Розділ 2. МОРФОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ
Мікроорганізми - загальна збірна назва для найдрібніших організмів. Це найстародавніші живі істоти на Землі. До них належать бактерії, віруси, гриби, найпростіші. Бактерії разом із водоростями складають царство прокаріотів; віруси - неклітинні форми життя, які мають власний геном і відтворюються тільки в клітинах; найпростіші та гриби - одно- або багатоклітинні еукаріотичні організми.Класифікація й номенклатура бактерій
Одна з перших спроб наукової класифікації бактерій належить датському зоологу О. Мюллеру, який ще у XVIII ст. виділив два роди - Monas i Vibrio. Пізніше німецький біолог Е. Геккель запропонував виділити мікроби в окреме царство Protista (protos - найпростіший). Воно охоплювало переважно одноклітинні мікроорганізми. Подальші дослідження привели до поділу цього царства на вищі (водорості, гриби, найпростіші) і нижчі (бактерії, ціанобактерії) протисти. Такий підхід сприяв чіткому поділу живого світу на прокаріотичні та еукаріотичні живі системи.
Сучасна систематика (таксономія) бактерій - наука про їх розподіл за певними групами (таксонами). Для їх характеристики враховують різноманітні властивості: морфологічні ознаки, здатність споживати атмосферний кисень, шляхи одержання енергії, оптимальна температура росту, рН середовища, здатність засвоювати певні речовини, наявність включень, склад клітинної стінки, вміст основ ДНК, екологічна ніша тощо.
Для назви мікроорганізмів використовують подвійну номенклатуру К. Ліннея. Перше слово вказує на рід і пишеться з великої літери. Воно походить від прізвища вченого, який відкрив і вивчав даний мікроорганізм, або характеризує якусь морфологічну ознаку. Друге слово означає вид, пишеться з малої літери і пов’язане з назвою хвороби, прізвищем автора та ін. Так, стафілокок золотистий має назву Staphylococcus aureus, збудник туберкульозу - Mycobacterium tuberculosis, кишкова паличка - Escherichia coli.
Найбільше визнання серед мікробіологів отримала класифікація мікроорганізмів, яка подана у Визначнику бактерій Д. Бергі (Bergey’s Manual Systematic Bacteriology).(рис. 2.1)
Основною такcономічною категорією є вид - група близьких між собою організмів, які мають спільне походження, єдиний генотип, подібні морфологічні, фізіологічні, біохімічні, серологічні, екологічні та інші ознаки.
Відповідно до Міжнародного кодексу номенклатури бактерій мікробіологи використовують такі таксономічні критерії систематики: вид - рід - родина - порядок - клас - відділ - царство.(рис. 2.2)
Відповідно до неї царство Procaryotae поділено на 4 відділи за особливостями будови клітинної стінки, відношенням до фарбування за методом Грама та ін.: Gracilicutes (gracilis - тонкий, cutis - шкіра) - грамнегативні бактерії, Firmicutes (firmus - міцний) - грампозитивні бактерії, Tenericutes (tener - м’який, ніжний) - мікроби, які не мають клітинної стінки, Mendosicutes (mendosus - помилковий) - представники мікробного світу, що мають нетиповий пептидоглікан.
Згідно з цим визначником усі мікроорганізми поділені на 33 групи за ознаками, які винесено у назву групи: 1 - спірохети, 4 - грамнегативні аеробні палички й коки, 12 - грампозитивні коки, 13 - грампозитивні палички й бактерії, що утворюють спори, тощо. Всередині груп поділ мікробів відбувається на порядки, родини, роди, види.
Однак генетичні механізми, що лежать в основі мінливості, здатні забезпечувати тільки відносну стабільність ознак в межах одного виду, тому введено поняття про варіанти (типи) бактерій, які за деякими особливостями відрізняються від стандартних видів: морфовари (за морфологічними ознаками), біовари (за біологічними), ферментовари (за ферментативними), фаговари (за чутливістю до бактеріофагів), серовари (за антигенними властивостями), ековари (за екологічними нішами помешкання), патовари (за патогенністю для лабораторних тварин).
Існує таке важливе поняття як “штам” - сукупність мікробних особин одного виду, які виділено з різних джерел (організму людини, тварини, зовнішнього середовища), або з одного джерела, однак у різний час.(рис. 2.3)
У популяційну мікробіологію введено поняття “клон” - нащадки однієї мікробної клітини.(рис. 2.4)Морфологія і ультраструктура бактерій
Зовнішній вид мікроорганізмів напрочуд різноманітний. За формою бактерії поділяють на кокоподібні, паличкоподібні, звивисті та ниткоподібні.(рис. 2.5)
Коки (kokkos - зерно, кісточка) - кулясті мікроорганізми сферичної, еліпсоподібної, ланцетоподібної або бобовоподібної форми. За картиною розташування мікробів у мазках, яка залежить від способу поділу клітин і наступного їх розходження, кокоподібні бактерії поділяють на ряд груп (рис. 2.6).
Мікрококи (micros - дрібний) характеризуються поодиноким і безладним розташуванням клітин. Як правило, це сапрофітні мікроорганізми і за звичайних умов не викликають захворювань у людини. Проте в осіб з імунодефіцитними станами або тих, хто переніс складні операції, трансплантації органів і тканин, вони можуть спричиняти бактеріємію, гнійно-септичні ускладнення.
Диплококи (diploos - подвійний) - група коків, які після поділу не розходяться, а існують парами. Типовими представниками є збудники епідемічного цереброспінального менінгіту та гонореї (рис. 2.7). Ці мікроорганізми мають характерну бобовоподібну форму і в мазках увігнутими сторонами повернуті один до одного. Збудники крупозної пневмонії та деяких інших гнійно-септичних процесів також належать до диплококів, але мають ланцетоподібну форму або форму полум’я свічки.
Стрептококи (streptos - намисто) - мікроби, які після поділу в одній площині не розходяться, а формують ланцюжки (рис. 2.8), що складаються з 3-4, а деколи й десятків клітин круглої або еліпсоподібної форми. Частина їх є сапрофітами, представниками нормальної мікрофлори людини, інші викликають важкі гнійно-септичні процеси (пневмонію, менінгіт, остеомієліт, холецистит, сепсис тощо). Доказана роль стрептококів у розвитку скарлатини, ревматизму, бешихи.
Тетракоки (tetra - чотири) - коки, які після поділу у двох взаємно перпендикулярних площинах утворюють тетради. Як правило, ці мікроорганізми непатогенні для людини.
Сарцини (sarcina - пака, тюк) - коки, у яких поділ відбувається в трьох взаємно перпендикулярних площинах, а після поділу вони не розходяться і розташовуються у вигляді паків з 8, 16, 32, 64 клітин. Патогенних представників серед них немає.
Стафілококи (staphyle - гроно) - коки, які діляться в декількох площинах, клітини розташовуються хаотично, у вигляді скупчень, що в мазках із чистої культури нагадують виноградне гроно. Стафілококи - убіквітарні мікроби, зустрічаються в повітрі, грунті, організмі людини і тварин. Чисельні їх представники спричиняють різноманітні гнійно-септичні захворювання: фурункул, карбункул, гідроаденіт, флегмону, нефрит, холецистит, менінгіт, пневмонію, сепсис тощо. Практично в організмі людини немає органів і тканин, які не ушкоджуються стафілококами.
Не менш дивовижний світ паличкоподібних або циліндричних бактерій, які за своєю кількістю перевищують кокові мікроорганізми. Середні розміри їх 0,5-1,5 мкм завдовжки і 0,5-2 мкм завширшки.
Паличкоподібні бактерії мають різноманітну форму (циліндричну, еліпсоподібну, овальну, веретеноподібну, у вигляді барабанної палички або тенісної ракетки). Їх кінці можуть бути рівні або нібито обрублені й навіть увігнуті (збудник сибірки), заокруглені (кишкові палички, збудники черевного тифу, дизентерії). Зустрічаються паличкоподібні форми із загостреними кінцями (фузобактерії), булавоподібними потовщеннями на них. Часто трапляються мікроби, що мають розгалуження (мікобактерії туберкульозу). Це дозволяє розпізнавати вид мікроорганізмів, що має велике значення при лабораторній діагностиці.
