічні та мікроскопічні особливості колоній мікроорганізмів, що виросли на поверхні щільного живильного середовища. Зробити мазок, забарвити його за методом Грама і розглянути під мікроскопом.
   2. Посіяти за допомогою петлі мікроорганізми на скошений агар для одержання чистої культури бактерій. Виготовити мазок із суміші грампозитивних і грамнегативних бактерій (стафілококів і кишкових паличок) і забарвити за методом Грама.
   3. Зробити мазки з чистої культури мікроорганізмів, забарвити їх за методом Грама і розглянути під мікроскопом, зробити висновок про чистоту виділеної культури.
   4. Ознайомитись з демонстраційними кольоровими рядами Гіса, які використовуються для біохімічної ідентифікації мікроорганізмів.

Питання для самоконтролю

   1. Охарактеризувати хімічний склад бактерій.
   2. Конструктивний та енергетичний метаболізм бактерій.
   3. Назвати типи живлення бактерій.
   4. Ферменти мікроорганізмів та їх практичне значення.
   5. Дихання бактерій та його типи.
   6. Основні закономірності росту бактеріальної популяції. Намалювати криву розмноження бактерій і позначити її основні фази.
   7. Вимоги до живильних середовищ. Класифікація живильних середовищ.
   8. Особливості морфології та фізіології вірусів.
   9. Віруси бактерій (фаги) та їх практичне значення.

Ситуаційні задачі

   1. Виберіть вірне твердження:
   а) автотрофи використовують СО 2 для синтезу всіх вуглецемістких сполук;
   б) до хемоорганотрофів належать всі хвороботворні бактерії;
   в) прототрофи використовують глюкозу і солі амонію як єдине джерело вуглецю й азоту;
   г) ауксотофи можуть рости на мінімальних середовищах;
   д) до облігатних паразитів належать рикетсії та хламідії.
   2. Кров хворого з підозрою на сепсис засіяли на цукровий МПБ. Через добу він став мутним, і з нього зробили пересів на кров’яний МПА. Назвіть наступні етапи виділення та встановлення виду збудника.

Відповіді

   1. a, б, в, д.
   2. Після макро- і мікроскопічного дослідження колоній їх відсівають на скошений агар для одержання чистої культури та її ідентифікації.

Oddsei - What are the odds of anything.