Паличкоподібні бактерії, залежно від здатності утворювати спори та їх діаметру, поділяють на власне бактерії, бацили і клостридії.
Власне бактерії - мікрооганізми, які не здатні до утворення спор. До них належать збудники сальмонельозів, черевного тифу, дифтерії, туберкульозу, кашлюка.
Бацили (bacillus - паличка) і клостридії (closter - веретено) здатні утворювати спори. До першої групи належать збудники сибірки, до другої - збудники газової анаеробної інфекції, правця, ботулізму.
За аналогією з коками, залежно від способу розташування у мазках, паличкоподібні мікрооганізми поділяють на: а) монобактерії (кишкова (рис. 2.8), черевнотифозна, дизентерійна палички, збудник чуми (рис. 2.9)) і монобацили (збудники правця (рис. 2.10), ботулізму (рис. 2.11)); б) диплобактерії (клебсієли пневмонії (рис. 2.12)) і диплобацили; в) стрептобактерії (збудники м’якого шанкру (рис. 2.13)) і стрептобацили (збудники сибірки (рис. 2.14)).
Спіралеподібні бактерії мають звивисту, штопороподібну форму. До цієї групи бактерій належать вібріони, спірили, спірохети.
Вібріони (vibrare - коливатись, тремтіти) - бактерії, з одним невеликим вигином розміром 1/4 завитка спіралі, що надає їм схожість із комою (рис. 2.15). Представниками цієї групи є збудники холери і холероподібні вібріони, які населяють водоймища.
Спірили (spira - завиток, спіраль) - бактерії, які мають декілька вигинів, що надає їм форму штопора. Патогенним представником є спірила, яка викликає у людини содоку (хворобу укусу щурів). До цієї групи мікроорганізмів належать також кампілобактерії та гелікобактерії, які здатні спричиняти у людини захворювання шлунково-кишкового тракту, сечостатевої системи.
Спірохети (speira - виток, haite - довге волосся) також мають штопороподібну форму і розрізняються між собою числом завитків і довжиною (довжина може сягати 500 мкм, а діаметр збудників - 0,3-1,5 мкм). Серед них виділяють патогенні для людини трепонеми (trepo - повертати, nemo - нитка)(рис. 2.16) , борелії (за прізвищем французького бактеріолога A. Боррела) (рис. 2.17) і лептоспіри (leptos - тонкий, ніжний) (рис. 2.18). Tрепонеми викликають у людини сифіліс, лептоспіри - лептоспіроз, борелії - поворотний тиф. Існує велика група непатогених спірохет (власне спірохети, сапроспіри, кристиспіри).
Ниткоподібні бактерії для людини непатогенні. Тіобактерії та залізобактерії є мешканцями грунтів, водоймищ, беруть участь у процесах кругообігу речовин у природі. До цієї групи мікроорганізмів можна віднести й актиноміцети, які здатні викликати у людини тяжкі захворювання - актиномікози.
Описані морфологічні форми бактерій не обмежують існування мікробного царства. Деякі його представники можуть нагадувати кільце, шестикутну зірку, набувати червоподібної форми. Це, в основному, вільноживучі мікроорганізми, які беруть участь у процесах біодеградації різноманітних природних сполук. Патогених представників серед них немає, і в курсі медичної мікробіології вони не розглядаються.
Ультраструктура бактеріальної клітини. Бактеріальні клітини є прокаріотичними живими системами. Між ними та еукаріотами (eu - справжній, karyon - ядро) існують суттєві відмінності, які дозволяють віднести представників мікробного світу до єдиного царства. Слід пам’ятати, що в еукаріотів тканини та органи складаються з окремих клітин, що знаходяться у фізіологічній метаболічній залежності і не можуть існувати окремо. Мікробна клітина - абсолютно автономний складний організм, здатний до самостійного, індивідуальнго існування.
Найсуттєвішою ознакою прокаріотів є відсутність ядра. Його роль відіграє нуклеоїд - ядерна речовина, яка дифузно розташована в цитоплазмі та не відмежована від неї каріолемою. Нуклеоїд клітини складається з однієї нитки ДНК, замкненої в кільце, гістоноподібні білки та ядерце відсутні. У бактерій немає таких органел, як мітохондрії, апарат Гольджі, ендоплазматичний ретикулюм, хлоропласти, мікротільця. Проте вони мають мезосоми, функція яких аналогічна мітохондріальній. Константа седиментації мікробних рибосом складає 70S, в той час як в еукаріотів - 80S. Існують також суттєві відмінності за будовою джгутиків, наявністю вакуолей тощо.
Незважаючи на такі кардинальні відмінності в структурі клітин різних систем, загальний план їх будови залишається подібним. Прокаріотний організм містить у собі майже всі клітинні елементи: оболонку, цитоплазму, ядерний апарат, включення (рис. 2.19),(рис. 2.20).
Нуклеоїд. Ядерний апарат бактеріальної клітини займає її центральну частину, має неправильну форму і не відмежовується від цитоплазми оболонкою, поєднується з цитоплазматичною мембраною і мезосомою (рис. 2.21). Він складається з однієї суперспіралізованої подвійної нитки ДНК діаметром до 2 нм, замкнутої в кільце, інтегрованої з РНК, РНК-полімеразою та білком у співвідношенні 1:1:3. Довжина цієї гігантської молекули може сягати до 1,5-3 мм. Молекулярна маса нуклеоїда - (1-3)х109 дальтон, і містить він до 8х106 пар нуклеїнових основ. Вміст пар основ А+Т і Г+Ц в молекулі кожної клітини є постійним для певного виду бактерій, а частка Г+Ц у загальній молекулярній масі становить 23-75 %.
Як правило, в клітині нуклеоїд представлено однією копією, проте під час поділу клітини число цих копій може збільшуватись до 2-9.
Досить часто бактерії поруч із хромосомною містять позахромосомну ДНК значно менших розмірів, також скручену в кільце і локалізовану в цитоплазмі. Такі елементи одержали назву плазміди. Вони детермінують синтез деяких речовин, ферментів, забезпечують стійкість бактерій до антибіотиків, отже, надають їм певних селективних переваг.
Ядерну субстанцію мікробів можна виявити в ультратонких зрізах при дослідженні їх в електронному мікроскопі, за допомогою імунофлуоресцентної, радіоімунної мікроскопії, радіоавтографії, а також забарвлюючи її за методами Робіноу-Фельгена, Пікарського тощо.
Цитоплазма бактерійних клітин має рідку консистенцію, прозора, гомогенна, відмежовується від зовнішнього середовища цитоплазматичною мембраною. Вона є своєрідною колоїдною системою, що складається з різноманітних молекул білків, ліпідів, води, ДНК і РНК, вуглеводів, полісахаридів та інших сполук. В’язкість її у 800-8000 разів перевищує аналогічний показник води. Будова і консистенція цитоплазми залежить від віку мікроба - гомогенна у молодих клітин вона поступово перетворюється на дрібнозернисту структуру в старих, набуваючи вигляду щільників. У ній з’являються вакуолі, волокнисті утворення, збільшується її густина, за консистенцією вона нагадує гель.
При ультрацентрифугуванні цитоплазми можна одержати “розчинну” фракцію, до якої входять різноманітні ферменти, і фракцію “часток” з мембран та рибосом. Рибосоми виконують роль фабрики синтезу білка, їх розмір досягає 16х18 нм. Складаються вони з двох білкових субодиниць 30S-50S. Клітина може містити до 5000-50000 рибосом, число їх збільшується при активному синтезі білка. Часом рибосоми збираються у скупчення, які називають полірибосомами або полісомами.
Відмінності між рибосомами еукаріотичних та прокаріотичних організмів мають вирішальне значення у пошуках шляхів боротьби з останніми як збудниками інфекційних захворювань. Відомо, що деякі антибіотики здатні частково або повністю припиняти синтез білка саме на 70S рибосомах, залишаючи інтактними 80S рибосоми.
У процесі життєдіяльності мікрооганізмів у цитоплазмі з’являються морфологічно диференційовані частки, які називають включеннями. Вони бувають різними за своєю природою і виконують різноманітні функції.
Запасні речовини прокаріотів представлено полісахаридами, ліпідами, поліпептидами, поліфосфатами, сіркою. Як полісахариди відкладаються крохмаль, глікоген, гранульоза. У несприятливих умовах вони забезпечують клітину вуглецем та енергією.
Ліпіди можуть накопичуватись у вигляді гранул b-оксимасляної кислоти, їх можна побачити навіть при звичайній мікроскопії, забарвлюючи препарати суданом ІІІ або суданом чорним.
Широко розповсюджений тип поживних речовин - поліфосфати. Вони містяться у гранулах, які називають волютиновими, і використовуються клітинами як джерело фосфору. Крім того, вони мають макроергічні фосфатні зв’язки, отже, забезпечують потреби клітини в енергії. Зерна волютина називають ще метахроматичними включеннями, тому що вони забарвлюються в колір, невластивий основному барвнику. Наприклад, метиленова синька забарвлює їх у темно-фіолетовий колір, в той час як цитоплазму клітини - в голубий (рис. 2.22). Вперше включення такого типу було знайдено у Spirillum volutans, звідки вони й одержали таку назву. Наявність зерен волютину характерна для коринебактерій і, зокрема, для збудника дифтерії.
Аналогічну функцію забезпечення енергетичних потреб клітини можуть виконувати включення колоїдної сірки, а в деяких анаеробних мікроорганізмів вона виступає ще й донором електронів у біохімічних процесах.
Деколи у бактерій з’являються особливі утворення, які називають вакуолями. Їм відводять роль сховища різноманітних бактеріальних ферментів, а також резервуара, де скупчуються непотрібні клітині продукти обміну.
Оболонка бактерій складається з цитоплазматичної мембрани, клітинної стінки і капсули.
Вміст клітини відмежовується від навколишнього середовища за допомогою цитоплазматичної мембрани (ЦПМ) - м’якого, пластичного утворення. Її будова у прокаріотів і еукаріотів подібна, що свідчить про існування універсальної “елементарної мембрани”. Відрізняються вони тільки відсутністю стеролів у перших. Мембрана - обов’язковий структурний компонент мікробної клітини, без неї вони гинуть. За хімічним складом вона є білково-ліпідним комплексом із невеликою кількістю вуглеводів. Формуючи всього 8-15 % маси клітини, мембрана містить до 70-90 % її ліпідних субстанцій.
Дослідження під електронним мікроскопом показали, що мембрана є багатошаровим утворенням (рис. 2.23). Вона складається з подвійного шару фосфоліпідних молекул. Гідрофобні їх кінці (фосфоліпіди та тригліцериди) спрямовані всередину, а гідрофільні “головки” - назовні. Такий тип розташування стабілізує мембрану. В цей шар вмонтовано інтегральні білки, які пронизують його наскрізь. Деякі групи білків прикріплюються до поверхні мембрани, тому їх називають периферійними. Деколи мембрана покривається ще одним особливим типом білка - поверхневим.
Елементарна мембрана здатна утворювати інвагінати, які називаються мезосомами (рис. 2.24). Вони відіграють велику роль у життєдіяльності клітини, постачаючи її енергією та беручи активну участь у процесах реплікації нуклеоїда.
Функції мембранного комплексу різноманітні: він забезпечує селективну проникність та транспорт різноманітних речовин іззовні всередину і навпаки завдяки існуванню в ньому особливих білків-ферментів пермеаз; здійснює транспорт електронів та окисне фосфорилювання субстратів; генерує електрохімічну енергію трансмембранного потенціалу; виділяє гідролітичні ферменти; проявляє біосинтетичну активність; є місцем прикріплення джгутиків.
Виявити цитоплазматичну мембрану можна в ультратонких зрізах бактерій під електронним мікроскопом.
Деякі поверхнево-активні речовини і антибіотики (поліміксини) здатні руйнувати мембрану і викликати загибель клітини. Це використовується в пошуках оптимальних шляхів боротьби зі збудниками інфекційних хвороб.
Клітинна стінка. Клітинна стінка створює захисний шар, який врівноважує високий внутрішній осмотичний тиск бактерій (5-20 атмосфер). Таку міцність забезпечує речовина - муреїн, пептидоглікан. Він складається з особливих полімерних ланцюгів, у яких чергуються залишки N-ацетилмурамової кислоти і N-ацетилглюкозаміну, в свою чергу сполучених між собою b-1,4-глікозидними зв’язками. Залишки мурамової кислоти з’єднуються пептидними зв’язками із тетрапептидами амінокислот: L- і D-аланіну, D-глутамінової та мезодіамінопімелінової кислот, L-лізину. Пептидними містками такі гетерополімерні ланцюги зв’язуються між собою, утворюючи гігантський муреїновий мішок (рис. 2.25). Те, що до складу бактерій входять речовини, відсутні в тваринних і рослинних клітинах (N-ацетилмурамова кислота і N-ацетилглюкозамін), створює можливість цілеспрямованого знищення бактерій деякими антибіотиками (пеніциліни, цефалоспорини), оскільки клітинні стінки еукаріотів при цьому не пошкоджуються.
Створена з муреїну структура виконує функцію опорного каркасу, надаючи форму мікробній клітині, крім того, з ним зв’язуються інші речовини.
За особливостями будови мікробного муреїнового каркасу і вмістом деяких речовин у клітинній стінці можна відрізнити так звані грампозитивні бактерії від грамнегативних. Поділ їх на ці дві групи було запропоновано у 1884 р. Христіаном Грамом, який звернув увагу на особливості фарбування мікробів.
У грампозитивних бактерій муреїновий шар складає 30-70 % маси клітинної стінки, утворюючи до 40 шарів. Замість мезодіамінопімелінової кислоти в ньому міститься LL-діамінопімелінова кислота або лізин. Суттєвою особливістю є наявність особливих тейхоєвих кислот .
Під електронним мікроскопом таку клітинну стінку видно як губчасту структуру з порами діаметром 1-6 нм.
Грамнегативні бактеріальні клітини мають значно складнішу будову стінки. До її складу входить більше розмаїття біологічних молекул. Муреїновий шар у них одношаровий, складає до 10 % маси сітки. Він містить мезодіамінопімелінову кислоту, немає лізину, а міжпептидні містки відсутні. Тейхоєвих кислот у стінці також немає. Зовні до муреїнового шару прилягає шар ліпопротеїну, який переходить у зовнішню мембрану, що складається з білків, фосфоліпідів і ліпополісахаридів, типових для елементарних мембран. Над мембраною, інтегруючись із нею, розміщується ліпополісахарид. Він має внутрішнє й зовнішнє полісахаридне ядро, пов’язане з ліпідом А. За зовнішніми специфічними боковими ланцюгами ліпополісахаридів збудники можна диференціювати один від іншого, що використовується при ідентифікації. Ліпід А забезпечує токсичні властивості мікробної клітини, викликаючи в людини підвищення температури, пронос та інші прояви хвороби.
Клітинна стінка крім опорної та захисної виконує ще ряд важливих функцій. Зокрема, вмонтовані у фосфоліпідний шар трансмембранні білки (порини) - це заповнені водою канали, через які проходять низькомолекулярні сполуки. Периплазматичний простір між цитоплазматичною мембраною та клітинною стінкою у грамнегативних бактерій виступає сховищем для різноманітних ферментів - деполімераз, протеїназ, нуклеаз, рестрикційних ферментів, відіграє роль у забезпеченні осморегуляції.
Під впливом різноманітних речовин клітинна стінка може бути знищена. Так, при дії лізоциму на суспензії грампозитивних мікрококів виникає їх швидкий лізис і просвітління середовища. Аналогічний ефект спричиняє пеніцилін. Лізоцим розриває в муреїні глікозидні зв’язки, а пеніцилін попереджує утворення пептидоглікану, що супроводжується руйнуванням клітинної стінки. При цьому утворюються чутливі до осмотичних умов округлі клітини - протопласти, у яких повністю втрачена клітинна стінка. При дії вказаних препаратів на грамнегативні бактерії формуються клітини, які зберігають рештки клітинної стінки. Їх називають сферопластами.
Протопласти і сферопласти належать до субклітинних форм бактерій. Вони мають круглу форму, високочутливі до осмотичних умов середовища, утворюють спори, якщо був ініційований процес споруляції, але не мають здатності до розмноження. Сферопласти, на відміну від протопластів, здатні адсорбувати на своїй поверхні бактеріофаги і відновлюватись у вихідні форми при відміні дії чинників, які викликали їх утворення.
В організмі людини і тварин при антибіотикотерапії (пеніцилін, бацитрацин, новобіоцин) створюються умови для порушення синтезу пептидоглікану, а бактерійні клітини, втрачаючи свою клітинну стінку, перетворюються в L-форми. Це клітини до 50 мкм у діаметрі, які зберігають тенденцію до перетворення у вихідні форми, продукують токсини, гіалуронідазу. Описані такі форми бактерій у збудників гонореї, туберкульозу, черевного тифу, бруцельозу та інших. Вони здатні викликати у людини захворювання, які супроводжуються тривалим перебігом. Утворення таких форм мікроорганізмів вважають за спосіб переживання несприятливих факторів зовнішнього середовища.
Слід відмітити, що в природі існують мікроорганізми, у яких немає клітинної стінки. Вони називаються мікоплазмами і мають виражені патогенні властивості, викликаючи різноманітні захворювання дихальної, серцево-судинної, сечо-видільної систем.
Клітинну стінку мікробів можна зруйнувати лугом, ультразвуком, механічним методом. Виявити її можна різними способами: спостерігаючи в електронному, фазовоконтрастному та аноптральному мікроскопах, при мікроскопії автолізованих бактерій, застосовуючи спеціальні методи забарвлення (шафраніном, синьою вікторією).
У лабораторних умовах легко дослідити наявність клітинної стінки, використовуючи явище плазмолізу. При цьому клітину занурюють у гіпертонічний розчин хлориду натрію або 0,2М розчин нітрату калію. Вода за градієнтом концентрації виходить із клітини назовні, цитоплазматична мембрана разом із цитоплазмою зморщуються, відшаровуючись від стінки, яка зберігає форму бактеріальної клітини і стає видимою під мікроскопом.
Капсула. Зовні бактеріальна клітина може бути вкрита речовиною слизового характеру. Вона не має для мікроба життєзабезпечуючого значення, однак захищає його від дії несприятливих факторів зовнішнього середовища, надає стійкості до фагоцитозу, захищає від проникненя бактеріофагів, забезпечує вірулентні властивості збудників (рис. 2.27). За своєю хімічною будовою капсула належить до полісахаридних субстанцій, а у B. anthracis - до білкових. Характерним для капсули є наявність великої кількості води.
У деяких мікроорганізмів капсула утворюється тільки в організмі тварин або людини (пневмококи, збудники сибірки, чуми та ін.), у інших (клебсієли) вона присутня постійно, навіть коли збудник росте на живильному середовищі. Інколи капсула оточує разом декілька клітин (сибіркова бацила), тоді такі утворення називають зооглеями.
Стафілококи, збудники дифтерії, деякі стрептококи та інші бактерії здатні утворювати мікрокапсули, особливо при культивуванні на середовищах, багатих на вуглеводи.
Капсулу можна розглядати у звичайному світловому мікроскопі, якщо забарвлювати нативні препарати простим методом. Однак для виявлення капсул частіше використовують метод Буррі-Гінса, при якому фон препарата створюють тушшю, а мікроорганізм додатково забарвлюється фуксином. У таких випадках на темному фоні видно червону паличку, яка оточена світлим ободком - капсулою.
Джгутики. Поверхня тіла мікроорганізмів може бути вкрита особливими виростами, що називаються джгутиками, які забезпечують локомоторну функцію. Їх число, спосіб розміщення, довжина є постійними ознаками для певного виду бактерій, що враховується при проведенні систематики прокаріотичних організмів (рис. 2.28).
Довжина джгутиків досягає 20 мкм, тоді як товщина - всього 12-18 нм, що лежить за межами роздільної здатності мікроскопа. Джгутики бактерій складаються із спірально закручених ниток особливого білка флагеліну, який утворює спіраль навколо внутрішнього порожнистого простору (рис. 2.29). У них виділяють три основні частини: спіральну нитку, гак та базальне тіло (два - чотири спеціальних кільця з центральним стержнем), за допомогою яких джгутик закріплюється у цитоплазматичній мембрані та клітинній стінці).
Джгутики асоціюють з білковим Н-антигеном мікробної клітини, визначення якого має певне значення в лабораторній діагностиці інфекційних хвороб.
За способом розташування джгутиків мікроорганізми поділяються на ряд груп (рис. 2.30). Монотрихи - бактерії, що містять джгутик на одному з полюсів клітини (холерний вібріон). Такі мікроорганізми найрухоміші серед інших: за 1 с вони здатні переміщуватись на віддаль, яка у 20 разів перевищує довжину їх тіла. Лофотрихи мають пучок джгутиків на одному з полюсів (псевдомонади, Bacillus megaterium). У амфітрихів джгутики або їх пучки розташовані на обох полюсах (спірили). Перитрихи мають джгутики, розміщені по всій поверхні тіла мікроба (протей, ешерихії, сальмонели), число їх може досягати 1000.
Виявити джгутики можна за допомогою прямих та непрямих методів. При непрямих методах спостерігають за рухом мікроорганізмів у темному полі мікроскопа, у “висячій” чи “роздавленій” краплях, за допомогою фазово-контрастної, аноптральної мікроскопії. За допомогою прямих методів джгутики забарвлюють барвниками, або солями металів, попередньо наносячи на них протраву для збільшення у розмірах, або досліджують на ультратонких зрізах під електронним мікроскопом.
Рух джгутиків забезпечується енергією трансмембранного потенціалу, яка генерується на цитоплазматичній мембрані. У більшості мікробів з полярним розташуванням джгутиків вони обертаються зі швидкістю 3000 обертів за 1 хв.
Джгутики мають пристосувальне значення. Вони надають клітині змогу переміщуватись у рідкому середовищі в пошуках більш сприятливих умов існування. У відповідь на зовнішні подразнення (хімічні речовини, температура тощо) або спонтанно здатні змінювати характер свого обертання і напрям руху. Це називають таксисом. Відповідно до факторів, що його викликають, розрізняють хемотаксис, фототаксис, аеротаксис.
До поверхневих структур бактерійної клітини належать різноманітні придатки, які позначають терміном пілі (pilus - волос): стебельця, шипики тощо. Особливим типом таких утворень є ворсинки, фімбрії (fimbria - торочка). Їх число може перевищувати 10000, довжина сягає до 2 мкм, а товщина - 3-25 нм. Як і джгутики, вони складаються з білкових субодиниць. Описані ворсинки двох класів. Загальні ворсинки (1-го класу) забезпечують адгезію (прикріплення) мікроба до субстрату, через них всередину клітини можуть проникати деякі метаболіти і навіть бактеріофаги. Ворсинки 2-го класу (статеві) беруть участь у передачі генетичної інформації від клітини до клітини при кон’югації (рис. 9).
Спороутворення. На певній стадії свого розвитку, коли запаси поживних речовин вичерпуються, бактерії всередині формують спору (ендоспору) округлої форми (рис. 2.31). Від вегетативних форм вони відрізняються пригніченням функціонування генетичного апарата, майже повною відсутністю обміну речовин, малою кількістю вільної води, підвищеною концентрацією іонів кальцію, появою у складі дипіколінової кислоти, з якою пов’язують термостійкість спор. Для них характерна поява додаткових оболонок, які запобігають дифузії і проникненню речовин іззовні, більш висока стійкість до пошкоджуючих факторів зовнішнього середовища і здатність тривалий час зберігати свою життєздатність. Спори утворюють два роди грампозитивних паличок - Bacillus (спора за діаметром менше поперечника палички) i Clostridium (спора перевищує розміри палички) і один рід грампозитивних коків (Sporosarcina).
Спори утворюються тільки в зовнішньому середовищі, в організмі тварин та людини процесу споруляції не відбувається. Вони мають еволюційне значення, забезпечуючи збереження виду, а не виконуючи функцію розмноження (рис. 10).
Спороутворення починається, коли в оточуючому клітину середовищі зникають джерела азоту та вуглецю.
Спочатку в клітині при інвагінації мембрани виділяється особливе термінальне ядро, яке містить один клітинний геном, компоненти апарата синтезу білка і власну енергетичну систему. Воно вкривається власною мембраною та мембраною материнської клітини, які утворюють стінку спори. Вона складається з нормального пептидоглікану. Стінку оточує кора, яка містить незвичний пептидоглікан з малим числом поперекових з’єднань і чутливий до лізоциму (автоліз його відіграє вирішальну роль у процесі проростання спори). Оболонка спори складається з кератиноподібного білка і зумовлює погану проникність і стійкість його до хімічних речовин. Екзоспорій оточує всю спору і складається з ліпопротеїнів (рис. 2.32).
Індукція спороутворення відбувається протягом декількох годин. Розрізняють декілька стадій: підготовчу, передспори, утворення оболонок і дозрівання.
Процес проростання спори також відбувається у декілька етапів. Під час фази активації діючий фактор пошкоджує оболонку спори (висока температура, механічні пошкодження, зміна рН середовища в кислу сторону). На ініціальній (початковій) стадії спора за сприятливих умов починає проростати, поглинає воду, руйнується пептидоглікан кори. На стадії росту внаслідок руйнування оболонок утворюється нова вегетативна клітина. Процес триває протягом 4-6 годин.
Залежно від локалізації спор виділяють такі типи їх розміщення (рис. 2.33): центральне (сибіркова бацила), субтермінальне, коли спора розташовується ближче до одного з кінців, тоді паличка нагадує тенісну ракетку (збудники ботулізму), i термінальне, коли спора знаходиться на кінці мікроба, надаючи йому вигляду барабанної палички (збудники правця).
Спори тривалий час зберігаються в стані анабіозу. У грунті вони можуть перебувати понад 200 років. Знайдено спорові мікроорганізми у льодовиках Антарктиди, вік яких оцінюється в 12 тис років.
Ендоспори бактерій характеризуються високою термостійкістю. Наприклад, спори cінної палички витримують кип’ятіння протягом 3 год. Саме резистентність спор примусила мікробіологів винайти автоклав, розробити надійні способи стерилізації. При автоклавуванні під тиском 1,5-2 атмосфери і температурі 127-132 °С спори гинуть.
Наявність спор у бактерій може мати діагностичне значення, а також спричиняє вибір тактики при знезаражуванні хірургічного інструментарію та перев’язного матеріалу.
Спори мають здатність сильно заломлювати світло, тому на незафарбованих препаратах їх видно у вигляді блискучих зерен. У зв’язку з тим, що вони стійкі до дії несприятливих факторів зовнішнього середовища, забарвлювати їх досить важко. Найчастіше використовується метод Ожешко, при якому спори попередньо протравлюють соляною кислотою, а потім забарвлюють за методом Ціля-Нільсена. Спори при цьому набувають червоного, а вегетативна клітина - голубого забарвлення.Морфологічні особливості окремих груп мікроорганізмів
Актиноміцети. Актиноміцети (aktis - промінь, mykes - гриб) - одноклітинні бактерії, які раніше вважали грибами через здатність клітин галузитись. Вони належать до родин Actinomycetaceae та Nocardiaceae, до складу яких входить понад 400 різноманітних видів. Будова актиноміцетів подібна до структури звичайної мікробної клітини (рис. 2.34), однак існують деякі відмінності за хімічним складом цукрів. Актиноміцети, як правило, сапрофіти, вільно живуть у грунті, забезпечуючи його плодючість і запах, та інших об’єктах зовнішнього середовища. Багато з них є продуцентами антибіотиків (стрептоміцин, тетрацикліни).
Проникаючи в організм людини або тварин, за певних умов актиноміцети здатні викликати захворювання з хронічним перебігом - актиномікоз та нокардіоз. Збудниками їх є Actinomyces israelii (рис. 2.35), A. bovis, A. naeslundіі, Nocardia asteroides (рис. 2.36). Найчастіше ушкоджуються шкіра, підшкірна клітковина з утворенням нориць, лімфатичні вузли, органи дихання. У тканинах, уражених актиноміцетами, знаходять особливі структури - скупчення видозміненого міцелію, які називають друзами.
Патогенні спірохети. Це особлива група грамнегативних звивистих мікроорганізмів, які мають вигляд довгих, спірально закручених, тонких ниток. Довжина їх коливається в межах 7-50, а товщина - 0,3-0,5 мкм. Вони належать до порядку Spirochaetales, який об’єднує три патогенних для людини роди: Treponema, Borrelia і Leptospira, які відрізняються між собою за рядом ознак.
Спільним для всіх спірохет є наявність цитоплазматичного циліндра, відмежованого ЦПМ і вкритого тришаровою клітинною стінкою (рис. 2.37),(рис. 2.38). Він намотаний навколо фібрилярного апарата, що складається з білка флагеліну, і розташований всередині клітини. Фібрили прикріплюються до дисковидних утворень на кінцях збудників, які називаються блефаропластами. У цитоплазмі знаходиться нуклеоїд, рибосоми, мезосоми, включення. Спор і капсул мікроби не утворюють, однак при несприятливих умовах здатні формувати цисти. Спірохети мають різні типи рухів: згинальний, поступальний, обертальний, маятникоподібний.
Число і форма завитків характерні для кожного виду спірохет. Вони формують завитки І порядку. У трепонем є 8-14 завитків І порядку, однакових за формою та величиною. У борелій нараховується 4-8 великих завитків неправильної форми, неоднакових за величиною. Ці мікроорганізми найбільші серед патогенних спірохет. Лептоспіри мають 12-18 завитків І порядку, але вони дрібні й тісно прилягають один до одного, під звичайним світловим мікроскопом практично не диференціюються. На кінцях мікроби мають вторинні завитки, що надає їм S-, С-подібної форми, робить схожими на гачок (рис. 2.39).
За методом Романовського-Гімзи лептоспіри забарвлюються в блідо-рожевий колір, трепонеми - в рожевий, борелії - в синьо-фіолетовий.
Патогенними для людини є Treponema pallidum, яка викликає сифіліс, Borrelia recurrentis - збудник епідемічного поворотного тифу, B. duttoni, B. сaucasica - збудники ендемічного поворотного тифу, а також Leptospira interrogans, що спричиняє у людини лептоспіроз.
Рикетсії. Це прокаріотичні мікроорганізми з родини Rickettsiaceae, що одержали свою назву від прізвища американського дослідника Г. Рікетса, який загинув від лабораторного зараження висипним тифом.
Рикетсії - дрібні плеоморфні бактерії розміром 0,3-0,6 х 0,4-2 мкм (рис. 2.40). Їх поділяють на чотири морфологічних типи: кокоподібні, паличкоподібні, бацилярні та ниткоподібні(рис. 2.41).
Вони мають типову структуру бактеріальної клітини. У них є оболонка, цитоплазма, нуклеоїд. Будова їх клітинної стінки ідентична грамнегативним бактеріям. Рикетсії нерухомі, не утворюють спор і капсул. Вони містять велику кількість ліпідів (до 46 %), тому використання методу Грама для їх фарбування обмежене. Найчастіше для цього слугують методи Романовського-Гімзи (мікроби фарбуються в голубий колір, а ядерна субстанція - в червоний), Здродовського (рикетсії рубіново-червоні, а клітинні елементи - блідо-голубі), негативне контрастування Айзенберга (незафарбовані рикетсії чітко виявляються на голубому фоні).
На поживних середовищах рикетсії не ростуть, їх можна культивувати в організмі лабораторних тварин, у жовтковому мішку курячого зародка, у легенях білих мишей, у кишечнику вошей.
Рикетсії - унікальні прокаріотичні мікроорганізми. У них поєднуються біологічні властивості прокаріотичних живих систем і вірусів. З першими їх єднає типова будова клітини, а з вірусами - те, що вони є облігатними внутрішньоклітинними паразитами, а також високий вміст ліпідів у цитоплазмі та клітинній стінці.
Більшість рикетсій непатогенні для людини. Вони паразитують на членистоногих. Однак деякі види здатні викликати важкі захворювання у людей, які називаються рикетсіозами. Серед них висипний тиф, марсельська лихоманка, гарячка Цуцугамуші, Ку-гарячка та інші. Збудниками цих та інших рикетсіозів є Rickettsia provazekii, R. typhi, R. tsutsugamushi, Coxiella burnetii.
Велику роль у передачі та розповсюдженні рикетсіозів відіграють воші, блохи та кліщі.
Хламідії. Хламідії є дрібними, кокоподібними, нерухомими бактеріями. Вони аспорогенні, не утворюють капсул, грамнегативні. Належать до родини Сhlamydiaceae. Не ростуть на живильних середовищах, є облігатними внутрішньоклітинними паразитами. Поза клітиною людини вони існують у вигляді маленьких тілець діаметром до 0,3 мкм. Протягом свого життєвого циклу хламідії проходять три стадії існування в клітині, утворюючи елементарні, ініціальні та проміжні тільця (рис. 2.42). Тривалість циклу розвитку хламідії - 36-72 год.
Хламідії (Chlamydia trachomatis, C. psittaci) здатні викликати небезпечні захворювання у людини: трахому, паховий лімфагранульоматоз, уретрити, кон’юнктивіти новонароджених, бленорею з включеннями, орнітоз, пневмонію, поліартрит, гастроентерит, менінгоенцефаліт.
Мікоплазми. Мікоплазми є аспорогенними прокаріотичними організмами, які не мають ригідної клітинної стінки (рис. 2.43). Вони - поліморфні, сферичні або овоїдні утворення діаметром до 0,2 мкм, однак бувають і клітини діаметром до 1,5 мкм і більше. Мікоплазми не утворюють спор, грамнегативні. Вони мають типову будову бактеріальної клітини, але в них відсутня клітинна стінка.
Мікоплазми вибагливі до живильних середовищ, вимагаючи додавання до них холестеролу, нативного білка, пуринових та піримідинових основ та інших компонентів (рис. 2.44),(рис. 2.45).
Вони часто зустрічаються в стічних водах, грунті, паразитують в організмі людини і тварин. У людини вони спичиняють пневмонії, бронхіоліти, ангіни, уретрити, простатити, ураження придатків матки, артрити, ендокардити тощо. Найчастіше захворювання викликають Mycoplasma pneumoniae, M. hominis, Ureaplasma urealyticum.
Патогенні найпростіші. Об’єктом дослідження в мікробіології виступає група еукаріотичних мікроорганізмів, які називаються найпростішими. Вони належать до типу Protozoa і, відповідно, класів саркодових, джгутикових, споровиків та інфузорій.
Найпростіші - високоорганізовані живі системи з усіма функціями, притаманними тваринному організму розмірами від 2 до 150 мкм.
Будова їх складніша за бактерійну клітину (рис. 2.46). Вони мають чітко уособлене одне або декілька ядер з каріолемою і ядерцями, цитоплазму, яка відмежовується пеликулою, особливим видом еластичної мембрани. У них є ендоплазматичний ретикулюм, апарат Гольджі, мітохондрії, лізосоми, різні типи вакуолей як орган травлення. Деякі збудники мають особливі опорні фібрили. Рухаються вони за допомогою псевдоподій, джгутиків або війок.
Найпростіші мають складні цикли розвитку. Здатні розмножуватись безстатевим (поділом) і статевим шляхами або їх поєднанням. При несприятливих умовах вони утворюють цисти, які здатні довго зберігатись, не втрачаючи патогенних властивостей.
Найпростіші широко розповсюджені у природі. Більшість із них непатогенні для людини. Однак деякі представники мають високоінфекційні властивості та спричиняють амебіаз, трипаносомоз (рис. 2.47), лейшманіоз (рис. 2.48), урогенітальний та кишковий трихомоноз (рис. 2.49), токсоплазмоз (рис. 2.50), малярію, балантидіаз. Всі ці захворювання характеризуються тривалим і важким перебігом, ураженням численних органів і систем.
Патогенні гриби. Гриби - особлива велика група еукаріотів (понад 100000 видів), широко розповсюджена в природі, а грибкові захворювання (мікози) складають значну частину інфекційної патології людини.
Гриби представляють собою нефотосинтезуючі організми, які ростуть у вигляді ниток, що переплітаються та галузяться. Їх унікальність полягає в тому, що вони подібні за деякими ознаками як до тваринних, так і до рослинних організмів. Із тваринним світом їх зближує наявність особливої полісахаридної субстанції - хітину, участь в обміні азоту сечовини, а в обміні вуглеводів - глікогену. Однак за способом живлення - шляхом всмоктування, а не заковтування їжі, а також необмеженим ростом, вони нагадують рослини.
Клітини більшості грибів вкриті твердою оболонкою, основу якої складають азотисті та безазотисті полісахарди та целюлоза. Цитоплазматична мембрана щільно прилягає до внутрішньої поверхні клітинної оболонки (рис. 2.51). В цитоплазмі міститься чітко диференційоване одне або декілька ядер з ядерцями, центральна вакуоль, мітохондрії, мікросоми, лізосоми, рибосоми, комплекс Гольджі, пластиди, секреторні гранули, різноманітні включення - волютин, солі органічних кислот, фосфатів, солей калію, натрію, заліза, глікоген, пігменти різнобарвних відтінків.
Молоді клітини грибів, як правило, яйцевидні, дещо видовжені, зрілі стають циліндричними, а старі - грушоподібними, булавоподібними, веретеноподібними. Основу тіла гриба становлять особливі трубчасті нитки - гіфи, сукупність яких називають міцелієм. У гіфах нижчих грибів починають з’являтись перегородки, які є характерною ознакою у вищих грибів. Вони не суцільні, мають пори, через які здійснюється загальний обмін речовин. Кінцеві розгалуження міцелію мають своєрідну форму, за якою можна диференціювати окремі види. Так, гіфи міцелію дерматофітів можуть нагадувати роги оленів, канделябри, спіралі, булаву, гребінь півня тощо (рис. 2.52).
Розмноження грибів здійснюється безстатевим та статевим шляхом, що дозволило поділити їх на дві принципово відмінні групи - недосконалі та досконалі гриби. Вегетативне розмноження здійснюється брунькуванням, кусочками грибниці, спорами, які виникають внаслідок розчленування гіфів міцелію. Спори можуть розміщуватись по боках або на кінцях міцелію (екзоспори), часто в особливих утвореннях, які називаються асками або сумками (ендоспори). Статеве розмноження здійснюється шляхом злиття чоловічих та жіночих гамет, внаслідок чого утворюється зигота, яка дає початок новому грибу.
Гриби - аеробні істоти. Для їх живлення необхідні численні азотисті, вуглецевмісні та мінеральні речовини. Вони мають різноманітні ферменти, що використовується для диференціації окремих видів.
Існують різні класифікації грибів, в основу яких покладено їх природну ознаку - будову органів плодоносіння, характер плодових тіл, їх форму, величину, морфологічні особливості.
Виділяють нижчі та вищі гриби. До нижчих належать хітридіоміцети, ооміцети, зигоміцети. До вищих - аскоміцети, базидіоміцети та дейтероміцети.
Нижчі гриби непатогенні для людини. Однак окремі види мукорової плісняви (рис. 2.53) рідко уражають шкіру, очі, зовнішні слухові проходи, легені, мозкові оболонки, шлунково-кишковий тракт, здатні викликати алергію, професійні оніхомікози та пароніхії у людей, які збирають і обробляють апельсини. Захворювання називаються зигомікозами.
Аскоміцети - клас сумчастих грибів, тому що спори їх зберігаються в особливих сумках - асках, об’єднує понад 300 різноманітних видів. Вони мають міцелій з вираженими перегородками. Патогенними для людини є представники родів Aspergillus (рис. 2.54),(рис. 2.55), Penicillium (рис. 2.56),(рис. 2.57), які викликають відповідно аспергільози та пеніциліози шкіри і внутрішніх органів зовнішніх слухових проходів, а також алергічні реакції.
Велике значення в медичній практиці мають гриби роду Candida (рис. 2.58),(рис. 2.59). Вони часто є представниками нормальної мікрофлори організму людини. Але при важких хронічних захворюваннях, імунодефіцитах, злоякісних новоутвореннях, нераціональному застосуванні антибіотиків, гіповітамінозах та авітамінозах здатні викликати серйозні захворювання - кандидомікози (рис. 2.60). Молочниця у новонароджених дітей, заїди в осіб будь-якого віку, системні кандидози з ураженням шкіри, органів дихальної системи та шлунково-кишкового тракту із смертельними випадками - все це спектр дії одних і тих же дріжджоподібних грибів Candida.
Великого значення в медичній патології набула група недосконалих грибів, дейтероміцетів, до складу якої входить багато видів. Вони мають септований міцелій, їх життєвий цикл відбувається в гаплоїдному стані, без зміни ядерних фаз, статевого шляху розмноження у них ще не описано.
Ця група грибів надзвичайно різноманітна і часто є причиною розвитку в людини важких захворювань - дерматофітій, глибоких мікозів. Серед них найчастіше зустрічаються епідермофітія стоп (рис. 2.61), мікроспорія (рис. 2.62),(рис. 2.63), трихофітія (рис. 2.64),(рис. 2.65), фавус (рис. 2.66),(рис. 2.67).
Важкий і хронічний перебіг мають у людини такі мікози, як гістоплазмоз, криптококоз, північноамериканський бластомікоз або хвороба Джілкрайста-Стекса, пневмоцистоз у людей із синдромом набутого імунодефіциту та багато інших.
Однак гриби мають і велике корисне значення. Їх використовують у харчовій, парфюмерній, хімічній промисловості як продуценти різноманітних ліполітичних та інших ферментів. Із представників родів Penicillium, Cephalosporium одержують антибіотики (пеніциліни, цефалоспорини).Матеріали до практичних занять
1. Методи виготовлення мазків та прості методи фарбуванняВиготовлення препаратів-мазків з культури, яка виросла на твердому середовищі (рис. 2.68) .
Знежирене предметне скельце пропалюють у полум’ї газового пальника і після охолодження кладуть на робоче місце. Бактеріологічну петлю, тримаючи як олівець вертикально у правій руці, прожарюють у полум’ї, спочатку кінець петлі, потім її металеву частину. Не випускаючи петлі, лівою рукою беруть пробірку з 0,9 % розчином хлориду натрію і зажимають ватно-марлеву пробку 4-им і 5-им пальцями правої руки, витягують її, і край пробірки проносять через полум’я пальника. Тримають пробірку на віддалі до 20 см від полум’я, не випускаючи пробки. Петлю вводять у пробірку і охолоджують, торкаючись її стінок. Занурюючи петлю в рідину, набирають краплю фізрозчину. Виймають петлю, проводять край пробірки і пробку через полум’я, після чого її закривають і ставлять у штатив. На центр скельця бактеріологічною петлею наносять краплю фізрозчину. На добре знежиреному скельці вона розтікається рівномірно.
Знову стерилізують петлю, і в ліву руку беруть пробірку зі скошеним агаром, на якому виросла культура мікроорганізмів. Відкривають пробірку із додержанням усіх правил, охолоджують петлю і набирають нею невелику кількість культури. Петлю виймають, а пробірку закривають і ставлять у штатив.
Культуру петлею наносять біля ізотонічного розчину хлориду натрію і, поступово розтираючи його по склу та емульгуючи в краплі, готують тонкий, рівномірний мазок округлої чи овальної форми діаметром 1-1,5 см. Після цього петлю прожарюють і ставлять у штатив.
Виготовлення препаратів-мазків з культури, яка виросла в рідкому живильному середовищі.
Якщо для забору матеріалу використовують пастерівську піпетку, то її також тримають у правій руці та прожарюють у полум’ї перед внесенням у пробірку. Тонкий кінчик піпетки після охолодження біля стінки пробірки занурюють у рідину, тримаючи верхній кінець її відкритим. Після попадання в піпетку рідкого середовища з мікробами, верхній кінець її закривають вказівним пальцем правої руки, виймають з пробірки, проносять її відкритий кінець і корок через полум’я і закривають.
На поверхню предметного скельця випускають краплю середовища, а піпетку після цього занурюють у посуд із дезинфікуючим розчином, який повинен бути на кожному робочому місці. Стерильною бактеріологічною петлею роблять мазок.
Виготовлення мазків із харкотиння або гною.
Виготовлення мазків із крові.
Виготовлення мазків відбитків з органів лабораторних тварин, які загинули від експериментальної інфекції. Розжареним у полум’ї скальпелем припікають орган, з якого будуть робити мазок. Потім стерильними ножицями, тримаючи орган пінцетом, з цієї ділянки вирізають кусочок тканини. Поверхнею зрізу торкаються предметного скла у 2-4 місцях, роблячи мазок-відбиток.
Виготовлення препаратів для дослідження мікроорганізмів у живому стані. Для цього використовують методи “висячої” та “роздавленої” краплі.
Препарат для “висячої” краплі готують на покривному скельці, на яке наносять краплю бульйонної культури мікроорганізмів. Якщо використовується культура, яка виросла на агарі, спочатку на скельце наносять краплю стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду, потім у нього стерильною петлею вносять культуру мікробів.
Спеціальне предметне скельце з лункою, края якої попередньо змащені вазеліном, притуляють до покривного скельця з краплею так, щоб вона знаходилась у центрі лунки, і перевертають препарат покривним скельцем догори. Якщо препарат виготовлено правильно, то крапля вільно звисає у лунку, не торкаючись її поверхні (рис. 2.71).
Для мікроскопування спочатку використовують мале збільшення мікроскопа х8. При опущеному конденсорі для кращого контрастування знаходять край краплі, потім встановлюють об’єктив х40 і досліджують препарат.
Препарат “роздавленої” краплі відрізняється від “висячої” тим, що краплю з мікроорганізмами готують на звичайному знежиреному предметному склі, а потім покривають її покривним скельцем, стежачи за відсутністю бульбашок повітря. Умови мікроскопування аналогічні до тих, що використовуються при “роздавленій” краплі.
Після мікроскопії препарати опускають у банку з дезрозчином.
Методика виготовлення та забарвлення мазків.
Зафіксований препарат кладуть на спеціальну підставку над лотком, наносять одну-дві краплини барвника. Фарбувати мазок фуксином Пфейффера необхідно 1-2 хв, а лужним метиленовим синім - 3-5 хв.
Після забарвлення препарат промивають водопровідною водою до зникнення струмочків барвника, висушують фільтрувальним папером і мікроскопують.
У повсякденній мікробіологічній практиці найчастіше використовуються основні барвники: фуксин основний, нейтральний червоний, конго червоний (дають червоне забарвлення), метиленовий та толуїдиновий синій (голубе, синє), генціанвіолет, метиленовий фіолетовий (фіолетове), хризоїдин, везувін (жовто-коричневе), брильянтовий зелений, малахітовий зелений (зелене) та інші.
Існуючі методи фарбування можна поділити на прості й складні. При простих використовують один барвник, який надає змогу виявити, в основному, форму мікроорганізмів.
Практична робота
1.Виготовити мазок з бульйонної культури кишкових паличок і забарвити його фуксином Пфейффера.
2.Виготовити мазок з агарової культури стафілококів і забарвити його метиленовим синім.
3.Дослідити під мікроскопом порівняльні розміри мікроорганізмів і форменних елементів крові.
4.Демонстрація живих мікроорганізмів у темному полі.2. Складні методи забарвлення
При складних методах, які ще називають диференціально-діагностичними, використовують декілька різноманітних барвників, які дозволяють виявити особливості хімічного складу клітини або наявність у неї певних структур.
Для фарбування беруть розведені водно-спиртові або водно-фенолові розчини, які готують із насичених розчинів відповідних барвників.
Забарвлення мікроорганізмів за методом Грама.
Метод було розроблено Кристіаном Грамом у 1884 р. Однак до цього часу остаточно не з’ясовано механізми різного забарвлення мікроорганізмів. Вважають, що така здатність пов’язана з відмінностями у будові пептидоглікану в клітинній стінці грампозитивних бактерій, наявністю тейхоєвих кислот, вищою, порівняно з грамнегативними, концентрацією комплексу протеїн-рибонуклеїнат магнію в клітині, співвідношенням РНК:ДНК в цитоплазмі (у грампозитивних 8:1, а грамнегативних 1:1), а також більш кислим значенням рН в ізоелектричній точці цитоплазми.
Принцип методу полягає в тому, що клітини грампозитивних бактерій здатні утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом, яка не вимивається з бактерій спиртом, отже, вони забарвлюються в темно-фіолетовий колір. У грамнегативних бактерій цей комплекс вимивається спиртом, тому вони потім забарвлюються фуксином в червоний колір.
Грампозитивними є стафілококи, стрептококи, пневмококи, сарцини і монококи, бацили і клостридії, а також дифтерійні та туберкульозні палички. Грамнегативні - гонококи, менінгококи, кишкові палички, сальмонели, збудники дизентерії, рикетсії, всі звивисті бактерії та інші.
Методика забарвлення полягає в тому, що на фіксований препарат накладають клаптик фільтрувального паперу, на який наливають карболовий розчин генціанвіолету на 1-2 хв (у модифікації Синьова використовують суху полоску фільтрувального паперу, заздалегідь просочену 1 % спиртовим розчином кристалвіолету і висушену, на яку наливають 2-3 краплі води).
Барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, наливають розчин Люголя на 1 хв. Зливають розчин Люголя і знебарвлюють препарат спиртом до зникнення фіолетових струмочків барвника. Промивають його водою і додатково забарвлюють протягом 1-2 хв водним розчином фуксину Пфейффера. Барвник зливають, препарат промивають водою, висушують та мікроскопують(рис. 2.72),(рис. 2.73) .
Фарбування кислотостійких мікроорганізмів за методом Ціля-Нільсена.
На фіксованй мазок, виготовлений з мокротиння хворого на туберкульоз, кладуть листочок фільтрувального паперу, на який наносять карболовий концентрований фуксин Ціля. Препарат тримають пінцетом і тричі прогрівають у полум’ї пальника до появи пари, кожний раз остуджуючи і додаючи нову порцію барвника. Папірець знімають, а препарат промивають водою і опускають 2-3 рази в стаканчик з 5 % сірчаною кислотою або наливають цей розчин на мазок для знебарвлення. Знову ретельно промивають препарат водою і зафарбовують 3-5 хв розчином метиленового синього, промивають водою, висушують і мікроскопують.
Кислотостійкі палички забарвлюються в рубіново-червоний колір, інші бактерії та фон - у голубий (рис. 2.74).
Методика виявлення капсул. Виявлення капсул у мікрооганізмів має важливе діагностичне значення. Можна спостерігати капсули у живих бактерій. Для цього краплю суспензії мікробів наносять на предметне скло, додають краплю насиченого 3 % водного розчину конго червоного. Змішавши дві краплі разом, частину суміші наносять на чисте предметне скло і опускають на нього покривне скельце, стежачи за тим, щоб не було повітря. Надлишок рідини відсмоктують фільрувальним папером, придавлюючи скельце до предметного. Внаслідок утворення капілярного шару фарби і розміщення мікроорганізмів в один шар при мікроскопії неімерсійним або імерсійними об’єктивами спостерігають живих бактерій і утворення прозорих ореол капсул навколо них.
За методом Буррі на середину предметного скла наносять краплю туші та змішують її з краплею культури капсульних мікроорганізмів. Роблять мазок шліфованим ребром предметного скла, висушують і мікроскопують. На темному фоні видно й ободок капсули навколо незабарвлених мікробів.
Використовуючи метод Буррі-Гінса
Методика виявлення спор. На незафарбованому препараті ендоспори живих бактерій мають чорні краї та яскраво світяться у площині, дещо вище положення справжнього фокуса.
При використанні негативного контрастування 7 % розчин водного нігрозину змішують на покривному скельці з петлею культури, роблять тонкий мазок, який висушують на повітрі. Покривне скельце перевертають мазком донизу, кладуть на предметне скло, фіксуючи його воском або вазеліном. Ендоспори видно як сферичні або еліпсовидної форми об’єкти, які сильно заломлюють світло.
За методом Ожешко
Методика виявлення джгутиків. Процес забарвлення джгутиків складний і вимагає особливої ретельності від мікробіолога, оскільки товщина джгутика (10-30 нм) менше роздільної здатності мікроскопа, і щоб їх розглянути, потрібно в першу чергу штучно збільшити їх діаметр (рис. 2.77).
Скельця для препарата повинні бути абсолютно чистими та знежиреними. Як правило, використовують нові скельця після відповідної обробки.
Принцип методу Леффлера полягає в тому, що петлю 18-годинної агарової культури мікробів змішують із водопровідною водою і обережно відтягнутим кінцем пастерівської піпетки наносять декілька крапель суспензії (5) на поверхню покривного скельця, висушують і швидко проводять через полум’я пальника. На фіксований препарат наливають протраву і залишають її на 10-15 хв. Протрава складається з насиченого спиртового розчину основного фуксину, 20 % водного розчину таніну й насиченої на холоді солі Мора (сірчанокисле закисне аміачне залізо). Після цього препарат промивають дистильованою водою і забарвлюють карболовим фуксином Ціля 2-5 хв. Препарат знову промивають водою, висушують і мікроскопують.
Методика фарбування включень у бактерій. За методом Нейссера
За методом Леффлера препарат
Методика виявлення ядерної субстанції. З цією метою використовують метод Пікарського. Фіксований метиловим спиртом або сумішшю Нікіфорова препарат обробляють 1N розчином соляної кислоти, підігріваючи його до 60 °С протягом 7 хв. Після промивання його забарвлюють барвником Гімзи 10-20 хв, промивають дистильованою водою, висушують і мікроскопують. Ядерні елементи фарбуються в темно-червоний, а цитоплазма клітин - у рожевий колір.Практична робота
1.Виготовити мазок із суміші грампозитивних і грамнегативних бактерій (стафілококів і кишкових паличок) і забарвити за методом Грама.
2.Забарвити мазки з мокротиння хворого на туберкульоз за методом Ціля-Нільсена.
3.Готовий препарат з бактеріями, що мають волютинові зерна, забарвити за методами Нейссера і Леффлера.
4.Демонстрація мікроорганізмів, що утворюють спори і капсули.
Питання для самоконтролю
1.Сучасна класифікація й номенклатура бактерій.
2.Які суттєві ознаки еукаріотів і прокаріотів?
3.Поділ кулястих і паличкоподібних бактерій за їх розташуванням у препаратах-мазках.
4.Патогенні для людини звивисті форми. Які захворювання вони викликають?
5.Структура оболонки грампозитивних і грамнегативних клітин, їх нуклеоїду, цитоплазми та її включень. Методи виявлення структур бактеріальної клітини.
6.Що таке протопласти, сферопласти, L-форми бактерій?
7.Капсули, спори, джгутики, спори бактерій, їх будова та методи виявлення.
8.Особливості будови актиноміцетів, спірохет, рикетсій, хламідій, мікоплазм, найпростіших та грибів. Захворювання, які вони викликають у людини.Ситуаційні задачі
1. Після чотирьох етапів забарвлення за методом Грама в модифікації Синьова препарата з мікроорганізмів у мазку не видно ніяких бактерій. Як вони забарвляться за Грамом після п’ятого етапу?
2. При забарвленні за методом Ціля-Нільсена під мікроскопом видно синього кольору мікроорганізми. Як оцінити їх кислотостійкість?
3. Виберіть, які бактерії утворюють капсулу:
а) пневмококи;
б) гонококи;
в) збудники сибірки;
г) кишкова паличка;
д) сальмонели.
Відповіді
1. Бактерії будуть червоними, тобто грамнегативними.
2. Мікроорганізми кислотонестійкі.
3. А, в.
Медицина